侯甲福，劉世娟，耿艷萌，楊琦，胡澤香，謝舒，張穎*

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

雖然近十年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量具有多種治療潛力的新藥分子，但其中大多數(shù)仍處于研發(fā)過程中。主要是因為這類化合物的水溶性較差，從而限制了藥物的生物利用度。達(dá)沙替尼(DST) 就屬于這類化合物。在不影響治療效果的情況下，開發(fā)DST 的制劑必須克服這些問題。DST 在水中溶解很差，在水中最大溶解度約為10 μg/mL[1]，過低的水溶性導(dǎo)致生物利用度差并且不穩(wěn)定[2]，DST 的口服生物利用度僅為14%～34%[3]。藥物溶解性差，使得對潛在藥物效應(yīng)的產(chǎn)品進(jìn)行高通量篩選非常困難。因此，迫切需要改善DST 的溶解性，從而提高生物利用度?？朔y溶性藥物的溶解度問題有很多種方法，包括增溶、形成包合物或絡(luò)合等方法，其中目前最先進(jìn)的技術(shù)是納米制劑技術(shù)。

由于納米藥物制劑有獨特的優(yōu)勢，納米制劑技術(shù)在世界各地蓬勃發(fā)展，各大藥品生產(chǎn)公司生產(chǎn)的納米制劑產(chǎn)品在不斷增長，開發(fā)了大量生物相容性納米系統(tǒng)，如納米顆粒、納米膠囊、膠束系統(tǒng)和偶聯(lián)物。根據(jù)Noyes-Whitney 方程，納米化的優(yōu)點是通過增加難溶性化合物的表面積和濃度差，然后增加了化合物的溶解速率。此外，納米化后飽和溶解度也增加了[4]。這些增強(qiáng)藥物通過腸壁進(jìn)入體循環(huán)，有利于水溶性差的藥物的口服生物利用度。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)作為傳統(tǒng)聚合物納米顆粒的替代藥物傳遞系統(tǒng)，納米顆粒在亞微米尺寸范圍內(nèi)(50～1 000 nm)，由可生理相容的脂質(zhì)成分組成，室溫情況下顆粒處于固態(tài)，結(jié)合了聚合物納米顆粒、脂肪乳劑和脂質(zhì)體的優(yōu)點。

本研究采用NLC 解決難溶性藥物的吸收，并提高生物利用度。而且NLC 可以通過高壓均質(zhì)化技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。NLC 像乳劑和脂質(zhì)體一樣具有高度的生物相容性，同時固體基質(zhì)產(chǎn)生緩釋，可以在非腸道給藥后有效地靶向特定組織，并可以改善難溶性藥物[5-6]口服生物利用度。通過將DST 制備成NLC 來增強(qiáng)溶解度，DST 加載NLC 作為靶向遞送系統(tǒng)，可以產(chǎn)生更高的腫瘤細(xì)胞特異性，同時降低藥物的毒副作用[5]。

1 儀器與試藥

安捷倫LC1260 高效液相色譜儀；JY92-Ⅱ型細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；達(dá)沙替尼(上海MACKLIN 公司)；單硬脂酸甘油酯(GMS，德國BASF 公司)；辛癸酸甘油酯(MCT，法國Gattefosse公司)；吐溫80(Tween-80，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；聚氧乙烯(35)蓖麻油(EL-35，德國BASF 公司)。

2 方法

2.1 DST-NLC 的制備

采用熱熔—超聲乳化法制備DST-NLC，具體操作如下：取處方量的單硬脂酸甘油酯、辛癸酸甘油酯、吐溫80 置于水浴上加熱75 ℃至脂質(zhì)熔融，將DST 加入熔融脂質(zhì)液中，攪拌溶解形成有機(jī)相，75 ℃水浴下，取處方量的聚氧乙烯蓖麻油加入蒸餾水中形成水相。然后，在磁性攪拌下，將水相滴加入油相中形成初乳。5 min 后，將溶液混合物超聲15 min，然后在冰浴中快速冷卻。隨后，樣品以15 000 r/min 離心5 min，然后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，以去除未封裝的藥物。

2.2 含量測定方法

色譜條件：色譜柱Aglient HC-C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；柱溫：35 ℃；檢測波長：322 nm；流動相：乙腈-磷酸二氫鉀水溶液(0.01 mol/L，NaOH 溶液調(diào)至pH=5.0)(40∶60，V/V)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

方法學(xué)考察：

按規(guī)定方法操作，得線性方程y=1 578x-1 263 (r=0.999 9)，在該色譜條件下本品在0.01～0.20 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；穩(wěn)定性：0 h、2 h、4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD=0.56%；精密度實驗RSD=0.18% (n=6)；重復(fù)性實驗RSD=0.21%(n=6)；加樣回收率實驗，高中低濃度平均回收率分別為99.67%、101.37%、99.48%，方法學(xué)考察均符合要求。

載藥量與包封率測定：

精密吸取DST-NLC 樣品混懸液2 mL 置于超速離心管中，12 000 r/min 高速離心40 min，取濾液，進(jìn)HPLC 測定游離達(dá)沙替尼的量(C)。另取DST-NLC 混懸液2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL 的容量瓶中，再加入30 mL乙腈超聲8 min，用流動相定容至刻度，高效液相色譜法測定藥物總含量(C0)。按下式計算DST-NLC 的載藥量與包封率。

式(1)～(2) 中：C 為溶液中游離達(dá)沙替尼的量；C0為溶液中總達(dá)沙替尼的量；C總為脂質(zhì)載體和總達(dá)沙替尼的量。

2.3 處方優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)之上并結(jié)合預(yù)實驗，以包封率為評價指標(biāo)，以對DST-NLC 包封率影響較大的因素，固/ 液脂質(zhì)比(A，單硬脂酸甘油酯/ 新癸酸甘油酯)、乳化劑用量(B)、藥/ 脂比(C)、超聲時間(D) 為考察因素，進(jìn)行4 因素3 水平L9(34) 正交試驗，篩選最佳處方，因素水平表如表1 所示。

表1 DST-NLC 處方優(yōu)化因素水平表

2.4 DST-NLC 體外釋放度試驗

采用膜透析法測定DST 混懸液、DST-NLC 的體外釋放特性。分別精密量取DST 混懸液、DST-NLC 混懸液3 mL，移至透析袋(截留相對分子質(zhì)量12 000～14 000)中，兩端扎緊，將此透析袋置于37 ℃透析介質(zhì)(磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4)中，100 r/min。定時取樣5 mL，同時補(bǔ)加相同量的等溫釋放介質(zhì)，樣品用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL 加入適量流動相稀釋，采用高效液相色譜法測定DST 濃度，計算DST 累計釋放度(%)。

3 結(jié)果

3.1 處方優(yōu)化

以DST-NLC 包封率為考察指標(biāo)，處方優(yōu)化正交實驗設(shè)計及結(jié)果如表2 所示。

由表2 可知，根據(jù)R 數(shù)值的大小可知，該試驗中各因素對包封率的影響順序為A＞B＞D＞C，各因素在不同水平的分析結(jié)果為A：2＞3＞1；B：3＞2＞1；C：3＞1＞2；D：2＞3＞1。根據(jù)K1、K2、K3結(jié)果中數(shù)值大小，可知最佳組合為A2B3C3D2，即最優(yōu)處方是，單硬脂酸甘油酯與新癸酸甘油酯比為8∶2，乳化劑用量為6%，藥/脂比為1∶30，超聲時間為4 min。

3.2 體外釋放度試驗

DST-NLC 的體外釋放曲線如圖1 所示。由圖可知，DST-NLC 在0～4 h 釋放藥物較快，能在短時間內(nèi)使藥物濃度升高，0～12 h 的累積釋放量以達(dá)到75% 左右，對比DST 原料藥，DST-NLC 溶出藥量顯著提高。而且，DST-NLC 前期釋放較快，后期釋放緩慢，具有顯著的緩釋特性，無論從釋放速度還是緩釋效果，DST-NLC 均優(yōu)于DST。

表2 DST-NLC 正交實驗結(jié)果

圖1 DST 與DST-NLC 體外釋放藥物曲線

4 結(jié)語

藥物的療效有時因為各種傳遞不暢從而無法發(fā)揮良好藥效，如藥物溶解性差、藥物清除速度快和各種生物屏障，可以應(yīng)用各種現(xiàn)代制劑技術(shù)來提高藥物的溶解度。然而，應(yīng)謹(jǐn)慎避免達(dá)沙替尼的濃度依賴性毒性，通常具有緩釋特性的藥物傳遞系統(tǒng)可以減輕毒性。在這項研究中，達(dá)沙替尼被封裝在NLC 中，NLC是一種以增強(qiáng)溶解度、緩釋和良好的眼部生物相容性而聞名的藥物傳遞系統(tǒng)。本項目采用熔融乳化超聲法制備DST-NLC，在實驗前期摸索中制備的NLC 相當(dāng)不穩(wěn)定的，并在第二天沉淀。該NLC 的不穩(wěn)定性是由于zeta 電位的絕對值較小造成的，由于zeta 勢意味著粒子間的斥力強(qiáng)度，因此zeta 勢的絕對值越高，表明納米顆粒具有更好的抗聚集性和穩(wěn)定性。一般控制在約30 mV 的絕對值時是最為穩(wěn)定的，足以保證NLC 的穩(wěn)定性。吐溫80 是一種良好的表面活性劑，在處方中添加吐溫80 以增加絕對含量提高了NLC的穩(wěn)定性，同時吐溫80 可以極大地提高NLC 的穩(wěn)定性和粒徑。當(dāng)加入20 mg 吐溫80 后，NLC 前兩天未見沉降，第三天只有少量沉降，說明NLC 的穩(wěn)定性有所提高，但是吐溫80 的含量仍然有些不足。因此在處方中繼續(xù)增加吐溫80，產(chǎn)品連續(xù)7 天無沉淀，第7 天的平均粒徑與第1 天無顯著差異[6]。

近年來，NLC 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的潛力逐漸實現(xiàn)，成為一種很有前景的藥物傳遞系統(tǒng)。許多具有治療活性的藥物在本質(zhì)上具有高度的親脂性。這種親脂性活性成分在藥物遞送位點和靶位點的摻入和遞送一直是一個值得關(guān)注的問題。結(jié)果表明，采用熔融乳化超聲法將DST 制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，能有效克服DST 水難溶性的問題。此外，可以推測，如果獲得納米范圍的顆粒，生物利用度可能會增加。因此，NLC 被用作親脂性藥物的藥物載體，通過納米顆粒提高水難溶性的藥物DST 的生物利用度。