康子茜，王加利，和似琦，崔鑫銘，石冰潔，王建勛

北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京102488

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種克隆漿細(xì)胞異常增多的惡性疾?。?］。近年來，MM患者面臨的治療選擇越來越多樣化，找到一種快速準(zhǔn)確地監(jiān)控治療效果的方法非常重要。目前，MM 患者的荷瘤狀態(tài)是通過監(jiān)測單克隆蛋白（M蛋白）和血清游離輕鏈水平來評估的，這兩項(xiàng)指標(biāo)都衡量了惡性漿細(xì)胞克隆產(chǎn)生的全部或部分抗體。然而M 蛋白的變化水平緩慢，免疫球蛋白在體內(nèi)的半衰期很長，這就意味著檢測疾病狀態(tài)變化需要很長時間；M蛋白與血清游離輕鏈這兩項(xiàng)指標(biāo)在患者腎功能衰竭時則不能準(zhǔn)確評估，而腎功能衰竭是MM 患者的常見并發(fā)癥，這就限制了很多患者的應(yīng)用。這些患者只能選擇更具侵入性和更昂貴的程序進(jìn)行監(jiān)測，例如PET-CT檢查，然而這項(xiàng)檢查并不能經(jīng)常進(jìn)行。這些項(xiàng)目的限制性產(chǎn)生了對監(jiān)測MM 患者狀態(tài)的新的血清標(biāo)志物的需求［2-3］。B 細(xì)胞成熟抗原（B cell maturation antigen，BCMA）是腫瘤壞死因子受體超家族的成員，可通過B 細(xì)胞激活因子（B cell-activating factor，BAFF）和增殖誘導(dǎo)配體（a proliferation-inducing ligand，APRIL）的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)漿細(xì)胞的存活和增殖［4］。BCMA 在惡性漿細(xì)胞上的選擇性高表達(dá)使其成為治療MM 的理想靶抗原。研究［5］發(fā)現(xiàn)，血清BCMA 水平是監(jiān)測MM 患者病情和總生存期的一個新 的 生 物 標(biāo) 志 物。2020 年12 月10 日—2022 年1 月1 日，我們構(gòu)建了一種基于噬菌體展示單鏈抗體的實(shí)時熒光定量免疫PCR（phage display real time-immuno polymerase chain reaction，PDRT-IPCR）檢 測BCMA的新方法，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器 BCMA 抗原標(biāo)準(zhǔn)品購自美國ACRO Biosystems 公司，M13KO7 輔助噬菌體購自成都仁域生物技術(shù)有限公司，抗BCMA 抗體基因片段ANTI-BCMA、抗CD19 抗體基因片段ANTI-CD19 由本實(shí)驗(yàn)室合成保存；E. coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自TIANGEN 生化科技（北京）有限公司，Pyrobest DNA Polymerase 購自TaKaRa 公司，DL 2000 DNA Marker、ELISA 包被液、5%BSA 封閉液購自北京索萊寶科技有限公司，高吸附酶標(biāo)板購自美國康寧公司，SYBR熒光定量PCR試劑盒、Easy Geno快速重組克隆試劑盒、PEG 8000、NaCl、PBS、Tween-20 均購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司。HQL150B 大幅度恒溫?fù)u床購自上海智城分析儀器制造有限公司，CFX96 real time PCR 儀、T100TM型PCR 儀、ChemiDocTMMP Imaging System 購自美國Bio-Rad 公司，超微量分光光度儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司，DYY-6C 電泳儀購自北京六一生物科技有限公司。引物合成及測序由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 的制備及展示抗BCMA單鏈抗體鑒定

1.2.1 重組噬菌體質(zhì)粒M13KO7-ANTI-BCMA 的構(gòu)建 M13KO7 噬菌體載體缺少合適的酶切位點(diǎn)，故采用無縫克隆的形式將抗體片段與載體進(jìn)行連接。由于完整的載體片段較大，所以將載體預(yù)先擴(kuò)增為兩部分，再同抗體片段連接入噬菌體載體。根據(jù)M13KO7 的編碼序列，設(shè)計2 對引物，分別擴(kuò)增M13KO7-1 和M13KO7-2 兩個片段。擴(kuò)增M13KO7-1編 碼 序 列 的 引 物：M13KO7-1-F 為5′-GCGGCCGCAGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3′，M13KO7-1-R 為5′-CTTCCCTGTTAAGTATCTTCCTGGCATCTTCCAGGAAATC-3′。擴(kuò)增M13KO7-2 編碼序列的引物：M13KO7-2-F 為5′-GGAAGATACTTAACAGGGAAGTGAGAGGGCCGCGGCAAAGC-3′，M13KO7-2-R 為5′-TTCAGCGGAGTGAGAATAGAAAGGAACAACTAAAGGAATT-3′。采用PCR 法擴(kuò)增載體片段，取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測片段后，進(jìn)行凝膠電泳分離并切膠回收。根據(jù)抗體ANTI-BCMA 片段與M13KO7 載體序列設(shè)計引物，ANTI-BCMA-F 為5′-CTATTCTCACTCCGCTGAAGATATCGTGCTGACACAAAGC-3′，ANTI-BCMA-R 為5′-GAGATGAGTTTTTGTTCTGCGGCCGCAGCAGCGGCGCTAGAAAC-3′。PCR擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳檢測片段大小，然后凝膠電泳分離并切膠回收抗BCMA單鏈抗體片段ANTI-BCMA。將M13KO7的載體片段與ANTI-BCMA片段進(jìn)行無縫克隆重組，獲得重組噬菌體質(zhì)粒M13KO7-ANTI-BCMA。將重組噬菌體質(zhì)粒M13KO7-ANTI-BCMA轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆并測序，將測序正確克隆的菌液加甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2.2 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 的制備取-80 ℃冰箱凍存的測序正確的含有重組噬菌體質(zhì)粒M13KO7-ANTI-BCMA 的菌液緩慢融化，接種環(huán)蘸取菌液劃線于卡那霉素抗性的LB 平板，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取單克隆接種于10 mL 的卡那霉素抗性的2×YT液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)液在4 ℃條件下3 500 r/min離心15 min以沉淀菌體，取上清液，加入總體積1/5 體積的PEG/NaCl溶液混勻，冰上靜置1.5 h，4 ℃條件下10 000 g 離心30 min，即獲得重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA，棄上清液后，用1 mL PBS重懸。

1.2.3 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 展示抗BCMA 單鏈抗體的鑒定 采用Western Blotting 法。將重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 熱變性后進(jìn)行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，取出硝酸纖維素膜用TBST 漂洗后，加入含5%脫脂奶粉的TBST 封閉1 h，棄去封閉液，加入TBST洗滌2次，棄去TBST，加入用5%脫脂奶粉1∶2 000稀釋的抗噬菌體PⅢ蛋白一抗，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次后加入羊抗鼠IgG-HRP 二抗，室溫孵育1 h，棄去二抗，TBST 洗膜3次，顯影液的A 液和B 液按照1∶1的比例混勻滴加于膜上，避光孵育2 min 顯影，使用BIO RAD ChemiDocTMMP Imaging System 凝膠成像系統(tǒng)曝光，觀察抗BCMA 單鏈抗體-PⅢ重組蛋白的分子量。M13KO7 噬菌體通過PⅢ蛋白與抗BCMA 單鏈抗體連接，其中M13KO7 噬菌體PⅢ蛋白分子量約為42.5 kD，抗BCMA 單鏈抗體蛋白分子量約為31 kD，若抗BCMA 單鏈抗體蛋白成功連接到M13KO7 噬菌體PⅢ蛋白上，則抗BCMA單鏈抗體-PⅢ重組蛋白分子量約為73.5 kD。

1.3 PDRT-IPCR檢測BCMA的線性范圍、最低檢測限測算 取BCMA標(biāo)準(zhǔn)品用包被液稀釋（1 000 ng/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、0.1 ng/mL、0.01ng/mL、0 ng/mL）后，以每孔100 μL 包被96 孔高吸附酶標(biāo)板，4 ℃孵育過夜。PBST（含0.05%Tween-20 的PBS，pH 7.4）洗板5 次，5% BSA 封閉，37 ℃孵育1.5 h，PBST 洗板5 次。每孔加入100 μL的1×1011copies/mL 的重組噬菌體M13KO7-ANTIBCMA，以不加噬菌體的孔為陰性對照孔，陰性對照孔添加1 000 ng/mL 的BCMA 包被。37 ℃孵育1 h，PBST 洗板5 次，每孔加入100μL 無酶水，95 ℃水浴10 min，將與BCMA 特異性結(jié)合的噬菌體熱裂解，以裂解噬菌體的DNA 作為擴(kuò)增模板，進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。根據(jù)M13KO7 噬菌體的PⅢ蛋白基因序列設(shè)計通用引物，引物序列如下：PⅢ蛋白-F 為5′-CGTGCTGACACAAAGCCCTC-3′，PⅢ蛋白-R 為5′-ATCAGCAGAGTAGGAGGTTG-3′。PCR 反 應(yīng) 體 系如下：2×Mix 10 μL，PⅢ蛋白-F（10 μmol/L）1 μL，PⅢ蛋白-R（10 μmol/L）1 μL，M13KO7-ANTI-BCMA噬菌體2 μL，ddH2O 6 μL，反應(yīng)體系共計20 μL。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃，2 min；變性95 ℃，15 s；退火57 ℃，30 s，39個循環(huán)；循壞后添加溶解曲線。觀察不同濃度BCMA 的實(shí)時熒光定量PCR 擴(kuò)增曲線，比較最低濃度BCMA 與0 ng/mL BCMA 之間的CT 值差異，確定大致線性范圍。同時以不加M13KO7-ANTI-BCMA 噬菌體孔作為陰性對照，判斷整個實(shí)驗(yàn)操作是否存在污染情況。以BCMA標(biāo)準(zhǔn)品坐濃度為橫標(biāo)，CT 值為縱坐標(biāo)，運(yùn)用OriginPro2021軟件進(jìn)行四參數(shù)Logistic擬合曲線，根據(jù)相關(guān)系數(shù)R2確定相關(guān)性最強(qiáng)的濃度范圍為該方法檢測的線性范圍。根據(jù)文獻(xiàn)［6］檢測限計算方法，以如下公式計算本方法的最低檢測限：LoD（Limit of Detection）=LoB+ 1.645（SDlowconcentrationsample），LoB（Limit of Blank）=meanblank+1.645（SDblank）。

1.4 PDRT-IPCR方法檢測BCMA的特異性驗(yàn)證為驗(yàn)證基于PDRT-IPCR 方法檢測BCMA 的特異性，我們同時構(gòu)建并制備了展示抗CD19 單鏈抗體的重組噬菌體M13KO7-ANTI-CD19。將展示重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA、重組噬菌體M13KO7-ANTICD19和噬菌體M13KO7各100μL，分別投放入包被100 ng/mL BCMA 的酶標(biāo)板孔和空白孔中，分別記為BCMA 孔、空白孔，37 ℃孵育1 h，PBST 洗板5 次。每孔加入100μL無酶水，95 ℃水浴10 min熱裂解已結(jié)合的噬菌體，以其DNA 作為擴(kuò)增模板，根據(jù)M13KO7噬菌體PⅢ蛋白基因設(shè)計引物，進(jìn)行PDRTIPCR 反應(yīng)。以M13KO7-ANTI-BCMA 噬菌體的已知濃度質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品，以質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)、CT 值為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算噬菌體與BCMA 結(jié)合的實(shí)際拷貝數(shù)，比較3 種噬菌體的BCMA 孔及空白孔結(jié)合拷貝數(shù)，判斷每種噬菌體是否與BCMA具有特異性結(jié)合。

2 結(jié)果

2.1 重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 展示抗BCMA 單鏈抗體的鑒定結(jié)果 在75 kD 處有清晰的蛋白條帶，表明M13KO7 重組噬菌體PⅢ蛋白上已成功連接了抗BCMA 單鏈抗體，抗BCMA 單鏈抗體成功展示在重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA表面。

2.2 PDRT-IPCR檢測BCMA的線性范圍、最低檢測限 PDRT-IPCR 檢測BCMA 的擴(kuò)增曲線見圖1。由圖1 可見，隨著BCMA 包被濃度的降低，對應(yīng)擴(kuò)增曲線的CT值逐漸變大，當(dāng)BCMA濃度降至0.01 ng/mL時，其CT值與0.1 ng/mL的擴(kuò)增CT值已經(jīng)非常接近，已經(jīng)不具備良好的線性相關(guān)性。PDRT-IPCR 檢測BCMA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。由圖2 可見，PDRT-IPCR檢測BCMA的線性范圍為0.1 ng/mL～1 000 ng/mL，R2為0.999 3，最低檢測限為0.077 ng/mL。

圖1 PDRT-IPCR檢測BCMA的擴(kuò)增曲線

圖2 PDRT-IPCR檢測BCMA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 PDRT-IPCR 方法檢測BCMA 的特異性驗(yàn)證結(jié)果 噬菌體M13KO7 與空白孔、BCMA 孔結(jié)合的拷貝數(shù)分別為1.91×105copies、1.44×105copies，兩者相比，P＞0.05。重組噬菌體M13KO7-ANTI-CD19 與空白孔、BCMA 孔結(jié)合的拷貝數(shù)分別為3.07×105copies、1.04×105copies，兩者相比，P＞0.05。重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA 與空白孔、BCMA 孔結(jié)合的拷貝數(shù)分別為1.02×105copies、4.34×106copies，兩者相比，P＜0.01，提示重組噬菌體M13KO7-ANTIBCMA與BCMA具有特異性結(jié)合。

3 討論

目前，用于檢測腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物的方法有放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法、納米圓弧免疫傳感器、液體活組織檢查、分子生物學(xué)方法等［7-13］。將酶聯(lián)免疫吸附測定法與PCR 技術(shù)進(jìn)行結(jié)合的免疫PCR 技術(shù)結(jié)合了兩種方法的優(yōu)勢，然而也存在DNA 與抗體偶聯(lián)繁瑣耗時的缺點(diǎn)，進(jìn)而出現(xiàn)了噬菌體展示介導(dǎo)的免疫PCR 技術(shù)。噬菌體展示技術(shù)由George P. Smith 于1985 年首次創(chuàng)建［14］，該技術(shù)將一段外源基因插入絲狀噬菌體的外殼蛋白基因中，使外源基因以融合蛋白的方式展示在噬菌體表面，進(jìn)而通過表型篩選就能同時獲得其編碼基因［15］。噬菌體因其納米尺寸和對其結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行遺傳修飾的簡便性，使其在各種領(lǐng)域都發(fā)揮著巨大應(yīng)用價值，近年來隨著各種新興技術(shù)的出現(xiàn)，噬菌體展示技術(shù)與納米金顆粒［16］、高通量測序［17］、磁流體［18］等新技術(shù)結(jié)合應(yīng)用，更是對微量物質(zhì)的檢測方法提供了新思路。通過對基因組進(jìn)行編輯，在噬菌體的表面幾乎可以表達(dá)任何蛋白質(zhì)或多肽［19］。此外，噬菌體相對較短的復(fù)制時間使大量生產(chǎn)成為可能［20］。噬菌體展示的檢測抗體不需要化學(xué)偶聯(lián)或生物素化，易于制備，在PBS 中加入15%甘油即可冷藏數(shù)月，具有較好的實(shí)用穩(wěn)定性［21］。本研究構(gòu)建的檢測BCMA的PDRT-IPCR方法將抗原抗體反應(yīng)的特異性與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的靈敏性結(jié)合起來，噬菌體既作為檢測抗體，其攜帶的DNA 又可作為PCR 中的擴(kuò)增模板，PCR 指數(shù)級的信號擴(kuò)增使得此方法的靈敏度和線性范圍得到了明顯改善［22］。

本研究首先運(yùn)用無縫克隆技術(shù)將抗體基因連接入噬菌體載體中，成功構(gòu)建了M13KO7-ANTI-BCMA重組質(zhì)粒。無縫克隆技術(shù)簡單靈活，連接陽性率高，且連接時間較酶切連接大大減少。陽性質(zhì)粒測序正確后保存于大腸桿菌中，質(zhì)粒在大腸桿菌胞內(nèi)組裝合成噬菌體。M13KO7 噬菌體作為一種溫和噬菌體，并不會像烈性噬菌體一般將宿主菌裂解，而是會將胞內(nèi)已合成的噬菌體分泌到胞外，培養(yǎng)過夜通過PEG/NaCl 溶液低溫沉降，即可收集到噬菌體顆粒。為了確保單鏈抗體成功連接到噬菌體尾部的PⅢ蛋白上，我們做了Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測抗BCMA單鏈抗體與噬菌體PⅢ蛋白的融合蛋白的分子量大小，符合預(yù)期，至此已成功構(gòu)建并制備出來展示抗BCMA單鏈抗體的重組噬菌體M13KO7-ANTI-BCMA。為了將該重組噬菌體應(yīng)用于檢測BCMA 的實(shí)時熒光定量免疫PCR 的方法，我們對BCMA 的包被濃度進(jìn)行了摸索，在低于0.1 ng/mL 設(shè)置了0.01 ng/mL BCMA，但是更低濃度的BCMA 與CT 值已不再具備線性關(guān)系，最終選取了線性相關(guān)系數(shù)最強(qiáng)的0.1 ng/mL～1 000 ng/mL濃度區(qū)間作為檢測的線性范圍。

為了驗(yàn)證本方法檢測BCMA 的特異性，將三種噬 菌 體 M13KO7-ANTI-BCMA、M13KO7-ANTICD19、M13KO7 分別與包被100 ng/mL BCMA 孔及空白孔進(jìn)行結(jié)合并進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR 檢測CT值，同時以提取的已知濃度的M13KO7-ANTI-BCMA 質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋并做實(shí)時熒光定量PCR，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算三種噬菌體與每孔的結(jié)合拷貝數(shù)，分析拷貝數(shù)可知，M13KO7-ANTI-BCMA 噬菌體的BCMA 孔結(jié)合拷貝數(shù)遠(yuǎn)大于空白孔，另外兩種噬菌體的BCMA 孔結(jié)合拷貝數(shù)略小于空白孔，可見M13KO7-ANTI-BCMA噬菌體與BCMA 的結(jié)合是特異性的，另外兩種噬菌體與BCMA 無特異性結(jié)合；另外兩種噬菌體的BCMA 孔結(jié)合拷貝數(shù)反而小于空白孔，推測是由于BCMA 的包被阻止了兩種噬菌體與板孔的非特異性結(jié)合。

綜上所述，本研究建立了基于PDRT-IPCR 檢測BCMA 的方法，該檢測方法具有檢測限靈敏、線性范圍寬、重復(fù)性高、選擇性好、準(zhǔn)確度高、實(shí)用性強(qiáng)等特點(diǎn)，它可用于臨床診斷中對BCMA的敏感檢測，在腫瘤患者的早期階段微量生物標(biāo)志物的檢測、中晚期治療效果的評定、疾病狀態(tài)的變化預(yù)后等方面都有巨大價值，也為臨床檢測BCMA 試劑盒的開發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。