阿布都艾則孜·艾爾肯，阿麗亞·依拉木，艾爾菲丁·阿尼娃爾，古麗娜·卡里曼江，木巴拉克·伊明江

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830017)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種發(fā)生在結(jié)直腸黏膜的炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)，具有反復(fù)發(fā)作、病程長(zhǎng)等特點(diǎn)[1-2]，至今無一種藥物能完全治愈UC[3]。對(duì)于UC，西醫(yī)秉持對(duì)癥治療原則，以非甾體抗炎藥5-氨基水楊酸各類劑型的應(yīng)用為主，然而，長(zhǎng)期使用對(duì)人體毒副作用大，治療費(fèi)用昂貴且依從性偏低。中藥治療UC能夠在宏觀上辨證施治的調(diào)解人體狀態(tài)，長(zhǎng)期使用副作用小，價(jià)格低廉，復(fù)發(fā)率低。沒食子(Quercusinfectoriagalls，QIG)為癭蜂科昆蟲沒食子蜂的幼蟲寄生于殼斗科櫟屬植物沒食子樹幼枝上產(chǎn)生的蟲癭，民間常用于治療牙齦糜爛、口腔潰瘍、瘡瘍息肉、腸道潰瘍、肛門炎等[4]。沒食子富含沒食子鞣質(zhì)(50%～70%)和少量游離沒食子酸和鞣花酸[5]。已有文獻(xiàn)證實(shí)，沒食子水提物能夠降低UC大鼠模型潰瘍組織中的炎癥因子水平，發(fā)揮一定的抗UC作用[6]。因此筆者在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，以沒食子單味藥為原料制備了沒食子溫敏原位凝膠，建立了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為進(jìn)一步深入研究藥效及機(jī)理提供質(zhì)量均一的制劑及合理可靠的質(zhì)控方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 DRT-SX智能恒溫電熱套(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，PB-10 pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，Exceed-Cd艾柯超純水儀(美國(guó)Millipore公司)，Agilent-1260高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，包括二元泵、柱溫箱、紫外檢測(cè)器等)，HH-S4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)，85-2控溫磁力攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)，TB-215D電子天平(美國(guó)Danver公司，感量：0.01 mg)，KNX2110 流變儀(英國(guó)Malvern公司)，Linomat 5半自動(dòng)斑點(diǎn)采樣器和Reprostar 3 薄層色譜儀(瑞士CAMAG公司)。

1.2藥品與試劑 沒食子藥材于2019年購(gòu)自廣東廣州市(批號(hào)：190809)，由新疆醫(yī)科大學(xué)生藥教研室主任帕麗達(dá)教授鑒定，拉丁名是QuercusInfectoriaQliv，標(biāo)本保存于新疆醫(yī)科大學(xué)協(xié)同創(chuàng)新樓中心實(shí)驗(yàn)室藥劑組，標(biāo)本號(hào)為20190809；泊洛沙姆407(P407，批號(hào)：1120L021)、泊洛沙姆188(P188，批號(hào)：831I021)，北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸對(duì)照品(批號(hào)：406K022，含量98%)、沒食子酸甲酯(批號(hào)：1013A026，含量98%)，北京索萊寶科技有限公司；鞣花酸(批號(hào)：C12802103，含量98%)、羥丙基甲基纖維素(HPMC，批號(hào)：C12130751)，上海麥克林生化科技有限公司。甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1沒食子提取物的制備 參考文獻(xiàn)[7]，取沒食子藥材粉粹，過孔徑0.18 mm(80目)篩，準(zhǔn)確稱定粉末200 g，加8倍量純化水浸泡1 h，煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮，水浴蒸干(70 ℃)，得干浸膏，恒重，研磨，過80目篩備用。

2.2溫敏原位凝膠的制備工藝 將2 g沒食子水提浸膏溶于50 mL純化水，超聲使其完全溶解后定容，采用冷法制備[8]方法，即放入冰浴中，磁力攪拌下依次緩緩加入P188(1.22%)、P407(24.07%)、HPMC(0.60%)，攪拌5 min，置于4 ℃冰箱冷藏24 h，使其充分溶脹，得到清澈、分散均勻的凝膠溶液。

2.3外觀 室溫下，沒食子溫敏原位凝膠為黃棕色均一透明的溶液，流動(dòng)性好。相變溫度及以上相變后形成黃棕色的半固體，不能流動(dòng)，透明均勻，有一定彈性，見圖1。

圖1 沒食子溫敏原位凝膠形態(tài) Fig.1 QIG thermosensitive in situ gel morphology

2.4pH測(cè)定 按照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 版四部[9]附錄0631中的方法測(cè)定，重復(fù)3次，測(cè)得pH值為4.27±0.20，符合直腸應(yīng)用制劑的要求。

2.5均一性考察[10]分別取室溫(25 ℃)和生理溫度(37 ℃)下放置14 d的沒食子溫敏原位凝膠適量，5000 r·min-1離心20 min(r=39 cm)，觀察是否出現(xiàn)分層現(xiàn)象。結(jié)果表明，均未見分層，性狀均一。

2.6膠凝溫度和黏度的測(cè)定[11-12]樣品在振蕩模式(用PU40不銹鋼平行板)進(jìn)行溫度掃描(temperature sweep，TS)，掃描頻率固定在1 Hz，應(yīng)變1%，溫度范圍4～50 ℃，以5 ℃·min-1速率加熱。測(cè)定儲(chǔ)能模量(G′)，損耗模量(G″)，復(fù)數(shù)黏度(η*)隨溫度的變化，記錄溶液凝固時(shí)的溫度即為相變溫度(Tsol-gel)。結(jié)果G′，G″，η*均隨溫度升高呈上升趨勢(shì)，在(33.2±1.2)℃ 時(shí)G′和G″相交，交點(diǎn)即其Tsol-gel。樣品在此溫度前G″>G′、η*較小，說明此時(shí)主要存在G″、黏度較低，表現(xiàn)出明顯的流體性質(zhì)。Tsol-gel后逐漸G′>G″，η*急劇增長(zhǎng)，說明凝膠結(jié)構(gòu)正在形成、且G′，G″和 η*趨于平緩，證明凝膠黏彈性趨于穩(wěn)定，見圖2。

圖2 沒食子溫敏原位凝膠在程序升溫中G'、G”及η*的變化曲線 Fig.2 G',G"and η* curvesof QIG thermosensitive in situ gel at different temperatures

2.7膠凝時(shí)間 取適量沒食子溫敏原位凝膠于試管中，放置在33 ℃下的恒溫水浴鍋中，每15 s倒置1次，記錄試管中的液體不再流動(dòng)時(shí)即為凝膠化時(shí)間，平行重復(fù)3次。結(jié)果顯示，沒食子溫敏原位凝膠的膠凝時(shí)間為(130±15) s，表明其能充分覆蓋直腸黏膜，與潰瘍面積有較好的接觸[13]。

2.8粒度 取本品涂于載玻片，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版四部附錄0114凝膠劑項(xiàng)下粒度測(cè)定法[9]進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，本品均無凝聚現(xiàn)象，未檢出粒徑>180 μm的粒子。

2.9沒食子酸、沒食子酸甲酯及鞣花酸的TLC及TLC-Bio分析

2.9.1樣品的制備 精密移取沒食子溫敏原位凝膠1 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，密塞，搖勻，超聲(功率200 W，頻率40 kHz，35 ℃)30 min，放至室溫，經(jīng)孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液；按處方制備缺沒食子的空白凝膠樣品，同法制備陰性供試品溶液；分別取沒食子的水提浸膏和藥材粉末0.4，1 g，同法制成原料藥對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液；分別精密稱取沒食子酸2.08 mg、沒食子酸甲酯2.37 mg、鞣花酸2.16 mg，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容至刻度，即得質(zhì)量濃度依次為0.208，0.237，0.216 mg·mL-1單一成分對(duì)照品溶液；同法制備各成分濃度為0.517，0.106，0.103 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.9.2色譜程序 使用CAMAG Linomat 5 半自動(dòng)斑點(diǎn)采樣器，對(duì)硅膠GF254板條狀點(diǎn)樣，采樣器的載氣為氮?dú)猓尫潘俾蕿?10 nL·s-1，除對(duì)照藥材及水提浸膏1 μL外對(duì)照品與供試品溶液均為8 μL，帶長(zhǎng)6 mm，軌道距離8 mm，左右邊距15 mm，條帶間距8 mm。以氯仿：乙酸乙酯：甲醇：甲酸(5：4.5：1：2)為展開劑，在展開缸中預(yù)飽和10 min 后展開，取出晾干，使用Reprostar 3 薄層色譜儀分別在254、366 nm紫外燈和白光(噴FeCl3、溶液顯色)下檢視和捕獲樣品圖像。結(jié)果顯示，供試品溶液中3種多酚類成分斑點(diǎn)清晰與原料藥對(duì)照溶液和對(duì)照藥材溶液一致且基質(zhì)無干擾，方法專屬性良好[14]，見圖3A～C。

1.沒食子酸；2.沒食子酸甲酯；3.鞣花酸；4.混標(biāo)；5.供試品溶液；6.原料藥對(duì)照溶液；7.對(duì)照藥材溶液；8.陰性供試品溶液。圖3 沒食子溫敏原位凝膠薄層色譜圖(A～C)及生物自顯影色譜圖(D) 1.gallic acid；2.methyl gallate；3.ellagic acid；4.mixed standards' solution；5.sample solution；6.control API solution；7.control QIG crude drug's solution；8.negative sample solution.Fig.3 TLC (A-C) and TLC-Bio (D) chromatograms of QIG thermosensitive in situ gel

2.9.3TLC-Bio分析 按“2.9.2”項(xiàng)下操作后直接噴以DPPH甲醇溶液(0.00427%)，直到呈現(xiàn)紫色背景，在白光下檢視。結(jié)果，薄層板無抗氧化活性，呈紫色背景，而對(duì)照品和供試品顯黃白色斑點(diǎn)，顯示具有良好的抗氧化活性，說明沒食子溫敏原位凝膠中沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸都有不同程度的抗氧化活性，見圖3-D。

2.10沒食子酸、沒食子酸甲酯和鞣花酸的含量測(cè)定

2.10.1色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.2%磷酸溶液(A)-甲醇(B)溶液梯度洗脫；洗脫程序：0～10 min，10%→30% B；10～26 min，30%→68% B；26～28 min，68% B；28～29 min，68%→10% B；29～35 min，10% B；檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25 ℃。

2.10.2混合對(duì)照品溶液 精密稱取沒食子酸5.17 mg、沒食子酸甲酯1.06 mg、鞣花酸1.03 mg置10 mL量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容至刻度，即得各成分濃度為0.517，0.106，0.103 mg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.10.3供試品溶液 精密移取沒食子溫敏原位凝膠1 mL，置25 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，密塞，搖勻，超聲(功率200 W，頻率40 kHz，35 ℃)30 min，放至室溫，經(jīng)孔徑.22 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.10.4陰性對(duì)照溶液 按處方工藝制備缺沒食子水提物的空白凝膠樣品，按“2.10.3”項(xiàng)下操作，即得陰性樣品溶液。

2.10.5方法學(xué)考察

①專屬性實(shí)驗(yàn)。分別取上述混合對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，在此色譜條件下供試品中待測(cè)組分與相鄰峰分離度均大于1.5且各組分理論板數(shù)均>5000，基質(zhì)不干擾主成分測(cè)定，該法專屬性良好，見圖4。

A.混標(biāo)溶液；B.供試品溶液；C.陰性對(duì)照溶液；1.沒食子酸；2.沒食子酸甲酯；3.鞣花酸。圖4 沒食子溫敏原位凝膠HPLC色譜圖 A.mixed standards' solution；B.sample solution；C.negative sample solution；1.gallic acid；2.methyl gallate；3.ellagic acid.Fig.4 HPLC chromatograms of QIG thermosensitive in situ gel

②線性關(guān)系考察。精密吸取“2.10.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，倍量稀釋，得到系列濃度的對(duì)照品溶液，按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，以質(zhì)量濃度(X，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到3個(gè)組分回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)，見表1。

表1 沒食子溫敏原位凝膠中3個(gè)組分的回歸方程及線性范圍 Tab.1 Regression equations and linear ranges of three components in QIG thermosensitive in situ gel

③精密度實(shí)驗(yàn)。取“2.10.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定沒食子酸、沒食子酸甲酯和鞣花酸峰面積的RSD值分別為0.4%，0.5%，1.6%，表明儀器精密度良好。

④穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。取“2.10.3”項(xiàng)下(批號(hào)：20211026)供試品溶液10 μL，置0，2，4，8，12，24 h后按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明沒食子酸、沒食子酸甲酯及鞣花酸RSD值分別為1.3%，1.5%，2.3%，供試品溶液中的3個(gè)待測(cè)組分在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

⑤重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。取“2.10.3”項(xiàng)下供試品溶液(批號(hào)：20211026)6份，按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果沒食子酸、沒食子酸甲酯及鞣花酸RSD分別為1.2%，1.8%，2.0%，表明本法重復(fù)性較好。

⑥加樣回收率實(shí)驗(yàn)。取沒食子溫敏原位凝膠樣品(批號(hào)：20211026)6份，每份精密移取1 mL取按“2.10.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按1：1的比例精密加入一定量的3個(gè)組分對(duì)照品溶液，按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，見表2。

表2 沒食子溫敏原位凝膠中3個(gè)組分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6) Tab.2 Recovery experiment results of three components in QIG thermosensitive in situ gel(n=6)

⑦樣品含量測(cè)定。取3 批沒食子溫敏原位凝膠(批號(hào)：20211025，20211026，20211027)，每批3份，分別按“2.10.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.10.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量，見表3。

表3 沒食子溫敏原位凝膠樣品含量測(cè)定結(jié)果 Tab.3 Sample content determination results of QIG thermosensitive in situ gel

3 討論

3.1有效成分的選擇 沒食子酸、鞣花酸、沒食子酸甲酯均具有抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、醫(yī)藥領(lǐng)域[15-16]。因此，本研究選擇了沒食子溫敏原位凝膠中的以上3種藥效成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2HPLC波長(zhǎng)的選擇 取沒食子酸、沒食子酸甲酯和鞣花酸對(duì)照品溶液在波長(zhǎng)范圍200～800 nm進(jìn)行波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，沒食子酸在216，271 nm處有較強(qiáng)吸收；沒食子酸甲酯在269 nm處有較強(qiáng)吸收；鞣花酸在258，367 nm處有較強(qiáng)吸收，為兼顧這3種成分檢測(cè)的需要，選擇258 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3TLC流動(dòng)相比例的優(yōu)化 在選用不同比例展開劑摸索展開劑比例中發(fā)現(xiàn)當(dāng)甲酸和甲醇的比例為2：1時(shí)展開效果最佳，因此確定展開劑比例為氯仿：乙酸乙酯：甲酸：甲醇(5：4.5：2：1，V/V/V/V)。

3.4抗氧化活性測(cè)定方法 Bio-TLC-DPPH是薄層層析-生物自顯影法的一種，用于抗氧化活性成分的篩選和測(cè)定，其原理為具有清除DPPH自由基能力的物質(zhì)能使DPPH還原成DPPH-H而呈現(xiàn)淡黃色至白色，而薄層板本身顯淡紫色。該方法具有簡(jiǎn)單、快捷、直觀的特點(diǎn)，可用以評(píng)價(jià)活性成分的抗氧化能力[17]。

3.5溫敏原位凝膠特點(diǎn) 溫敏原位凝膠具有在相應(yīng)室溫與體溫條件下的溶液-凝膠轉(zhuǎn)變特性，能在給藥部位快速凝膠化以實(shí)現(xiàn)定位粘附，有效防止藥物泄漏，延長(zhǎng)滯留時(shí)間，改善用藥便利性[18]。王秋平等[19]根據(jù)課題組前期研究，將沒食子水提物經(jīng)乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱分離純化得到3種大分子多酚，采用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定其含量用膠凝溫度、膠凝時(shí)間和黏度等指標(biāo)進(jìn)行了表征。本文以沒食子水提物作為原料藥，最大程度地保留原藥材的活性成分，從而較好地發(fā)揮其藥效。從制劑學(xué)角度出發(fā)，用該劑型表征中常用的指標(biāo)如均一性、pH值、膠凝溫度、膠凝時(shí)間、黏度作為質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)；從活性成分出發(fā)，沒食子酸、沒食子酸甲酯、鞣花酸經(jīng)TLC定性鑒別，TLC-Bio抗氧化活性評(píng)價(jià)，HPLC定量測(cè)定其含量，等作為藥效監(jiān)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。這些活性成分的分析技術(shù)也為快速分析和鑒定五倍子、石榴、玫瑰花等富含多酚成分的中藥材及制劑提供可借鑒的分析方法。

溫敏原位凝膠有諸多優(yōu)點(diǎn)，但是距離臨床實(shí)際應(yīng)用仍有很大距離。究其原因是多方面的，目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于溫敏原位凝膠的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也未形成共識(shí)，也無統(tǒng)一的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[20]。因此，國(guó)內(nèi)外應(yīng)盡快達(dá)成溫敏原位凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的共識(shí)，以期不久的將來，更多的藥物原位凝膠成功研發(fā)上市并應(yīng)用于臨床廣大患者。

綜上所述，本文參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020版凝膠規(guī)定，結(jié)合溫敏原位凝膠特性，確定了以外觀、pH值、膠凝溫度、黏度、粒度和均一性作為質(zhì)量考察指標(biāo)，而且為更準(zhǔn)確控制有效成分以保證發(fā)揮其療效，建立并確定了沒食子酸、鞣花酸及沒食子酸甲酯的定性、定量測(cè)定方法。本研究所建立的質(zhì)量控制方法操作簡(jiǎn)便，專屬性好，準(zhǔn)確度高，為制定沒食子溫敏原位凝膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。