劉婷婷，高貝貝，宋帥，金超，3，帥宗文，潘夢(mèng)璐，楊春蘭，孫璇君

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科，合肥 230601；3.安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，合肥 230032；4.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，合肥 230022；5.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科，合肥 230031)

羥氯喹(hydroxychloroquine，HCQ) 是4-氨基喹酮類抗瘧藥，也是一種獨(dú)特的抗風(fēng)濕免疫疾病藥物[1]，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、盤(pán)狀紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、復(fù)發(fā)性風(fēng)濕病及干燥綜合征等疾病中具有可靠療效[2]。對(duì)于新型冠狀病毒肺炎 (COVID-19) 患者，氯喹和HCQ亦顯示一定療效[3]。研究顯示，HCQ的療效與其血藥濃度正相關(guān)，血藥濃度高的患者，SLE疾病活動(dòng)指數(shù) (SLE activity index，SLEDAI) 一般較低；相反，血藥濃度低的患者，通常會(huì)表現(xiàn)出高SLEDAI[4]。其次，HCQ血藥濃度可作為疾病發(fā)作的預(yù)測(cè)指標(biāo)，血藥濃度較低提示疾病即將進(jìn)入發(fā)作期，HCQ保持在一定血藥濃度水平可防止疾病復(fù)發(fā)[5]。然而，由于特殊的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程，服用相同劑量HCQ的SLE患者，不同個(gè)體間血藥濃度差異較大[6]。且HCQ半衰期長(zhǎng)，表觀分布容積大，一般需長(zhǎng)期服藥[7]，大劑量長(zhǎng)期應(yīng)用HCQ可引起胃腸道、眼部等不良反應(yīng)，其嚴(yán)重程度亦與血藥濃度具有相關(guān)性[8]。因此，監(jiān)測(cè)患者HCQ血藥濃度，并隨之調(diào)整用法用量，對(duì)控制疾病發(fā)作，提高療效，減少不良反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥十分重要。

1 血漿HCQ濃度監(jiān)測(cè)

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 30AD超高效液相色譜儀購(gòu)于日本島津Shimadzu公司；TRIPLE QUADA-PTM 5500三重四極桿質(zhì)譜儀購(gòu)于美國(guó)AB公司；EYELA MG-2200金屬浴購(gòu)于日本Rikakikai公司；XW-80A漩渦振蕩器購(gòu)于上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；D-37520臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司。

1.1.2試藥 硫酸羥氯喹購(gòu)于上海上藥中西制藥有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H19990263，批號(hào)：C0112021189)，HCQ對(duì)照品購(gòu)于美國(guó)Sigma公司(含量≥95%，批號(hào)：BCBP6432V)，奎寧對(duì)照品(Quinine，QN)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司(含量：98%，批號(hào)：H1623052)，甲醇和乙腈購(gòu)于美國(guó)Tedia公司(色譜級(jí))。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱為Poroshell 120 EC-C18(2.1 mm×100 mm，2.7 μm，Agilent Technologies公司)。流動(dòng)相為0.1%甲酸酸化溶液(A相) 及0.1%甲酸酸化甲醇 (B相)。梯度洗脫條件為0～2 min：75%A/25%B，2.1～4 min：30%A/70%B，4.1～5 min：10%A/90%B，5.1～9.5 min：75%A/25%B，9.5 min：stop。流速為0.25 mL·min-1。進(jìn)樣量為5 μL。柱溫為35 ℃。質(zhì)譜條件為三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀AB Sciex 5500，以正離子模式使用電噴霧離子源，使用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoning，MRM) 模式。離子對(duì)：HCQ(m/z336.4→247.2)、QN (m/z320.2→247.2)。

1.2.2溶液配制 以甲醇-水(50：50，V/V) 溶解精密稱取的HCQ、QN對(duì)照品各10 mg，置于10 mL量瓶中，定容至刻度后搖勻，分別得到1 mg·mL-1的HCQ及QN標(biāo)準(zhǔn)溶液貯備液。以甲醇-水 (50：50，V/V) 為溶劑定量稀釋2種貯備液，依次制成濃度分別為5，50，200，500，1000，2000，4000 ng·mL-1梯度的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液以及濃度為20，250，1000，3000 ng·mL-1質(zhì)控工作液。以甲醇-水 (50：50，V/V) 稀釋內(nèi)標(biāo)QN儲(chǔ)備液，得到500 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.2.3血漿樣本處理 采集患者靜脈血3 mL，給予乙二胺四乙酸抗凝。離心后取血漿樣品100 μL，加入1%甲酸200 μL混合，再加入乙腈1 mL，振蕩渦旋5 min，12000 r·min-1離心10 min(r=8.8 cm)。上清液1 mL于50 ℃氮?dú)獯蹈桑偌尤?00 μL 0.1%甲酸-甲醇 (75：25，V/V) 復(fù)溶，渦旋振蕩，10000 r·min-1離心5 min(r=8.8 cm)，取上清液進(jìn)行UPLC-MS/MS分析。

1.2.4方法學(xué)驗(yàn)證

①專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿加HCQ標(biāo)準(zhǔn)溶液(200 ng·mL-1) 和內(nèi)標(biāo)溶液、服用HCQ 6個(gè)月以上的SLE患者血樣，按“1.2.3”項(xiàng)處理，在“1.2.1”項(xiàng)條件下進(jìn)行色譜分析。結(jié)果如圖1所示，HCQ保留時(shí)間：4.02 min，內(nèi)標(biāo) (QN) 保留時(shí)間：5.09 min，HCQ和內(nèi)標(biāo)QN出峰位置背景干凈，均無(wú)雜峰干擾，峰性良好，靈敏度較高，方法專一性較強(qiáng)。

A.空白血漿；B.空白血漿+HCQ和內(nèi)標(biāo)(QN)對(duì)照品；C.患者血漿樣品；HCQ(m/z 336.4→247.2，tR=4.02 min)、QN(m/z 320.2→247.2，tR=5.09 min)。圖1 血漿HCQ和內(nèi)標(biāo)的提取色譜圖 A. blank plasma；B.blank plasma spiked with standard HCQ and QN；C.patient's plasma sample；HCQ(m/z 336.4→247.2，tR=4.02 min)；QN(m/z 320.2→247.2，tR=5.09 min).Fig.1 Extracted ion chromatograms of HCQ and QN in plasma

②標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量限。分別加入標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液于空白血漿，制備模擬含藥血漿 (HCQ質(zhì)量濃度：5，50，200，500，1000，2000，4000 ng·mL-1)，按1.2.3項(xiàng)處理，1.2.1項(xiàng)條件分析，以HCQ血藥濃度為橫坐標(biāo) (X，ng·mL-1)，HCQ峰面積 (As) / 內(nèi)標(biāo)峰面積 (Ai) 為縱坐標(biāo) (Y)，得HCQ血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=1.19×10-2X+1.93×10-2(r2=0.999 8)。HCQ血藥濃度在5～4000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為5 ng·mL-1。

③精密度和準(zhǔn)確度。在空白血漿中加入質(zhì)控HCQ工作溶液，制備HCQ濃度分別為20，250，1000，3000 ng·mL-1的模擬含藥血漿作為質(zhì)控樣本(n=5)，計(jì)算批內(nèi)精密度；連續(xù)測(cè)定3 d計(jì)算批間精密度，將峰面積比值代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線并對(duì)比理論HCQ濃度，結(jié)果提示HCQ的4個(gè)濃度水平的批內(nèi)、批間精密度相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)均小于10%，該方法精密度良好；準(zhǔn)確度在90%～110%之間，準(zhǔn)確性亦良好(表1)。

表1 血漿HCQ的精密度及準(zhǔn)確度 Tab.1 Precision and accuracy of HCQ in plasma

④回收率。按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法制備含HCQ濃度分別為20，250，1000，3000 ng·mL-1的模擬含藥血漿(n=5)及隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，按1.2.3項(xiàng)下的方法操作。另取空白血漿，按1.2.3項(xiàng)下方法操作至上清經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，分別以含內(nèi)標(biāo)的20，250，1000，3000 ng·mL-1濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶(n=5)。對(duì)上述各濃度兩種處理方法所得的HCQ和內(nèi)標(biāo)峰面積分別作比較，計(jì)算回收率。結(jié)果提示，HCQ的4個(gè)濃度水平及內(nèi)標(biāo)的回收率均在80%以上，符合生物樣本分析要求 (表2)。

表2 血漿中HCQ及內(nèi)標(biāo)物的提取回收率 Tab.2 Extraction recovery of HCQ and QN in plasma %

⑤穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。制備含有HCQ (20，250，1000，3000 ng·mL-1) 4種濃度的含藥血漿各5份，分別進(jìn)行室溫放置7 h、進(jìn)樣器放置8 h、-20 ℃保存3個(gè)月、反復(fù)凍融4次的穩(wěn)定性試驗(yàn)，按“1.2.3”項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，在不同處理?xiàng)l件下，HCQ的穩(wěn)定性均良好。

2 臨床樣本檢測(cè)及分析

2.1研究方法

2.1.1研究對(duì)象 檢測(cè)53例于2020年1月—2021年2月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的SLE患者血樣，患者均給予6個(gè)月以上的HCQ治療，采血時(shí)間為給藥前，血漿HCQ濃度為谷濃度。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì) (American College of Rheumatology，ACR) 1997年修訂的SLE診斷和分類標(biāo)準(zhǔn)[9]；②服用HCQ≥6個(gè)月；③臨床資料及相關(guān)檢查結(jié)果完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①并發(fā)重大基礎(chǔ)疾病，合并其他自身免疫性疾病、慢性疾病、急性感染；②使用HCQ前有嚴(yán)重肝腎功能不全、眼部疾病史以及皮膚病史；③哺乳期或妊娠期；④1年內(nèi)服用過(guò)降血糖藥物及降血脂藥物。

2.2研究結(jié)果

2.2.1患者基本信息及檢測(cè)結(jié)果 53例SLE患者94.34%為女性，平均年齡(39.19±10.98)歲。按DURCAN等[10-12]的研究結(jié)論界定血漿HCQ濃度<10 ng·mL-1為“不依從性”血藥濃度；10～500 ng·mL-1為“亞治療性”血藥濃度；>500 ng·mL-1為“治療性”血藥濃度。采取本文建立的UPLC-MS/MS法檢測(cè)，結(jié)果顯示，本組患者平均血漿谷濃度為(591.10±288.05) ng·mL-1，“亞治療組”(血藥濃度：10～500 ng·mL-1) 和“治療組”(血藥濃度：10～500 ng·mL-1) 的患者分別占比39.62%及60.38%。53例患者的血漿均得到較好分離，質(zhì)控顯示結(jié)果可靠，提示本方法適用于患者HCQ血藥濃度的測(cè)定。

本組患者平均給藥劑量(305.66±77.00) mg·d-1；療程(77.62±56.58)個(gè)月；最低血藥濃度205.99 ng·mL-1；最高血藥濃度1 936.46 ng·mL-1；中位血藥濃度541.82 ng·mL-1。

2.2.2HCQ劑量和濃度的關(guān)系 臨床患者HCQ用藥方式多樣，根據(jù)患者實(shí)際用藥情況，檢測(cè)不同給藥劑量(200，300，400 mg·d-1)治療后血漿HCQ的濃度。結(jié)果顯示，每天給藥400 mg的患者血漿HCQ濃度最高，與200 mg·d-1給藥組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 血漿HCQ濃度與其給藥劑量的關(guān)系 Fig.2 Relationship between plasma concentration of HCQ and its dose

2.2.3血漿HCQ濃度與疾病活動(dòng)度及不良反應(yīng)的相關(guān)性 分析患者數(shù)據(jù)信息，結(jié)果顯示血漿HCQ濃度高的患者SLEDAI較低，疾病緩解組(SLEDAI≤4)患者血漿HCQ濃度高于疾病活動(dòng)組(SLEDAI>4)(P<0.05)(圖3A)。發(fā)生眼部不良反應(yīng)的患者血漿HCQ濃度高于未發(fā)生眼部不良反應(yīng)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，患者發(fā)生其他不良反應(yīng)主要有頭暈、皮膚瘙癢和咳嗽，發(fā)生情況與血漿HCQ濃度相關(guān)性不顯著(圖3B)。

①與SLEDAI=0分組比較，P<0.05；②與SLEDAI=0分組比較，P<0.01。圖3 血漿HCQ濃度與(A)SLEDAI，(B)眼部及其他不良反應(yīng)的相關(guān)性 ①Compared with SLEDAI=0 group，P<0.05；②Compared with SLEDAI=0 group，P<0.01.Fig.3 Relationship of HCQ plasma concentration with SLEDAI (A)，ocular and other adverse reactions (B)

2.2.4不同血漿HCQ濃度患者臨床指標(biāo)比較 按血漿HCQ濃度10～500 ng·mL-1及>500 ng·mL-1，將患者分為亞治療組及治療組，分析患者炎癥、血常規(guī)、肝腎功能、凝血功能、血糖血脂等臨床指標(biāo)，結(jié)果顯示，治療組患者天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)水平較亞治療組低 (P<0.05)，但其血小板計(jì)數(shù)(PLT)高于亞治療組(P<0.01)，其他臨床指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。

圖示：ESR：紅細(xì)胞沉降率、CRP：C反應(yīng)蛋白、C3：補(bǔ)體C3、C4：補(bǔ)體C4、WBC：白細(xì)胞、RBC：紅細(xì)胞、Hb：血紅蛋白、PLT：血小板、ALB：白蛋白、GLO：血清球蛋白、DBIL：直接膽紅素、IBIL：間接膽紅素、ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶、AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶、ALP：堿性磷酸酶、GGT：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、CRE：血肌酐、BUN：尿素氮、BG：血糖、TC：總膽固醇、TG：甘油三酯、HDL：高密度脂蛋白、VLDL：極低密度脂蛋白、LDL：低密度脂蛋白、PT-SEC：凝血酶原時(shí)間、PT-INR：凝血酶原時(shí)間國(guó)際比值、APTT：活化部分凝血活酶時(shí)間。圖4 患者臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)比較 Fig.4 Comparison of clinical indicators between patients

3 討論

目前文獻(xiàn)報(bào)道的血漿HCQ濃度測(cè)定方法多為高效液相色譜-紫外檢測(cè)器 (HPLC-UV) 系統(tǒng)[13-15]，受限于檢測(cè)器靈敏度，其定量下限在100 ng·mL-1以上。然而，一些患者血漿HCQ濃度較低，傳統(tǒng)紫外檢測(cè)器可能無(wú)法滿足其定量需求，且該方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，一般需十幾分鐘至幾十分鐘。本研究建立的UPLC-MS/MS法采用質(zhì)譜檢測(cè)，其定量下限在5 ng·mL-1，檢測(cè)時(shí)間僅需數(shù)分鐘，更加靈敏、快速。本方法采用內(nèi)標(biāo)法，與傳統(tǒng)的外標(biāo)法相比，可減少系統(tǒng)誤差，定量更準(zhǔn)確。后續(xù)筆者還利用此法對(duì)HCQ的3種代謝產(chǎn)物 (去乙基羥氯喹、去乙基氯喹和雙去乙基氯喹) 進(jìn)行檢測(cè)研究，結(jié)果良好。本研究收集53例長(zhǎng)期服用HCQ的SLE患者血樣，采用該方法測(cè)定HCQ濃度，結(jié)果準(zhǔn)確、快速，方法簡(jiǎn)便且重復(fù)性較好，與已報(bào)道的LC-MS/MS法分析效率相當(dāng)[16-17]，且經(jīng)過(guò)更多實(shí)測(cè)病例樣本驗(yàn)證，結(jié)果更加可靠。

報(bào)道顯示HCQ的臨床療效與其血藥濃度正相關(guān)，血藥濃度高臨床治療效果較好，血藥濃度低會(huì)引起療效降低。另外，血漿HCQ濃度可作為疾病發(fā)作的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo)，若濃度低，可提示疾病即將進(jìn)入活動(dòng)期；在體內(nèi)達(dá)到一定濃度，可防止疾病復(fù)發(fā)[18]。但服用等劑量HCQ的SLE患者之間，其穩(wěn)態(tài)血藥濃度往往存在較大差異[19]，不同個(gè)體間血漿HCQ濃度波動(dòng)范圍大[20]，且HCQ一般需要長(zhǎng)期服用，會(huì)引起一些不良反應(yīng)，需要血藥濃度監(jiān)測(cè)[21]。一項(xiàng)對(duì)143例服用HCQ(400 mg·d-1) 6個(gè)月以上的SLE患者的研究發(fā)現(xiàn)，120例非活動(dòng)期SLE患者的平均血漿HCQ濃度為(1079±526) ng·mL-1，23例活動(dòng)期患者的平均血漿HCQ濃度為(694±448) ng·mL-1；當(dāng)血漿HCQ濃度達(dá)到1000 ng·mL-1時(shí)，患者復(fù)發(fā)率較低[22]。本研究53例SLE患者測(cè)得HCQ平均血漿谷濃度為(591.10±288.05) ng·mL-1；400 mg·d-1給藥時(shí)血漿HCQ濃度較高，其它給藥劑量與血藥濃度的相關(guān)性不顯著；血漿HCQ濃度與SLEDAI有負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，低血漿HCQ濃度患者提示可能進(jìn)入疾病活動(dòng)期(SLEDAI>4)。

HCQ不良反應(yīng)主要表現(xiàn)在以下3方面：首先，用藥初期出現(xiàn)惡心嘔吐、胃灼燒感等胃腸道癥狀；其次，長(zhǎng)期服用可出現(xiàn)頭發(fā)損傷和皮疹；在神經(jīng)系統(tǒng)方面，服用HCQ或見(jiàn)失眠、頭痛頭暈和神經(jīng)緊張等反應(yīng)；此外，長(zhǎng)期大劑量服用HCQ治療也可造成中毒性疾病、心臟疾病和周圍神經(jīng)病，但及時(shí)停止服藥，這些癥狀一般可以得到改善[23]。值得注意的是，有重癥肌無(wú)力等神經(jīng)肌肉疾病和精神障礙性疾病患者，使用HCQ時(shí)需謹(jǐn)慎；葡萄糖-6-磷酸酶體內(nèi)缺乏的患者服用時(shí)要明確是否發(fā)生溶血[24]。HCQ最為嚴(yán)重的不良反應(yīng)表現(xiàn)為眼部病變，長(zhǎng)期服藥可能對(duì)視網(wǎng)膜造成損害，且病變有時(shí)間和劑量累積效應(yīng)。每日最大服藥量<6.5 mg·kg-1，發(fā)生視網(wǎng)膜病變風(fēng)險(xiǎn)低，超過(guò)此日劑量，將大大增加視網(wǎng)膜病變的風(fēng)險(xiǎn)[25]。一項(xiàng)回顧性調(diào)查顯示：2361例服用HCQ的患者在用藥前10年，視網(wǎng)膜病變率<2%，服藥超20年，病變率升至20%[26]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血漿HCQ濃度患者眼部不良反應(yīng)發(fā)生較多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[27]。其他不良反應(yīng)表現(xiàn)為頭暈、皮膚瘙癢和咳嗽，應(yīng)引起重視。因此，監(jiān)測(cè)血漿HCQ濃度來(lái)調(diào)整劑量，控制疾病發(fā)作，提高藥物療效，減少不良反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)用藥的個(gè)體化十分重要。

血液系統(tǒng)受累是SLE患者常出現(xiàn)的問(wèn)題，表現(xiàn)為白細(xì)胞、血小板減少及貧血。本研究發(fā)現(xiàn)，血漿HCQ濃度>500 ng·mL-1治療組患者PLT顯著高于亞治療組，提示維持HCQ在較高的血藥濃度，可能對(duì)提高患者PLT，降低SLEDAI有益。目前，HCQ也已被應(yīng)用于SLE合并血小板減少患者的治療[28]。HCQ作用機(jī)制復(fù)雜，可能通過(guò)靶向NADPH氧化酶等靶點(diǎn)及信號(hào)通路，抑制免疫細(xì)胞激活，減少I(mǎi)L-6、IFN-α等炎癥因子分泌[29]。筆者前期研究也顯示，HCQ主要通過(guò)細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP)3A4、CYP2C8、CYP3A5在肝代謝，患者血漿HCQ濃度和不良反應(yīng)的特異性可能分別與CYP2C8 rs10882521和rs10882526位點(diǎn)的基因多態(tài)性有關(guān)[30]。本研究收集分析53例SLE患者的臨床數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示亞治療組患者的AST、ALP水平高于治療組，結(jié)合筆者對(duì)HCQ體內(nèi)代謝及代謝產(chǎn)物的研究[30]，提示患者肝內(nèi)藥物代謝的多樣性可能影響血漿HCQ濃度，造成用藥個(gè)體差異，具體機(jī)制有待進(jìn)一步探索。

SLE和RA等自身免疫性疾病患者，常需使用HCQ長(zhǎng)期維持治療，用藥后可通過(guò)檢測(cè)患者血漿HCQ濃度，及時(shí)調(diào)整劑量或更換藥物，縮短患者達(dá)到緩解的時(shí)間，預(yù)測(cè)疾病發(fā)作情況，減少患者門(mén)診隨訪費(fèi)用和因不良反應(yīng)增加的治療費(fèi)用，提高對(duì)疑難雜癥的治療水平，增加就診人次，也能提高床位周轉(zhuǎn)率。因此，這項(xiàng)研究具有重要的臨床應(yīng)用意義，并對(duì)改善治療成本和提高社會(huì)效益起到積極作用。