張小慧 王世凱 毛獻(xiàn)寶 李政達(dá) 韋娉嬪 陳良師 薛林濤

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心，南寧市 530021)

近年來(lái)隨著人類(lèi)輔助生殖技術(shù)成功率的提高，多胎妊娠導(dǎo)致的孕產(chǎn)期并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)成為新的關(guān)注點(diǎn)，單胎足月活產(chǎn)已逐漸成為評(píng)價(jià)治療效果的關(guān)鍵指標(biāo)，而單胚胎移植是獲得單胎足月活產(chǎn)的最有效途徑。囊胚移植由于具有胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜同步性更好、囊胚種植潛力更高等優(yōu)點(diǎn)，是目前單胚胎移植周期中的首選治療方案[1]。同時(shí)，解凍囊胚移植不僅可以降低卵巢過(guò)度刺激綜合征的發(fā)生率，還可以改善子宮內(nèi)膜薄的患者的臨床結(jié)局，以及減少新鮮囊胚移植導(dǎo)致的低出生體重和先天畸形的發(fā)生[2-5]。因此，解凍單囊胚移植已成為輔助生殖技術(shù)治療的一種重要手段。

減輕玻璃化凍融過(guò)程對(duì)囊胚發(fā)育的潛在損傷，是改善解凍單囊胚移植臨床結(jié)局的重要途徑。擴(kuò)張的囊胚腔內(nèi)存在大量液體，玻璃化凍融過(guò)程中存在冷凍保護(hù)劑不能充分與水分子置換的風(fēng)險(xiǎn)，容易形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。而在囊胚冷凍前進(jìn)行激光打孔以釋放囊胚腔內(nèi)液體，可以有效地提高囊胚玻璃化凍融后的復(fù)蘇效率[6]，但是激光人工皺縮的臨床應(yīng)用價(jià)值還有待進(jìn)一步探討。因此，本研究基于單囊胚移植周期，分析激光人工皺縮對(duì)玻璃化凍融周期臨床妊娠結(jié)局的影響，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧性分析2013年1月至2019年1月在廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)與遺傳中心接受單囊胚玻璃化凍融周期治療的296例患者(296個(gè)周期)的臨床資料。根據(jù)囊胚玻璃化冷凍前是否進(jìn)行激光人工皺縮，將患者分為人工皺縮組和非人工皺縮組，分別為158例(158個(gè)周期)、138例(138個(gè)周期)。所有參與本研究的患者均充分知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 超促排卵方案與胚胎評(píng)估：根據(jù)患者基本情況選擇超促排卵方案，包括長(zhǎng)方案、拮抗劑方案、微刺激方案、自然周期方案、黃體期超促排卵和孕激素期促排卵方案。當(dāng)有兩個(gè)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG；麗珠醫(yī)藥)10 000 IU,34～36 h后在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。根據(jù)精子情況行常規(guī)體外受精或卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射授精，觀察受精和胚胎培養(yǎng)情況。經(jīng)患者知情同意后將受精后第3天剩余的胚胎行囊胚培養(yǎng)。受精后第5天及第6天觀察胚胎并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)級(jí)[7]。囊胚移植或者冷凍保存的標(biāo)準(zhǔn)：囊胚腔分期為3期以上的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞評(píng)級(jí)至少有1個(gè)≥C級(jí)。在解凍復(fù)蘇周期，根據(jù)患者情況選擇自然、人工或促排卵周期方案行子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備。

1.2.2 激光人工皺縮：采用OCTAX激光破膜儀(德國(guó)MTG公司)對(duì)人工皺縮組的擴(kuò)張囊胚(Gander評(píng)分[7]為3期及3期以上為擴(kuò)張囊胚)進(jìn)行激光人工皺縮，在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的滋養(yǎng)層稀疏處，使用3.5 ms的單次脈沖激光打孔，囊胚腔液迅速流出，囊胚腔皺縮，至囊胚腔完全收縮后，行囊胚玻璃化冷凍。非人工皺縮組囊胚不進(jìn)行激光人工皺縮，直接玻璃化冷凍。

1.2.3 囊胚玻璃化冷凍及復(fù)蘇：使用囊胚冷凍/復(fù)蘇試劑盒(COOK公司)對(duì)囊胚進(jìn)行玻璃化冷凍和復(fù)蘇。(1)玻璃化冷凍步驟。將囊胚放入V1液平衡5 min，轉(zhuǎn)移至V2液2 min，最后轉(zhuǎn)移至V3液，30～60 s內(nèi)將囊胚裝載到標(biāo)記好患者信息的高效安全封閉式載桿(Cryo Bio System公司)，迅速套外管加熱封口，放入液氮冷凍保存。(2)復(fù)蘇步驟。將裝載有囊胚的高效安全封閉式載桿迅速?gòu)囊旱〕?，放入W1液，囊胚脫落后轉(zhuǎn)移至新的W1液中平衡5 min，依次將囊胚在W2液和W3液中各平衡5 min。最后將囊胚轉(zhuǎn)移至預(yù)先平衡好的G-2TM培養(yǎng)皿(瑞典Vitrolife公司)中，置于37 ℃、6% CO2、5% O2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 h，觀察囊胚是否復(fù)蘇成功。囊胚重新擴(kuò)張到正常內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)外胚層形態(tài)，則視為存活并移植。復(fù)蘇成活囊胚數(shù)/解凍囊胚數(shù)為復(fù)蘇率。

1.2.4 觀察指標(biāo)：復(fù)蘇囊胚移植14 d后，檢測(cè)血hCG，陽(yáng)性為生化妊娠。復(fù)蘇囊胚移植35 d后B超檢查見(jiàn)到宮內(nèi)孕囊為臨床妊娠，胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%(單囊胚移植孕囊數(shù)僅計(jì)為1)。孕12周內(nèi)妊娠丟失為早期流產(chǎn)，孕周≥28周分娩存活嬰兒為活產(chǎn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示， 組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組基本情況的比較 兩組女方年齡、子宮內(nèi)膜厚度差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，組間具有可比性；人工皺縮組囊胚復(fù)蘇率高于非人工皺縮組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組基本情況的比較

2.2 兩組妊娠結(jié)局的比較 人工皺縮組的臨床妊娠率、胚胎種植率和活產(chǎn)率均高于非人工皺縮組(均P<0.05)。兩組生化妊娠率、早期流產(chǎn)率和單卵雙胎率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組妊娠結(jié)局的比較[%(n/N)]

3 討 論

隨著輔助生殖技術(shù)的發(fā)展，妊娠率逐漸提高，同時(shí)多胎妊娠導(dǎo)致的妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病、低出生體重和早產(chǎn)等并發(fā)癥越來(lái)越受到關(guān)注[8-9]。預(yù)防多胎妊娠的最佳方法是單胚胎移植，而單囊胚移植是較好的選擇[10]。囊胚體外培養(yǎng)可以篩選具有更好發(fā)育潛能的胚胎，囊胚移植時(shí)子宮內(nèi)膜和胚胎發(fā)育的同步性更好，從而提高胚胎種植率，改善新生兒的臨床結(jié)局[11]。解凍囊胚移植周期的子宮內(nèi)膜容受性及胚胎與內(nèi)膜的發(fā)育同步性比新鮮囊胚移植周期更好，胚胎種植率和臨床妊娠率更高，早產(chǎn)率更低[12]。此外，解凍單囊胚移植周期的臨床妊娠率和活產(chǎn)率顯著高于單卵裂移植，且與雙胚胎移植無(wú)顯著差異，同時(shí)其可以顯著降低多胎妊娠率和早產(chǎn)率[13]。因此，解凍單囊胚移植在輔助生殖領(lǐng)域中得到廣泛認(rèn)可。然而，擴(kuò)張囊胚的腔液可能會(huì)影響囊胚的冷凍復(fù)蘇效果；玻璃化冷凍前進(jìn)行激光人工皺縮可以釋放囊胚腔液，減少冷凍損傷，降低細(xì)胞毒性[6]。因此，本研究探討了激光人工皺縮在單囊胚玻璃化凍融中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

玻璃化冷凍是一種成功的囊胚保存方法，影響冷凍囊胚保存成功的重要因素之一是胚胎復(fù)蘇率。擴(kuò)張囊胚腔中含有大量的液體，影響囊胚冷凍過(guò)程中的脫水速度，延長(zhǎng)囊胚在玻璃化冷凍液中的暴露時(shí)間，從而增加冰晶形成的風(fēng)險(xiǎn)。玻璃化冷凍前對(duì)擴(kuò)張囊胚行激光人工皺縮，釋放囊胚腔液，促進(jìn)冷凍和解凍過(guò)程中保護(hù)劑的滲透，減少冰晶的形成，可降低冷凍保護(hù)劑的細(xì)胞毒性作用，減少滲透壓和冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷，從而提高囊胚解凍后的擴(kuò)張率，降低囊胚的凋亡率[14]。有研究顯示，與機(jī)械人工皺縮的囊胚相比，激光人工皺縮的囊胚復(fù)蘇后形態(tài)學(xué)評(píng)分更高，且移植后的臨床妊娠結(jié)局更好[15]。本研究采用激光對(duì)單囊胚行人工皺縮，玻璃化凍融后人工皺縮組的囊胚復(fù)蘇率為99.37%，高于非人工皺縮組的囊胚復(fù)蘇率(97.87%)。說(shuō)明在單囊胚玻璃化冷凍前進(jìn)行激光人工皺縮，減少囊胚腔液，可以減輕冷凍/解凍對(duì)囊胚的損傷，有利于囊胚復(fù)蘇。但兩組的囊胚復(fù)蘇率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與本研究樣本量小有關(guān)。

有文獻(xiàn)報(bào)告，激光人工皺縮能顯著提高解凍后的囊胚存活率和臨床妊娠率[16]。這是因?yàn)?，囊胚腔液釋放后，不同大小的新鮮囊胚皺縮，呈均一的桑椹胚狀，解凍后它們充滿液體的速度明顯加快，重新擴(kuò)張的平均時(shí)間縮短[17]。而解凍后囊胚再擴(kuò)張的程度是活產(chǎn)率的最佳預(yù)測(cè)因子[10]。但是，目前激光人工皺縮對(duì)單囊胚解凍移植臨床結(jié)局的影響如何，相關(guān)研究較少。本研究結(jié)果顯示，人工皺縮組的臨床妊娠率、胚胎種植率和活產(chǎn)率均高于非人工皺縮組(均P<0.05)，但兩組的生化妊娠率、早期流產(chǎn)率和單卵雙胎率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。這說(shuō)明，在玻璃化冷凍前對(duì)單囊胚進(jìn)行激光人工皺縮以釋放囊胚腔液，可以減輕胚胎凍融損傷，提高胚胎發(fā)育潛能，從而在不增加多胎妊娠率和早期流產(chǎn)率的基礎(chǔ)上，有效地提高單囊胚的種植率和活產(chǎn)率。

綜上所述，在囊胚玻璃化冷凍前進(jìn)行激光人工皺縮，可提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率，且不增加多胎妊娠率和早期流產(chǎn)率，在單囊胚玻璃化凍融周期中具有臨床推廣的價(jià)值。