江瑞雪 蔣欣泉 文晉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔修復(fù)科，上海交通大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，國(guó)家口腔醫(yī)學(xué)中心，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上?？谇会t(yī)學(xué)先進(jìn)技術(shù)與材料工程技術(shù)研究中心，上海 200011

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是好發(fā)于中老年人的一種常見的全身性骨骼代謝性疾病，以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，易導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和骨折傾向。OP主要分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其中原發(fā)性O(shè)P約占80%，主要包括絕經(jīng)后和老年性O(shè)P[1]，繼發(fā)性則是繼發(fā)于各種全身性或內(nèi)分泌代謝性疾病的OP。近年來(lái)，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥的患病率有所上升，超過(guò)1/3的50歲及以上人群受到影響[2]。2018 年，基于11個(gè)省(市)44個(gè)縣(區(qū))2萬(wàn)余人的大規(guī)模、多中心流行病學(xué)調(diào)查顯示，OP已經(jīng)成為我國(guó)50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質(zhì)疏松問題尤為嚴(yán)重[3]。在歐盟，OP患者預(yù)計(jì)將從2010年的2 800萬(wàn)上升到2025年的3 400萬(wàn)[4]。隨著人類預(yù)期壽命延長(zhǎng)和人口結(jié)構(gòu)改變(人口老齡化)，OP將成為全球范圍內(nèi)更加嚴(yán)重的公共健康問題[4-6]。

關(guān)于OP的研究(發(fā)病機(jī)制、藥物篩選、防治手段等)都離不開動(dòng)物模型的構(gòu)建和應(yīng)用[7]。理想的OP模型至少需要符合以下幾點(diǎn)[8]：一是簡(jiǎn)便，即建模方法簡(jiǎn)單，周期短，建模過(guò)程具有較強(qiáng)的可控性和可操作性；二是經(jīng)濟(jì)，即建模費(fèi)用適中，可大批量應(yīng)用；三是相似性好，能較好地模擬 OP發(fā)生和發(fā)展的過(guò)程。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐探索，OP研究中模式動(dòng)物種類繁多，造模方法可概括為誘導(dǎo)建模和基因工程建模兩類[9]。最常用的模式動(dòng)物有小鼠和大鼠，而斑馬魚因其特殊結(jié)構(gòu)與生理特征，與嚙齒動(dòng)物的造模周期長(zhǎng)、不便長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)等特性互補(bǔ)，近年來(lái)也成為了OP研究領(lǐng)域的一種常用模式動(dòng)物[10]。

本綜述主要對(duì)目前OP動(dòng)物模型常用動(dòng)物、建模方法進(jìn)行梳理與比較，以及基因工程動(dòng)物在OP研究中的應(yīng)用進(jìn)行整理分析，以期為OP研究領(lǐng)域動(dòng)物模型的構(gòu)建和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供更全面的參考。

1 誘導(dǎo)法建立OP模型

誘導(dǎo)建模最常用的手段是去勢(shì)法，即通過(guò)手術(shù)切除動(dòng)物的卵巢/睪丸來(lái)模擬女性絕經(jīng)后OP或老年男性由于性激素分泌大幅減少而誘發(fā)的老年性O(shè)P。其中，去卵巢大鼠是美國(guó)食品和藥品管理局和WHO推薦的研究絕經(jīng)后OP模型。卵巢切除14 d后脛骨近端干骺端有明顯的骨丟失，30、60 d后股骨頸、腰椎體部分別出現(xiàn)顯著的骨丟失[11]，3月齡大鼠去卵巢后約50 d骨重塑達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，即建立可靠的OP模型[12]。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的OP是最常見的繼發(fā)性O(shè)P類型[13]，服用糖皮質(zhì)激素導(dǎo)致骨形成受損，骨折風(fēng)險(xiǎn)在幾個(gè)月內(nèi)以劑量依賴性方式增加。同理，維甲酸可影響骨代謝，激活破骨細(xì)胞促進(jìn)骨吸收，使骨重建處于骨吸收大于骨形成的負(fù)平衡狀態(tài)[14]。目前糖皮質(zhì)激素和維甲酸誘導(dǎo)OP的研究中，根據(jù)劑量和給藥方式的不同，一般2～6周可成功建模。此外，骨失用亦是導(dǎo)致骨質(zhì)流失和繼發(fā)性O(shè)P的原因之一，故可用懸吊、固定等方式模擬人類運(yùn)動(dòng)功能受限或障礙引起的廢用性骨質(zhì)疏松。

對(duì)目前的誘導(dǎo)建模進(jìn)行歸納，可以分為手術(shù)誘導(dǎo)(卵巢切除術(shù)、甲狀旁腺切除、松果體切除等)、藥物誘導(dǎo)(如維甲酸、糖皮質(zhì)激素等)、飲食誘導(dǎo)(如低鈣、磷、維生素D飲食等)、失用性誘導(dǎo)(如懸尾、固定等)等，常用動(dòng)物包括大鼠、小鼠、兔、羊、豬、狗、斑馬魚和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物。表1總結(jié)了OP常用的誘導(dǎo)建模的動(dòng)物種類及其優(yōu)缺點(diǎn)比較。比起控制單因素建模，部分研究者認(rèn)為聯(lián)合去卵巢與糖皮質(zhì)激素等手段建?？梢赃_(dá)到更優(yōu)效果[15]。因此，研究人員必須綜合考慮研究目的和關(guān)鍵科學(xué)問題，以及每種模式動(dòng)物的優(yōu)缺點(diǎn)建立最適合的OP動(dòng)物模型。

表1 骨質(zhì)疏松常用動(dòng)物建模方法及優(yōu)缺點(diǎn)Table.1 Common animal modeling methods for osteoporosis and their advantages and disadvantages

2 基因工程法建立OP模型

基因工程建模是指通過(guò)基因編輯技術(shù)將外源性基因插入動(dòng)物基因組或?qū)?dòng)物自身基因進(jìn)行突變、敲除、過(guò)表達(dá)等使動(dòng)物具有骨質(zhì)疏松特性，常用動(dòng)物有小鼠和斑馬魚[50]。目前基因工程法建立OP模型仍處于探索階段，部分研究將基因工程技術(shù)與去勢(shì)法相結(jié)合，探究目的基因?qū)τ贠P的影響，從而有助于臨床OP新療法的研究；另一部分研究旨在探究目的基因敲除或過(guò)表達(dá)后對(duì)于骨骼系統(tǒng)的影響，從而致力于OP發(fā)病機(jī)制的探索。

2.1 基因敲除動(dòng)物模型

基因敲除動(dòng)物模型根據(jù)目標(biāo)基因缺失的靶細(xì)胞不同，又分為全身性基因敲除和條件性基因敲除兩種動(dòng)物模型。

2.1.1全身性基因敲除動(dòng)物模型：Priyatha等[51]的研究結(jié)果指出p21敲除(p21-/-)小鼠可以防止去勢(shì)法引起的骨丟失，在非臨界大小的頜骨缺損中與野生型對(duì)照組相比顯示出增強(qiáng)的骨再生。CD73是一種成骨細(xì)胞活化劑和骨骼生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，老齡CD73敲除小鼠骨缺損在骨愈合過(guò)程中表現(xiàn)出延遲的骨再生和顯著減少的骨基質(zhì)沉積，且細(xì)胞增殖和ALP活性紊亂，骨形成和骨吸收平衡失調(diào)，表明CD73的激活可能是改善老年人群骨再生的潛在機(jī)制[52]。Akr1A1敲除小鼠(Akr1A1eGFP/eGFP)也表現(xiàn)出骨發(fā)育異常和OP，并推測(cè)可能是由骨形成受損引起的OP。此外，通過(guò)給予抗壞血酸，Akr1A1敲除小鼠表現(xiàn)出可控制的OP，表明了其作為OP研究的新動(dòng)物模型的可能[53]。

鐵紊亂也被證實(shí)與OP之間存在某種相關(guān)性，大量研究著眼于此開展。Zhou等[54]發(fā)現(xiàn)Irp2敲除小鼠顯示出骨密度降低、骨小梁質(zhì)量和結(jié)構(gòu)受損，骨鐵缺乏和肝鐵超載，與野生型小鼠相比表現(xiàn)出更為嚴(yán)重的OP。Lin 等[55]通過(guò)鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1基因

(fpn1)突變體Wehtp85c斑馬魚證明了缺鐵可能通過(guò)成骨細(xì)胞的分化和礦化影響骨形成。姜宇等[56]通過(guò)CRISPR/CAS9技術(shù)敲除鐵調(diào)素基因建立了體內(nèi)鐵蓄積的斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)成骨基因表達(dá)降低，骨發(fā)育遲緩，骨量減低。Zhang等[57]、蘇幸[58]、Yu等[59]分別通過(guò)CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)在斑馬魚中產(chǎn)生了ATP6V1H功能缺失突變體、wnt16-/-突變體、nr3c1-/-突變體，證明了相應(yīng)目的基因的敲除影響斑馬魚骨骼發(fā)育，為基因工程法建立斑馬魚OP模型提供了新的思路。

2.1.2條件性基因敲除動(dòng)物模型：MK生長(zhǎng)因子(促血小板生成素)在調(diào)節(jié)骨骼穩(wěn)態(tài)和造血方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，Alvarez等[60]通過(guò)刪除Mpl基因編碼外顯子3構(gòu)建了條件敲除小鼠(Mplf/f；PF4cre)，其中Mpl，主要的MK生長(zhǎng)因子受體被特異性敲除，導(dǎo)致了股骨中段的BV/TV顯著增加，骨髓基質(zhì)細(xì)胞亦大量增加。毛峰峰[61]利用Cre-loxP系統(tǒng)構(gòu)建了成骨細(xì)胞特異性TGFBR2基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因小鼠早期生長(zhǎng)延遲及骨密度、骨體積、骨形成速率明顯降低，血清ALP水平明顯下降，最終發(fā)生低轉(zhuǎn)換率的OP。Wu等[62]發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)中m6A甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3的條件性敲除會(huì)誘導(dǎo)OP的病理學(xué)特征。同時(shí)他們還構(gòu)建了條件性敲入Mettl3的模型小鼠，與去勢(shì)的模型鼠相比，Mettl3過(guò)表達(dá)可預(yù)防雌激素不足引起的OP。Lee等[63]首次報(bào)道在小鼠中，單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性敲除破骨細(xì)胞前體中受體相互作用蛋白140(RIP140)會(huì)導(dǎo)致松質(zhì)骨減少，破骨細(xì)胞活性增加，成骨細(xì)胞活性降低，骨形成減少。

2.2 基因過(guò)表達(dá)動(dòng)物模型

Nancy Karam等[64]發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)在骨骼和關(guān)節(jié)發(fā)育中十分重要的同源盒轉(zhuǎn)錄因子配對(duì)樣同源結(jié)構(gòu)域1(PITX1)的轉(zhuǎn)基因mCol1α1-Pitx1小鼠會(huì)表現(xiàn)出嚴(yán)重的老年性O(shè)P表型，其骨量、骨密度和生物力學(xué)強(qiáng)度顯著降低，提示其作為老年性O(shè)P動(dòng)物模型的可能。核因子κB受體活化因子配體(RANKL)在一系列退行性骨疾病的由破骨細(xì)胞誘導(dǎo)的骨吸收中起關(guān)鍵作用。在Vagelis Rinotas等[65]的研究中，他們產(chǎn)生了攜帶人類RANKL基因組區(qū)(huRANKL)的轉(zhuǎn)基因小鼠(TghuRANKL)，實(shí)現(xiàn)了不同程度的RANKL過(guò)表達(dá)，同時(shí)表達(dá)不同量級(jí)RANKL的轉(zhuǎn)基因小鼠表現(xiàn)出有差異的OP。Jochen Schulze等[66]發(fā)現(xiàn)在成骨細(xì)胞中特異性過(guò)度表達(dá)Krm2的Col1a1-Krm2轉(zhuǎn)基因小鼠會(huì)發(fā)展為嚴(yán)重的OP，小梁骨體積和小梁數(shù)量減少，生物力學(xué)穩(wěn)定性降低，骨脆性增加，骨形成受損，骨吸收增加。Kiyoshi Hiramatsu等[67]進(jìn)行的一項(xiàng)旨在檢測(cè)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)在體內(nèi)致病作用的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)度表達(dá)GGT的轉(zhuǎn)基因小鼠通過(guò)加速破骨細(xì)胞的生成和骨吸收導(dǎo)致骨質(zhì)減少，并導(dǎo)致OP的形成，亦為OP建模提供了新思路。

2.3 其他

Yin等[68]以重組腺病毒為載體，將AD-APN-EGFP注射到去勢(shì)大鼠股骨遠(yuǎn)端前內(nèi)側(cè)表面構(gòu)建的骨缺損處，隨后植入鈦種植體，證實(shí)了脂聯(lián)素(APN)的過(guò)表達(dá)會(huì)引起OCN、Runx2和ALP等成骨標(biāo)志物表達(dá)的明顯升高，且去勢(shì)大鼠的骨整合和植入體穩(wěn)定性顯著增加。Liu等[69]、Huang等[70]、Li等[71]分別用Ad-hWnt10b、GPNMB(糖蛋白非黑色素瘤克隆B)和骨膜蛋白(Postn)轉(zhuǎn)染的方法，證明了在去勢(shì)條件下以上策略能夠在一定程度上促進(jìn)骨再生，從而可能作為治療OP的潛在手段，為OP骨再生提供了一種新的治療思路。

邊麗璇[72]通過(guò)糖皮質(zhì)激素和模擬微重力效應(yīng)處理斑馬魚早期胚胎建立OP模型，以Sal B和AF作為激活劑上調(diào) Nrf2 基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Nrf2過(guò)表達(dá)可緩解骨代謝失衡。Lu等[73]的一項(xiàng)研究使用了shRNA介導(dǎo)的Pax2重組慢病毒(shPax2)轉(zhuǎn)染小鼠致密骨來(lái)源的MSC，建立了一個(gè)異位骨形成模型。結(jié)果提示Pax2在骨相關(guān)疾病的病理生理學(xué)中具有一定的作用，抑制Pax2的功能可能會(huì)損害新骨形成。

綜上所述，OP動(dòng)物模型的建立包括誘導(dǎo)建模和基因工程建模。誘導(dǎo)建模常用去勢(shì)法和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)。而基因工程建模目前多為全身性基因敲除動(dòng)物模型和基因過(guò)表達(dá)動(dòng)物模型，條件性基因敲除動(dòng)物模型以及基因敲入動(dòng)物模型研究較少。而基因過(guò)表達(dá)動(dòng)物模型多與去勢(shì)法相結(jié)合，在OP已建立的情況下通過(guò)基因過(guò)表達(dá)手段等進(jìn)行相應(yīng)研究。隨著基因編輯技術(shù)的日益完善、基因工程動(dòng)物模型的培育成熟，OP發(fā)病機(jī)制及其相關(guān)信號(hào)通路研究將有望為臨床治療和疾病預(yù)防提供更多新策略。