操利超，巴穎，丁世濤，翁琦，盧曉萍，張核子（深圳市核子基因科技有限公司，廣東深圳 518071）

結(jié)腸癌是世界上死亡率最高的惡性腫瘤之一［1］。盡管最近幾年在診斷和治療方面取得了一定的進(jìn)展，但結(jié)腸癌患者的總體預(yù)后仍然很差，主要原因之一是缺乏有效的預(yù)后生物標(biāo)志物［2］。因此，探討結(jié)腸癌有價值的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點是迫切且必要的。由于腫瘤免疫微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）的異質(zhì)性和復(fù)雜性，只有一小部分患者受益于免疫治療。最近，有學(xué)者利用生物信息學(xué)和機器學(xué)習(xí)方法發(fā)現(xiàn)多種類型的免疫相關(guān)生物標(biāo)志物與結(jié)腸癌的預(yù)后相關(guān)［3］。然而，對于TME的分子特征需要進(jìn)一步研究。在本研究中，筆者利用生物信息學(xué)方法篩選出有效的分子標(biāo)志物，構(gòu)建和驗證免疫相關(guān)的預(yù)后模型，并分析TME 特征，以期為尋找結(jié)腸癌新的治療靶點提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)下載和獲取 從 UCSC Xena 平臺（https：／ ／xenabrowser.net／datapages／）下 載 結(jié) 腸 癌 的mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和對應(yīng)的臨床信息，選擇隊列為GDC TCGA Colon Cancer（COAD）作為訓(xùn)練數(shù)據(jù)集，具體樣本信息見表1。在GEO數(shù)據(jù)庫中下載數(shù)據(jù)集GSE39582的基因表達(dá)譜和臨床信息作為驗證數(shù)據(jù)集，具體信息見表2。從ImmPort 數(shù)據(jù)庫（https：／ ／immport.niaid.nih.gov／）下載免疫相關(guān)基因列表，總計 1 509 個。

表1 TCGA數(shù)據(jù)集的具體樣本信息［n（%）］

表2 數(shù)據(jù)集GSE39582的具體樣本信息［n（%）］

1.2 構(gòu)建預(yù)后風(fēng)險模型 利用 R 包 limma 對TCGA數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異基因分析，過濾標(biāo)準(zhǔn)為adjusted P 值小于 0.05 和差異倍數(shù)大于 1.5 倍（｜log2FC｜＞0.585），與免疫基因列表取交集，得到免疫相關(guān)的差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）。利用R包Survival對免疫相關(guān)的差異基因與患者總生存時間（overall survival，OS）進(jìn)行單因子回歸分析，篩選P＜0.05 的基因作為候選預(yù)后因子。通過多因子回歸分析確定每個預(yù)后因子的回歸系數(shù)，建立預(yù)后風(fēng)險評估模型，預(yù)測患者生存率。

公式：風(fēng)險分?jǐn)?shù)＝∑差異基因的回歸系數(shù)χi×歸一化處理后的基因表達(dá)量βi

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 利用 R 包 SurvivalROC 繪制ROC曲線以評估預(yù)后模型的性能。以真陽性率與假陽性率之間的差值最大處作為最佳風(fēng)險評分臨界值，高于臨界值的患者歸為高風(fēng)險評分組，低于臨界值的患者歸為低風(fēng)險評分組，并使用R包Survminer繪制兩組的生存曲線。采用相同的風(fēng)險計算公式對驗證數(shù)據(jù)集GSE39582進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.4 構(gòu)建和驗證列線圖 使用R包rms，通過整合風(fēng)險評分模型和臨床信息，包括年齡、性別和腫瘤分期，構(gòu)建列線圖模型，可視化不同患者特征的預(yù)后價值。通過繪制森林圖展示臨床信息與OS之間的關(guān)系，其中，一致性指數(shù)（C-index）表示列線圖的預(yù)測準(zhǔn)確性。

1.5 估計及比較腫瘤免疫浸潤細(xì)胞類型的構(gòu)成和差異 基于構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險模型，將腫瘤樣本分為高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組，采用CIBERSORT算法分析22種腫瘤浸潤免疫細(xì)胞的比例［4］。通過非配對t檢驗比較高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組之間的免疫圖譜。

1.6 分析腫瘤免疫微環(huán)境的特征 使用 R 包maftools分析和比較高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組的突變譜［5］，并計算TMB值。通過未配對t檢驗統(tǒng)計分析高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組之間TMB 的差異。使用Kaplan-Meier分析風(fēng)險評分與OS 之間的關(guān)聯(lián)。利用Wilcoxon 檢驗比較高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組的免疫檢查點及其配體的mRNA 表達(dá)水平的差異。

2 結(jié)果

2.1 基于訓(xùn)練數(shù)據(jù)集的免疫相關(guān)預(yù)后模型構(gòu)建對訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中的腫瘤樣本和正常樣本的表達(dá)譜進(jìn)行差異性分析，得到571個DEGs。其中，275 個基因上調(diào)，296 個下調(diào)（圖1A）。與免疫基因列表取交集后，得到102 個免疫相關(guān)的DEGs，其中19個基因上調(diào)，83個基因下調(diào)。

通過單因子回歸和多因子回歸分析表明，有6個免疫相關(guān)的 DEGs與OS 相關(guān)（P 值＜0.05），見表3。其中，回歸系數(shù)見圖1B、1D。根據(jù)逐步回歸模型，Akaike信息標(biāo)準(zhǔn)（AIC）為983.38，C 指數(shù)為0.63，見圖1E。

表3 與結(jié)腸癌預(yù)后相關(guān)的基因信息

圖1 鑒定預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因

由圖2A～2F 可知，這6 個免疫相關(guān)的差異基因可作為獨立的預(yù)后因子，均與OS 顯著相關(guān)（P＜0.05）。其中，BMP5的高表達(dá)與良好的預(yù)后顯著相關(guān)，而其他5個基因則相反。

圖2 基因表達(dá)量高低與患者生存狀態(tài)的關(guān)系

2.2 預(yù)后模型的性能評估 基于已構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險模型，將結(jié)腸癌患者分為高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組，其中，cut-off值設(shè)為－0.19。由圖 3A、3B 可知，隨著風(fēng)險評分的增加，生存時間呈縮短的趨勢，且高風(fēng)險評分組的死亡比例（圖3B 右側(cè)的紅點和藍(lán)點比例）比低風(fēng)險評分組高，這與Kaplan-Meier生存分析結(jié)果一致。由圖3D 可知，高風(fēng)險評分患者的OS比低風(fēng)險評分患者預(yù)后較差（P＜0.000 1）。由圖3C可知，基因BMP5在低風(fēng)險組表達(dá)量高，在高風(fēng)險組表達(dá)量低，而其他5個基因趨勢相反。

圖3 訓(xùn)練數(shù)據(jù)集預(yù)后風(fēng)險模型的構(gòu)建

2.3 預(yù)后模型的統(tǒng)計分析 通過繪制ROC曲線和腫瘤分層分析來進(jìn)一步評估預(yù)后風(fēng)險模型的性能。由圖4A可知，ROC曲線下面積（AUCROC）在3年時為 0.668，4 年時為 0.699，5 年時為 0.696。Wilcoxon檢驗表明，較高的風(fēng)險評分與較高的病理分期（P ＝0.000 29）、T 分期（P ＝ 0.000 05）、M 分期（P ＝0.023）、N 分期（P ＝0.001 3）顯著相關(guān)。

圖4 訓(xùn)練數(shù)據(jù)集預(yù)后風(fēng)險模型的統(tǒng)計分析

2.4 預(yù)后模型的驗證 基于構(gòu)建的預(yù)后風(fēng)險模型，在驗證數(shù)據(jù)集GSE39582 中進(jìn)一步驗證。低風(fēng)險評分與良好的預(yù)后顯著相關(guān)（P ＝0.008 1，圖5A），且較高的風(fēng)險評分與較高的病理分期（P ＝0.003 7）、T 分期（P ＝0.047）、M 分期（P ＝0.047）、N分期（P ＝0.032）顯著相關(guān)（圖 5B～5E）。

圖5 驗證數(shù)據(jù)集預(yù)后風(fēng)險模型的統(tǒng)計分析

2.5 構(gòu)建和評估列線圖模型 在列線圖中，每個變量的得分映射到分?jǐn)?shù)軸上，通過計算總分來估算3年、4年和5年的生存概率（圖6A）。由森林圖可以看出，患者特征，包括年齡（＞60 歲）、腫瘤分期（Ⅲ和Ⅳ）和風(fēng)險評分與 OS 顯著相關(guān)（P 值＜0.05，圖6B）。此外，通過繪制校準(zhǔn)曲線以驗證列線圖的性能，可看出預(yù)測曲線接近理想曲線（圖6C ～6E），這表明構(gòu)建的列線圖模型性能良好。此外，該列線圖（C-index：0.75）的預(yù)測準(zhǔn)確性高于風(fēng)險評分模型（C-index：0.63）。

圖6 列線圖模型的構(gòu)建與驗證

2.6 探索結(jié)腸癌TME 基于CIBERSORT算法，估算每例結(jié)腸癌患者中22 種免疫細(xì)胞的比例，并比較高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組間的免疫細(xì)胞比例，發(fā)現(xiàn)有6種免疫細(xì)胞類型間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。其中，CD4 記憶活化 T 細(xì)胞（T cells CD4 memory activated）和Tregs調(diào)控T細(xì)胞（T cells regulatory，Tregs）最為顯著（P＜0.000 1，圖 7A）。由繪制的結(jié)腸癌患者的突變譜可以看出，前20 位顯著突變的基因分別為 APC、TP53、TTN、KRAS、SYNE1、MUC16、PIK3CA、FAT4、RYR2、OBSCN、ZFHX4、DNAH5、PCLO、CSMD3、ABCA13、DNAH11、LRP1B、FAT3、USH2A 和 CSMD1（圖 7B）。通過計算并比較每個樣本的TMB，發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組間無顯著性差異（P ＝0.25，圖 7C），高TMB 與較差患者的 OS 顯著相關(guān)（P ＝ 0.028，圖7D）。利用Wilcoxon 檢驗比較高風(fēng)險評分組和低風(fēng)險評分組間免疫檢查點及其配體的表達(dá)水平，結(jié)果表明，高風(fēng)險評分組 PD-L1（P ＝ 0.001）、PD-1（P ＝0.000 22）和 CTLA-4（P ＝0.000 21）的表達(dá)水平較高（圖7E～7G）。

圖7 結(jié)腸癌腫瘤免疫微環(huán)境特征

3 討論

TME 中的免疫細(xì)胞在腫瘤的進(jìn)展中起著重要作用［3］。研究表明，免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICIs）在結(jié)腸癌免疫治療中具有很大的潛力［6］。然而，由于對TME 特性的理解不足，在一定程度上阻礙了免疫治療的廣泛應(yīng)用。近年來，大量研究鑒定了與結(jié)腸癌診斷和預(yù)后相關(guān)的生物標(biāo)志物［7-8］。然而，為了最大限度地發(fā)揮免疫治療的作用，還需要探索更多可靠的生物標(biāo)志物。

本研究構(gòu)建1 個基于6 個免疫相關(guān)差異基因的結(jié)腸癌預(yù)后風(fēng)險評估模型，該6 個基因分別為BMP5、OXTR、STC2、UCN、GRP 和 AMH。研究表明，GMP5、OXTR、STC2 和 UCN 基因與結(jié)腸癌的預(yù)后顯著相關(guān)［9-12］。BMP5 基因參與 TGF-β ／Smad 信號通路，其表達(dá)與上皮標(biāo)志物呈正相關(guān)，但與間充質(zhì)標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)［13］。同時，BMP5 基因被證實與PI3K-AKT 和 MAPKs 信 號 通 路 相 互 作 用［14］。OXTR基因及其配體催產(chǎn)素（OXT）存在于胃腸系統(tǒng)中，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［15］。AMH基因被證實與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，并可作為槲皮素的靶點，降低結(jié)腸癌引起的死亡率［16］。對于STC2、UCN和GRP基因，還未見其與腫瘤進(jìn)展的相關(guān)性研究。

為了進(jìn)一步探索建立的預(yù)后模型的潛在應(yīng)用價值，筆者分析了訓(xùn)練數(shù)據(jù)集和驗證數(shù)據(jù)集中不同病理分期患者的風(fēng)險評分，結(jié)果表明隨著風(fēng)險評分的增加，其腫瘤分期等級越高，這預(yù)示著建立的預(yù)后模型在腫瘤分期方面有一定的預(yù)測能力。此外，通過系統(tǒng)分析結(jié)腸癌TME 的特征，發(fā)現(xiàn)CD4 記憶活化T 細(xì)胞、Tregs 調(diào)控T 細(xì)胞的免疫浸潤程度和TMB可能是結(jié)腸癌的獨立預(yù)后標(biāo)志。此外，高風(fēng)險評分患者的免疫檢查點及其配體（PD-L1、PD-1 和CTLA-4）的表達(dá)水平較高，表明構(gòu)建的預(yù)后模型能夠為免疫治療提供一定的參考價值。

綜上所述，本研究構(gòu)建了1個性能良好的免疫相關(guān)的結(jié)腸癌風(fēng)險評估預(yù)后模型，并探索其TME特征，這可能有助于結(jié)腸癌患者的預(yù)后風(fēng)險預(yù)測、腫瘤分期預(yù)測和免疫治療。為進(jìn)一步提升預(yù)后模型的預(yù)測性能，本研究基于風(fēng)險評分預(yù)后模型和臨床指標(biāo)（包括年齡、性別、病理分期）構(gòu)建了列線圖模型，使預(yù)后模型的準(zhǔn)確性得到較大提升。然而，本研究構(gòu)建的預(yù)后模型是利用生物信息學(xué)和生物統(tǒng)計學(xué)分析的技術(shù)手段，基于公開的數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析，篩選出的預(yù)測因子的生物學(xué)功能還需要進(jìn)一步的實驗驗證。期望本研究的研究成果能為結(jié)腸癌患者的預(yù)后評估、腫瘤分期預(yù)測和免疫治療提供新的研究方向。