翁銀花，陳杰，谷嬉嬉，羅艷萍，劉潮，藍艷，韋葉生（.桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，廣西桂林 5400，.右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西百色 533000）

MicroRNAs（MiRNAs）是一種在物種間高度保守的內(nèi)源性小非編碼RNA，長度約為18 ～25 個核苷酸，其在體內(nèi)主要通過與靶mRNA 3′非翻譯區(qū)（3′UTR）互補位結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平上通過抑制mRNA翻譯或促進mRNA 降解來調(diào)節(jié)基因表達。因此，也被稱為內(nèi)源性關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［1］。據(jù)報道，人類基因組中有已知超過2 500 種MicroRNA能特異性調(diào)節(jié)基因表達，它們參與多種細胞的過程，如細胞增殖、分化以及代謝等［2］。miR-365 作為MicroRNA家族中被研究最廣泛的重要成員之一，研究表明，miR-365不僅參與眾多生物的復雜調(diào)控，還被證實其異常表達與肝癌［3］、胰腺癌［4］、非小細胞肺癌［5］以及糖尿?。?］等疾病的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān)。近期研究表明，miR-365基因存在位點多態(tài)性，這種多態(tài)性可能對miR-365 的表達調(diào)控有一定的影響，這一發(fā)現(xiàn)可能成為某些腫瘤早期診斷的指標和治療的新靶點［7］。然而，目前關(guān)于廣西人群miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G位點遺傳多態(tài)性的相關(guān)研究在國內(nèi)外尚未見報道。因此，本研究采用SNPscan 技術(shù)對廣西地區(qū)健康人群miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G基因位點進行基因分型檢測，進一步分析其基因型和等位基因與不同地區(qū)人群在多態(tài)性方面存在的差異，為后期與miR-365 基因位點相關(guān)的易感性疾病的預防與治療和群體遺傳學等方面提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 隨機選取2021年1月至6月于桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院健康體檢中心體檢的健康者血液樣本 294 例，男 175 例，女 119 例，年齡（54.9±8.2）歲，各項實驗室指標均正常，排除自身免疫、腫瘤、心腦血管疾病以及血脂異常等疾病。各研究對象均屬健康的廣西獨立個體，且個體間均無親緣關(guān)系。本研究方案獲得桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器與試劑 QT-1漩渦混合器 （上海琪特分析儀器公司），TD5A-WS 臺式低速離心機 （長沙湘儀離心機儀器公司），DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設(shè)備公司），F(xiàn)R-110 紫外分析裝置、FR-250電泳儀（上海復日科技公司），多用途水平電泳槽（北京百晶生物科技公司），2720 型Thermal Cycler 擴增儀、3130型genetic analyze分析儀（美國ABI公司）。人類基因組DNA全血提取試劑盒（北京天根生化科技公司），SNPscanTM分型試劑盒、Tag DNA ligase（50 U／μL）、Tag DNA ligase Buffer（10X）購自上海天昊生物科技公司，10× PCR buffer、dNTP mix （2.5 mmol／L）、Takara HotStart Taq （5 U／μL）均購自日本 TaKaRa 公司，MgCl2（25 mmol／L，上海生工公司）、Hi-Di、GeneScanTM-500 染料（美國 ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA 樣本制備及濃度、純度鑒定 采集各研究對象空腹靜脈血3 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，混勻后取200 μL 全血標本，按照人類基因組DNA全血提取試劑盒說明書進行DNA 樣本提取，余下的樣本分裝于相應儲存管內(nèi)，置于－70 ℃儲存。取1 μL DNA樣本，使用紫外分光光度儀檢測吸光度（A260nm／A280nm）值，取比值為 1.7 ～ 2.0，濃度為30～50 ng／μL的合格DNA樣本用于后續(xù)基因分型試驗。

1.3.2 引物設(shè)計與合成 通過NCBI查找miR-365基因rs121224 和rs178553 位點的堿基序列，采用Primer Premier 3.0軟件對引物進行設(shè)計（表1），引物委托上海天昊公司合成。

表1 miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G位點的引物序列

1.3.3 PCR擴增及測序 連接反應體系總體積為20.0 μL，包括 8.0 μL DNA 樣本，10.0 μL 2×連接緩沖液，0.8 μL 連接探針混合液，0.2 μL 耐熱 DNA 聚合酶，1 μL 滅菌雙蒸餾水補足，共20.0 μL。連接反應參數(shù)：94 ℃ 1 min，58 ℃ 4 h，循環(huán) 4 次；94 ℃2 min，72 ℃保存。連接多重 PCR 擴增體系（20.0 μL）包括 2 μL 1×GC-Ⅰ緩沖液，2.5 mmol Mg2＋，0.2 mmol dNTP，1.0 U 耐熱 DNA 聚合酶，1 μL DNA樣本，0.2 μL多重PCR引物，滅菌雙蒸水補足至 20 μL。多重 PCR 反應參數(shù)：95 ℃ 2 min；94 ℃20 s，62 ℃ 40 s（每個循環(huán)降低 0.5 ℃），72 ℃1.5 min，循環(huán) 9 次；94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，循環(huán) 25 次；68 ℃ 80 min；4 ℃ 保存。將PCR 產(chǎn)物稀釋10 倍后，取1 μL 與0.5 μL Liz500 分子量內(nèi)標，8.5 μL Hi-Di 混勻，95 ℃變性 5 min，純化后的PCR 產(chǎn)物上ABI3730XL 測序儀檢測，收集的原始數(shù)據(jù)用 Gene-Mapper（Applied Biosystems，USA）4.1 軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計分析 應用SPSS 25.0統(tǒng)計學軟件進行。根據(jù)基因型符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），證明所選取樣本具有群體代表性。rs121224C／G和rs178553A／G位點基因型及等位基因頻率采用直接計算法計算，采用χ2檢驗計算不同地區(qū)人群的分布差異，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G 分 型 檢 測 結(jié) 果 rs121224C／G 和rs178553A／G 位點基因型符合 Hardy-Weinberg 定律（χ2值分別為 0.097，0.082，P 值分別為 0.755 和0.774），證明所選取的樣本有效。測序結(jié)果顯示，rs121224C／G 位點有 3 種基因型，分別為 CC（27.9%）、GC（49.0%）和 GG（23.1%），C 和 G 等位基因頻率分別為 52.4%和 47.6%。rs178553A／G 位點包含 AA（22.4%）、AG（49.0%）和 GG（28.6%）3種基因型，A 和 G 等位基因頻率分別為46.9%和53.1%?；蛐头中徒Y(jié)果見圖1。

圖1 rs121224位點（A）及rs178553位點（B）測序結(jié)果

2.2 不同性別間 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G 多態(tài)性的比較 廣西地區(qū)人群miR-365基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G 位點分別以 GC（49.0%）和 AG（49.0%）基因型為多見；最高基因頻率分別為 C（52.4%）和 G（53.1%）。不同性別間 rs121224C／G、rs178553A／G 位點基因型和等位基因比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），結(jié)果見表2。

表2 廣西地區(qū)人群miR-365基因 rs121224、rs178553 多態(tài)性在不同性別間的比較

2.3 廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G多態(tài)性與其他地區(qū)人群比較 經(jīng)統(tǒng)計學分析，廣西地區(qū)體檢健康者rs121224C／G 位點基因型、等位基因頻率與 HapMap公布的CEU、YRI人群比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05），但與HCB和JPT 地區(qū)人群比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；rs178553A／G 位點基因型和等位基因頻率與HapMap公布的CEU、JPT和YRI 地區(qū)人群比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而與HCB地區(qū)人群比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、表 4。

表3 廣西地區(qū)人群miR-365 基因rs121224位點多態(tài)性與不同地區(qū)人群比較

表4 廣西地區(qū)人群miR-365 基因rs178553位點多態(tài)性與不同地區(qū)人群比較

3 討論

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是人類基因組中占比最高的變異形式（90%），主要是指在基因水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，在人類基因組中平均每300 個堿基對中就有1 個 SNP，SNP 是導致miRNA失調(diào)，影響個體疾病遺傳易感性的重要因素［8］。近年來，隨著全基因組計劃的研究不斷深入，基因位點上的SNP 與疾病的易感性成為研究的熱點［9-10］。有研究表明miR-SNP 與不同類型的癌癥有關(guān)，包括鱗狀細胞癌［11］、胃癌［12］和腦卒中［13］等。miRNA SNPs 是影響miRNA 的表達和功能的主要因素之一，Li 等［14］發(fā)現(xiàn)在中國漢族人群中pri-miR-218-2基因 rs11134527 位點的 A 等位基因可能是肺癌的危險因素，而 pri-miR-143 基因rs4705343位點的T等位基因可能與非小細胞肺癌風險降低相關(guān)。但同時也發(fā)現(xiàn)亞洲和歐洲2 個種群之間等位基因頻率明顯不同，這一結(jié)果提示這些SNPs如果要用作于非小細胞肺癌新的標志物，還應增加對不同背景人群中 SNPs 進行研究。miR-365作為MicroRNA的一位重要成員，在生命體中廣泛存在，關(guān)于miR-365 SNPs 與疾病的相關(guān)性不少文獻也有報道，Re 等［15］發(fā)現(xiàn)，在 miR-365b 基因rs121224中，具有CC 基因型和CG 基因型的胃癌患者胃蛋白酶原（PGⅡ）水平更高，這與胃癌患者感染幽門桿菌具有一定的相關(guān)性。Wu 等［16］發(fā)現(xiàn)中國北方人群miR-365b基因rs121224與飲酒亞組中的腸型胃癌風險相關(guān)，Borrmann Ⅲ～Ⅳ期腸型胃癌患者攜帶miR-365b 基因rs121224 位點CC 和GC基因型的預后相比 GG 基因型較差，這提示SNP 可能對不同背景胃癌患者中miR-365 的表達有一定的影響。既往研究表明同一疾病在不同區(qū)域人群中的易感性可能存在不同程度的差異，例如，腦卒中在我國東北地區(qū)的發(fā)病率較南部地區(qū)升高［17］。因此，研究遺傳多態(tài)性在不同背景人群間的分布差異將為今后在基因水平上診斷和治療某些疾病提供科學的理論依據(jù)。

本研究對 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G位點采用高通量SNPscan測序技術(shù)進行檢測，并與千人基因組計劃數(shù)據(jù)庫公布的CEU、HCB、JPT 和YRI 人群的SNP 分型數(shù)據(jù)進行比較，并分析不同種族人群的差異。結(jié)果顯示，廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G位點基因型和等位基因頻率在男女性別間的分布均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明兩位點的多態(tài)性與性別無關(guān)。進一步與不同人群比較后發(fā)現(xiàn)，廣西地區(qū)人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G位點的基因型和等位基因與HCB 人群相比，差異均無統(tǒng)計學意義。廣西地區(qū)人群和HCB人群均屬中國人，地理位置較近，遺傳背景和物種進化來源上存在一定的同源性，故基因型分布規(guī)律的相似度也越高。rs121224C／G位點與JPT人群比較，差異無統(tǒng)計學意義，但rs178553A／G 位點與JPT人群比較差異具有統(tǒng)計學意義。造成這種結(jié)果的原因可能是廣西地區(qū)人群與JPT 人群均屬亞洲，距離較近，飲食文化存在諸多相似，遺傳背景差異小，但同時由于廣西的地理位置獨特，屬于多個民族聚集的地廣人稀地區(qū)，氣候變化和獨特的喀斯特地貌以及少數(shù)民族通婚現(xiàn)象的普遍存在也可能是導致遺傳背景差異大的原因之一。兩位點基因型和等位基因與CEU 和YRI 人群比較，存在不同程度的分布差異，這有可能是因為廣西地區(qū)人群CEU和YRI人群與地處不同大洲，地理位置相差甚遠，且隨著生活水平的提高、人口遷移、氣候環(huán)境和飲食習慣以及地方風俗習慣的差異等眾多因素影響，在一定程度上阻礙了基因交流［18］。分析miR-365基因的SNP 在不同地區(qū)人群的分布特點，筆者發(fā)現(xiàn)miR-365 基因在不同地區(qū)和人群間的突變效應存在差異性，這種差異性可能是導致同一疾病在不同背景人群中的易感性不同的原因之一，對人類群體遺傳學的研究可能起非常重要的作用。

綜上所述，本研究初步探討了廣西地區(qū)健康人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G 位點的多態(tài)性分布特征，通過比較發(fā)現(xiàn)在不同種族人群間存在不同程度的差異，本次研究結(jié)果豐富了miR-365基因多態(tài)性在人類群體遺傳學方面的研究，將為其后續(xù)相關(guān)疾病的易感性提供可參考的理論依據(jù)。然而，本研究尚存在不足，例如抽樣樣本量較少且樣本來源單一，可能存在一定的抽樣誤差。因此，后續(xù)我們將加大樣本量進一步驗證分析miR-365基因與疾病的易感性，為群體遺傳學以及相關(guān)疾病的研究提供實驗依據(jù)。