侯甲福，劉世娟，耿艷萌，楊琦，胡澤香，謝舒，張穎*

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011)

0 引言

雖然近十年來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量具有多種治療潛力的新藥分子，但其中大多數(shù)仍處于研發(fā)過程中。主要是因?yàn)檫@類化合物的水溶性較差，從而限制了藥物的生物利用度。達(dá)沙替尼(DST) 就屬于這類化合物。在不影響治療效果的情況下，開發(fā)DST 的制劑必須克服這些問題。DST 在水中溶解很差，在水中最大溶解度約為10 μg/mL[1]，過低的水溶性導(dǎo)致生物利用度差并且不穩(wěn)定[2]，DST 的口服生物利用度僅為14%～34%[3]。藥物溶解性差，使得對潛在藥物效應(yīng)的產(chǎn)品進(jìn)行高通量篩選非常困難。因此，迫切需要改善DST 的溶解性，從而提高生物利用度。克服難溶性藥物的溶解度問題有很多種方法，包括增溶、形成包合物或絡(luò)合等方法，其中目前最先進(jìn)的技術(shù)是納米制劑技術(shù)。

由于納米藥物制劑有獨(dú)特的優(yōu)勢，納米制劑技術(shù)在世界各地蓬勃發(fā)展，各大藥品生產(chǎn)公司生產(chǎn)的納米制劑產(chǎn)品在不斷增長，開發(fā)了大量生物相容性納米系統(tǒng)，如納米顆粒、納米膠囊、膠束系統(tǒng)和偶聯(lián)物。根據(jù)Noyes-Whitney 方程，納米化的優(yōu)點(diǎn)是通過增加難溶性化合物的表面積和濃度差，然后增加了化合物的溶解速率。此外，納米化后飽和溶解度也增加了[4]。這些增強(qiáng)藥物通過腸壁進(jìn)入體循環(huán)，有利于水溶性差的藥物的口服生物利用度。

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(NLC)作為傳統(tǒng)聚合物納米顆粒的替代藥物傳遞系統(tǒng)，納米顆粒在亞微米尺寸范圍內(nèi)(50～1 000 nm)，由可生理相容的脂質(zhì)成分組成，室溫情況下顆粒處于固態(tài)，結(jié)合了聚合物納米顆粒、脂肪乳劑和脂質(zhì)體的優(yōu)點(diǎn)。

本研究采用NLC 解決難溶性藥物的吸收，并提高生物利用度。而且NLC 可以通過高壓均質(zhì)化技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。NLC 像乳劑和脂質(zhì)體一樣具有高度的生物相容性，同時固體基質(zhì)產(chǎn)生緩釋，可以在非腸道給藥后有效地靶向特定組織，并可以改善難溶性藥物[5-6]口服生物利用度。通過將DST 制備成NLC 來增強(qiáng)溶解度，DST 加載NLC 作為靶向遞送系統(tǒng)，可以產(chǎn)生更高的腫瘤細(xì)胞特異性，同時降低藥物的毒副作用[5]。

1 儀器與試藥

安捷倫LC1260 高效液相色譜儀；JY92-Ⅱ型細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；達(dá)沙替尼(上海MACKLIN 公司)；單硬脂酸甘油酯(GMS，德國BASF 公司)；辛癸酸甘油酯(MCT，法國Gattefosse公司)；吐溫80(Tween-80，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；聚氧乙烯(35)蓖麻油(EL-35，德國BASF 公司)。

2 方法

2.1 DST-NLC 的制備

采用熱熔—超聲乳化法制備DST-NLC，具體操作如下：取處方量的單硬脂酸甘油酯、辛癸酸甘油酯、吐溫80 置于水浴上加熱75 ℃至脂質(zhì)熔融，將DST 加入熔融脂質(zhì)液中，攪拌溶解形成有機(jī)相，75 ℃水浴下，取處方量的聚氧乙烯蓖麻油加入蒸餾水中形成水相。然后，在磁性攪拌下，將水相滴加入油相中形成初乳。5 min 后，將溶液混合物超聲15 min，然后在冰浴中快速冷卻。隨后，樣品以15 000 r/min 離心5 min，然后用0.22 μm 微孔濾膜過濾，以去除未封裝的藥物。

2.2 含量測定方法

色譜條件：色譜柱Aglient HC-C18(250 mm×4.6 mm， 5 μm)；柱溫：35 ℃；檢測波長：322 nm；流動相：乙腈-磷酸二氫鉀水溶液(0.01 mol/L，NaOH 溶液調(diào)至pH=5.0)(40∶60，V/V)；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

方法學(xué)考察：

按規(guī)定方法操作，得線性方程y=1 578x-1 263 (r=0.999 9)，在該色譜條件下本品在0.01～0.20 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；穩(wěn)定性：0 h、2 h、4 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，RSD=0.56%；精密度實(shí)驗(yàn)RSD=0.18% (n=6)；重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD=0.21%(n=6)；加樣回收率實(shí)驗(yàn)，高中低濃度平均回收率分別為99.67%、101.37%、99.48%，方法學(xué)考察均符合要求。

載藥量與包封率測定：

精密吸取DST-NLC 樣品混懸液2 mL 置于超速離心管中，12 000 r/min 高速離心40 min，取濾液，進(jìn)HPLC 測定游離達(dá)沙替尼的量(C)。另取DST-NLC 混懸液2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL 的容量瓶中，再加入30 mL乙腈超聲8 min，用流動相定容至刻度，高效液相色譜法測定藥物總含量(C0)。按下式計算DST-NLC 的載藥量與包封率。

式(1)～(2) 中：C 為溶液中游離達(dá)沙替尼的量；C0為溶液中總達(dá)沙替尼的量；C總為脂質(zhì)載體和總達(dá)沙替尼的量。

2.3 處方優(yōu)化

在單因素考察的基礎(chǔ)之上并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)，以包封率為評價指標(biāo)，以對DST-NLC 包封率影響較大的因素，固/ 液脂質(zhì)比(A，單硬脂酸甘油酯/ 新癸酸甘油酯)、乳化劑用量(B)、藥/ 脂比(C)、超聲時間(D) 為考察因素，進(jìn)行4 因素3 水平L9(34) 正交試驗(yàn)，篩選最佳處方，因素水平表如表1 所示。

表1 DST-NLC 處方優(yōu)化因素水平表

2.4 DST-NLC 體外釋放度試驗(yàn)

采用膜透析法測定DST 混懸液、DST-NLC 的體外釋放特性。分別精密量取DST 混懸液、DST-NLC 混懸液3 mL，移至透析袋(截留相對分子質(zhì)量12 000～14 000)中，兩端扎緊，將此透析袋置于37 ℃透析介質(zhì)(磷酸鹽緩沖溶液，pH=7.4)中，100 r/min。定時取樣5 mL，同時補(bǔ)加相同量的等溫釋放介質(zhì)，樣品用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液1 mL 加入適量流動相稀釋，采用高效液相色譜法測定DST 濃度，計算DST 累計釋放度(%)。

3 結(jié)果

3.1 處方優(yōu)化

以DST-NLC 包封率為考察指標(biāo)，處方優(yōu)化正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果如表2 所示。

由表2 可知，根據(jù)R 數(shù)值的大小可知，該試驗(yàn)中各因素對包封率的影響順序?yàn)锳＞B＞D＞C，各因素在不同水平的分析結(jié)果為A：2＞3＞1；B：3＞2＞1；C：3＞1＞2；D：2＞3＞1。根據(jù)K1、K2、K3結(jié)果中數(shù)值大小，可知最佳組合為A2B3C3D2，即最優(yōu)處方是，單硬脂酸甘油酯與新癸酸甘油酯比為8∶2，乳化劑用量為6%，藥/脂比為1∶30，超聲時間為4 min。

3.2 體外釋放度試驗(yàn)

DST-NLC 的體外釋放曲線如圖1 所示。由圖可知，DST-NLC 在0～4 h 釋放藥物較快，能在短時間內(nèi)使藥物濃度升高，0～12 h 的累積釋放量以達(dá)到75% 左右，對比DST 原料藥，DST-NLC 溶出藥量顯著提高。而且，DST-NLC 前期釋放較快，后期釋放緩慢，具有顯著的緩釋特性，無論從釋放速度還是緩釋效果，DST-NLC 均優(yōu)于DST。

表2 DST-NLC 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 DST 與DST-NLC 體外釋放藥物曲線

4 結(jié)語

藥物的療效有時因?yàn)楦鞣N傳遞不暢從而無法發(fā)揮良好藥效，如藥物溶解性差、藥物清除速度快和各種生物屏障，可以應(yīng)用各種現(xiàn)代制劑技術(shù)來提高藥物的溶解度。然而，應(yīng)謹(jǐn)慎避免達(dá)沙替尼的濃度依賴性毒性，通常具有緩釋特性的藥物傳遞系統(tǒng)可以減輕毒性。在這項(xiàng)研究中，達(dá)沙替尼被封裝在NLC 中，NLC是一種以增強(qiáng)溶解度、緩釋和良好的眼部生物相容性而聞名的藥物傳遞系統(tǒng)。本項(xiàng)目采用熔融乳化超聲法制備DST-NLC，在實(shí)驗(yàn)前期摸索中制備的NLC 相當(dāng)不穩(wěn)定的，并在第二天沉淀。該NLC 的不穩(wěn)定性是由于zeta 電位的絕對值較小造成的，由于zeta 勢意味著粒子間的斥力強(qiáng)度，因此zeta 勢的絕對值越高，表明納米顆粒具有更好的抗聚集性和穩(wěn)定性。一般控制在約30 mV 的絕對值時是最為穩(wěn)定的，足以保證NLC 的穩(wěn)定性。吐溫80 是一種良好的表面活性劑，在處方中添加吐溫80 以增加絕對含量提高了NLC的穩(wěn)定性，同時吐溫80 可以極大地提高NLC 的穩(wěn)定性和粒徑。當(dāng)加入20 mg 吐溫80 后，NLC 前兩天未見沉降，第三天只有少量沉降，說明NLC 的穩(wěn)定性有所提高，但是吐溫80 的含量仍然有些不足。因此在處方中繼續(xù)增加吐溫80，產(chǎn)品連續(xù)7 天無沉淀，第7 天的平均粒徑與第1 天無顯著差異[6]。

近年來，NLC 納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的潛力逐漸實(shí)現(xiàn)，成為一種很有前景的藥物傳遞系統(tǒng)。許多具有治療活性的藥物在本質(zhì)上具有高度的親脂性。這種親脂性活性成分在藥物遞送位點(diǎn)和靶位點(diǎn)的摻入和遞送一直是一個值得關(guān)注的問題。結(jié)果表明，采用熔融乳化超聲法將DST 制備成納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體，能有效克服DST 水難溶性的問題。此外，可以推測，如果獲得納米范圍的顆粒，生物利用度可能會增加。因此，NLC 被用作親脂性藥物的藥物載體，通過納米顆粒提高水難溶性的藥物DST 的生物利用度。