林穎，李航，周冉，梁棟，王艷，胡平，許爭(zhēng)峰（南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院＆南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，南京 210004）

孕婦血漿游離DNA（cell-free DNA，cf-DNA）檢測(cè)技術(shù)用于評(píng)估胎兒罹患21－三體綜合征（21－三體）、18－三體和13－三體的風(fēng)險(xiǎn)，并獲得良好的臨床應(yīng)用效果［1］。目前有學(xué)者提出該技術(shù)可擴(kuò)展至其他染色體的篩查，包括罕見(jiàn)三體（除21－三體、18－三體和 13－三體以外的常染色體三體）等［2］。16－三體是cf-DNA 檢出的高頻罕見(jiàn)三體之一，但目前基于cf-DNA檢測(cè)的16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的報(bào)道較少，臨床意義也不明確。因此，本研究回顧性分析了南京市婦幼保健院2017 年至2021 年cf-DNA 檢出結(jié)果為16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，對(duì)其產(chǎn)前診斷驗(yàn)證結(jié)果和妊娠結(jié)局情況進(jìn)行回訪(fǎng)，從而評(píng)估cf-DNA檢測(cè)用于胎兒16－三體篩查的臨床應(yīng)用價(jià)值，以期為該類(lèi)孕婦的妊娠咨詢(xún)和管理提供有價(jià)值的信息。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集2017年1月至2021年12月于南京市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心進(jìn)行孕婦血漿cf-DNA檢測(cè)的孕婦。將其中cf-DNA 檢測(cè)結(jié)果為16－三體高風(fēng)險(xiǎn)且有完整回訪(fǎng)結(jié)果的孕婦作為研究對(duì)象，排除回訪(fǎng)信息不全或失訪(fǎng)的孕婦。本研究經(jīng)南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批號(hào)：NFLZ2019-KY-004）。所有孕婦均進(jìn)行詳細(xì)的檢測(cè)前咨詢(xún)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 試劑與儀器 核酸提取試劑盒、胎兒染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒、胎兒染色體非整倍體測(cè)序反應(yīng)試劑盒（武漢華大生物科技公司）。BGIseq-500基因測(cè)序儀、SP-300自動(dòng)化工作站（深圳華大智造科技公司），Qubit 2.0 熒光計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾公司），ABI 9700 PCR 儀（美國(guó) ABI 公司），CytoScan 750K array檢測(cè)平臺(tái)（美國(guó)Afymetrix公司）。

1.3 方法

1.3.1 血漿DNA提取及文庫(kù)制備 采集孕婦空腹靜脈血5 mL 于EDTA-K2抗凝的采血管中，8 h 內(nèi)分離血漿，將分離好的血漿儲(chǔ)存于－80 ℃冰箱備用。采用SP-300 自動(dòng)化工作站進(jìn)行血漿DNA 提取及文庫(kù)制備，按照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，主要步驟包括：末端修復(fù)，接頭連接，接頭連接后純化，PCR 反應(yīng)，PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化，Qubit 熒光定量檢測(cè)（文庫(kù)濃度＞3 ng／μL為合格）。

1.3.2 高通量測(cè)序 將以上合格文庫(kù)進(jìn)行pooling，混勻后進(jìn)行環(huán)化，環(huán)化后的文庫(kù)采用BGIseq-500基因測(cè)序儀測(cè)序。按照BGIseq-500 基因測(cè)序儀及試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，主要步驟包括：核酸納米球（DNB）制備，Qubit 熒光定量檢測(cè)（DNB 濃度≥3 ng／μL為合格），DNB 自動(dòng)樣本加載系統(tǒng)操作，全自動(dòng)樣品加載系統(tǒng)上機(jī)操作，測(cè)序儀清洗，新建測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)序列比對(duì)獲得每條染色體有效DNA序列條數(shù)，與參考值（hg19，NCBI build 37）進(jìn)行比較，計(jì)算出胎兒患染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)。采用BGI HALOS NIFTY項(xiàng)目信息分析系統(tǒng)進(jìn)行自動(dòng)化分析，當(dāng)Z值介于－6～6時(shí)判定為16－三體低風(fēng)險(xiǎn)，當(dāng)Z值＞6時(shí)則判定為16－三體高風(fēng)險(xiǎn)。主要質(zhì)量控制要求，包括有效數(shù)據(jù)量≥3.5 Mb、GC 含量范圍為38%～42%、胎兒濃度≥3.5%。

1.3.3 羊水染色體核型分析和染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA） 取cf-DNA檢測(cè)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)行羊水染色體核型分析和CMA檢測(cè)，染色體核型分析采用傳統(tǒng)的G 顯帶法，CMA使用CytoScan 750K array檢測(cè)平臺(tái)及其配套的染色體分析軟件進(jìn)行分析。

1.4 妊娠結(jié)局回訪(fǎng)及數(shù)據(jù)收集 回訪(fǎng)內(nèi)容主要依據(jù)《孕婦外周血胎兒游離DNA 產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)規(guī)范》［3］，內(nèi)容包括：胎兒細(xì)胞遺傳學(xué)結(jié)果、流產(chǎn)、引產(chǎn)、早產(chǎn)或足月產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎等情況，在分娩后3個(gè)月將通過(guò)電話(huà)對(duì)其妊娠結(jié)局進(jìn)行回訪(fǎng)。孕婦的基本信息、cf-DNA檢測(cè)結(jié)果和檢測(cè)相關(guān)參數(shù)從BGI HALOS NIFTY 項(xiàng)目信息分析系統(tǒng)中收集。新生兒出生體重百分位數(shù)根據(jù)《胎兒生長(zhǎng)受限專(zhuān)家共識(shí)（2019 版）》［4］計(jì)算，早產(chǎn)定義為分娩時(shí)妊娠孕周＜37周。所有數(shù)據(jù)均采用Excel 2012軟件計(jì)算例數(shù)和比例。

2 結(jié)果

2.1 16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的檢出情況 共56 247 例孕婦進(jìn)行了外周血cf-DNA 檢測(cè)，檢出16－三體高風(fēng)險(xiǎn)22例，檢出率為 0.04%。22 例16－三體高風(fēng)險(xiǎn)中，孕婦年齡（31.2±4.1）歲，孕周（17.8±2.4）周，其中12 例（54.54%，12／22）為高齡或血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)，cf-DNA 檢出的平均胎兒濃度為（10.0±4.0）%，16 號(hào)染色體的平均 Z 值為 14.2±6.2。見(jiàn)表 1。

2.2 16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的驗(yàn)證情況 22 例 16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中，8 例（36.4%，8／22）孕婦進(jìn)行了羊水單核苷酸多態(tài)性微陣列分析（single nucleotide polymorphism array，SNP-array）。SNP-array 結(jié)果顯示，2 例為 UPD（16），其中 1 例為 arr［hg19］16p 13.3p13.2（94，807-8，418，576）×2hmz，1 例為 arr［hg19］16q22.1q24.3（69，860，932-90，146，366）×2hmz（圖1）；其余6例SNP-array未檢出異常。8例中未發(fā)現(xiàn)胎兒16－三體真陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)期值為0。

圖1 羊水單核苷酸多態(tài)性微陣列驗(yàn)證結(jié)果

2.3 16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的妊娠結(jié)局 22 例 16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的妊娠結(jié)局全部隨訪(fǎng)成功，其中4 例（18.2%，4／22）發(fā)生流產(chǎn)或胎兒發(fā)育異常。其余 18例繼續(xù)妊娠的孕婦中，6 例（27.3%，6／22）在孕期患有妊娠期高血壓或重度子癇，11 例（50.0%，11／22）發(fā)生早產(chǎn)，13 例（59.1%，13／22）小于胎齡兒出生，3 例（13.6%，3／22）新生兒健康出生（足月分娩、新生兒無(wú)畸形以及新生兒體重正常）。見(jiàn)表1。

表1 22例cf-DNA檢測(cè)結(jié)果為16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦的臨床信息及妊娠結(jié)局

3 討論

本研究回顧性分析了2017 年1 月至2021 年12月基于cf-DNA檢出16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的情況，證實(shí)16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的檢出率為0.04%，與Benn等［5］報(bào)道類(lèi)似（66／155 213）。盡管侵入性產(chǎn)前診斷驗(yàn)證未發(fā)現(xiàn)胎兒16－三體真陽(yáng)性，但筆者的回訪(fǎng)結(jié)果證實(shí)，約86.4%的16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦會(huì)發(fā)生胎兒發(fā)育異常以及流產(chǎn)、早產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥，提示cf-DNA檢出的16－三體高風(fēng)險(xiǎn)與不良妊娠結(jié)局有一定的關(guān)聯(lián)。

孕婦外周血中cf-DNA主要包括母源性和胎源性的cf-DNA，胎源性的cf-DNA 主要來(lái)源于胎盤(pán)滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此，孕婦血漿cf-DNA檢測(cè)實(shí)際評(píng)估的是胎盤(pán)染色體非整倍體的風(fēng)險(xiǎn)。限制性胎盤(pán)嵌合（confined placental mosaicsm，CPM）是孕婦血漿cf-DNA檢測(cè)假陽(yáng)性的主要原因之一［6-7］。Hartwig等［6］系統(tǒng)地闡述了1997 至2016 年間報(bào)道的有關(guān)cf-DNA檢測(cè)假陽(yáng)性的文章，共60 例存在生物遺傳學(xué)原因分析的假陽(yáng)性樣本中，19 例（32%）假陽(yáng)性是 CPM 導(dǎo)致的。Malvestiti等［7］對(duì) 1 001 例產(chǎn)前診斷絨毛樣本進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)約87%的樣本是CPM，而罕見(jiàn)三體的 CPM 發(fā)生率則更高，可達(dá)97%。因此，盡管本研究中侵入性產(chǎn)前診斷未發(fā)現(xiàn)胎兒 16 －三體真陽(yáng)性，但這并不能排除存在CPM16。

16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦有較高的不良妊娠結(jié)局風(fēng)險(xiǎn)。Benn 等［5］統(tǒng)計(jì)了近年來(lái)基于 cf-DNA 篩查報(bào)道的共31例16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的妊娠結(jié)局，結(jié)果顯示64.5%的孕婦存在流產(chǎn)、宮內(nèi)生長(zhǎng)發(fā)育遲緩或真胎兒嵌合體。本研究回訪(fǎng)結(jié)果同樣提示cf-DNA檢出的16－三體高風(fēng)險(xiǎn)與不良妊娠結(jié)局有一定的關(guān)聯(lián)，22例高風(fēng)險(xiǎn)中18.2%（4／22）發(fā)生流產(chǎn)或胎兒發(fā)育異常，27.3%（6／22）在孕期患有妊娠期高血壓或重度子癇，50.0%（11／22）發(fā)生早產(chǎn)，59.1%（13／22）小于胎齡兒出生。因此，對(duì)于cf-DNA 篩查檢出的16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議進(jìn)行相關(guān)的遺傳咨詢(xún)和妊娠管理，尤其要密切監(jiān)測(cè)胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育情況和可能的妊娠并發(fā)癥。

16號(hào)染色體是容易發(fā)生非整倍體的染色體之一，這也導(dǎo)致了16號(hào)染色體UPD 的高發(fā)。研究表明，在絨毛染色體結(jié)果為16－三體或16－三體嵌合體時(shí)，其中約15%的胎兒羊水染色體為 UPD（16）［7］。本研究納入的 8 例侵入性產(chǎn)前診斷驗(yàn)證中有2例確診為UPD（16），其中1例為早產(chǎn)且出生體重小于第3百分位數(shù)，另1例為足月出生的健康新生兒。因此，對(duì)于cf-DNA 檢測(cè)提示16－三體高風(fēng)險(xiǎn)孕婦產(chǎn)前診斷時(shí)建議采用SNP-array 進(jìn)行檢測(cè)以排除UPD，而UPD（16）導(dǎo)致印記基因的異常表達(dá)是否與胎兒生長(zhǎng)發(fā)育遲緩有關(guān)尚存在爭(zhēng)議［8］。

綜上所述，cfDNA檢測(cè)的16－三體高風(fēng)險(xiǎn)中胎兒真正陽(yáng)性的可能性很小，CPM是假陽(yáng)性高的主要原因，因此對(duì)于該類(lèi)孕婦進(jìn)行產(chǎn)前診斷需慎重。由于16－三體高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦比其他三體高風(fēng)險(xiǎn)有更高的不良妊娠結(jié)局，因此，有研究者提出16－三體是最值得cfDNA檢測(cè)的罕見(jiàn)三體［9］，但由于檢測(cè)精度、假陽(yáng)性率尚不明確，目前國(guó)外一些指南并不支持cfDNA檢測(cè)擴(kuò)展至胎兒罕見(jiàn)三體的篩查［10］。故而在cfDNA檢測(cè)前需做好檢測(cè)前的咨詢(xún)，對(duì)于需要擴(kuò)展性篩查結(jié)果的孕婦要詳細(xì)告知檢測(cè)的局限性以及可能的風(fēng)險(xiǎn)。