劉 俊，楊作豐，張皓淳，魏 澍，陳揚(yáng)揚(yáng)，吳曉傲，王宏燕，龐學(xué)敏，董 娜，劉金玲

（1.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧沈陽 110015；2.康平新望農(nóng)牧有限公司，遼寧沈陽 110500；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110161；4.沈陽市農(nóng)業(yè)綜合行政執(zhí)法隊，遼寧沈陽 110031）

自2018 年非洲豬瘟（ASF）在我國首次暴發(fā)以來，大量生豬染疫死亡或被撲殺，造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。ASF 目前尚無可用疫苗，防控難度大[1]。非洲豬瘟病毒（ASFV）是一種雙鏈DNA 病毒，粒子直徑大小為260 nm，具有雙層脂質(zhì)囊膜結(jié)構(gòu)，基因組大小為170～190 kb，pH 耐受范圍為3.9～11.5，在低溫冷凍環(huán)境下可以存活數(shù)年，但經(jīng)56 ℃處理70 min、60 ℃處理20 min 或80 ℃處理3 min 可被滅活[2]。豬偽狂犬病毒（PRV）也是一種雙鏈DNA 病毒，粒子直徑大小為180 nm，具有脂質(zhì)單層囊膜結(jié)構(gòu)，基因組大小為150 kb，pH 耐受范圍為4～12，55～60 ℃處理30～50 min 或80 ℃處理3 min 可被滅活?？梢夾SFV 和PRV 在生物學(xué)特性和理化特性方面均具有極高的相似度。由于對ASFV 的研究需要在國家授權(quán)的相應(yīng)級別生物安全實(shí)驗室中才能進(jìn)行，因此將PRV 作為ASFV臨床研究標(biāo)識物成為研究者們的普遍選擇[3]。

精準(zhǔn)清洗消毒是控制ASF 傳染源、切斷傳播途徑和保護(hù)易感動物的關(guān)鍵措施[4]。對運(yùn)輸車輛進(jìn)行消毒是疫情應(yīng)急處置及日常防控工作的重要環(huán)節(jié)[5]，而碾壓消毒墊和駛過消毒池是運(yùn)輸車輛較常用的兩種消毒方式。為驗證以上兩種消毒方式對ASFV 的殺滅效果，本研究采用PRV 疫苗稀釋液作為ASFV 替代標(biāo)識物，噴灑車輪模擬ASFV 污染，在車輛碾壓消毒墊和駛過消毒池后不同時間點(diǎn)進(jìn)行車輪采樣檢測。本試驗對運(yùn)輸車輛碾壓消毒墊和駛過消毒池兩種方式的消毒效果進(jìn)行了評價，以期為優(yōu)化ASF 疫情應(yīng)急處置方案和日常消毒防控措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

杜邦衛(wèi)可（主要成分為過硫酸氫鉀三鹽復(fù)合物，稀釋度1:200），購自杜邦衛(wèi)可動物保健公司；火堿（化學(xué)成分為氫氧化鈉，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%），購自內(nèi)蒙古君正化工有限責(zé)任公司；“喜可凈”PRV活疫苗（主要成分為PRV Bartha K-61 株，稀釋度為1:100），購自西班牙海博萊生物大藥廠。

試驗用車、消毒墊（麻袋）、消毒池（長15 m、寬4 m、深30 cm）、噴霧設(shè)備，由康平新望農(nóng)牧有限公司提供或建造；ATP 清洗消毒效果檢測儀、采樣棉拭子、一次性培養(yǎng)皿、一次性涂抹棒、采樣管、PBS 樣品緩沖液、塑料薄膜，由遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心提供。

ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、2×TaqPlus Master Mix，購自南京諾唯贊生物科技有限公司；無菌除酶水，購自索萊寶公司；pBM16A Toposmart 克隆試劑盒，購自博邁德生物公司；DH5α 感受態(tài)，購自全式金生物公司；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購自廣東環(huán)凱微生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 消毒墊消毒試驗 試驗車輛經(jīng)過充分清洗，經(jīng)ATP 生物熒光檢測儀檢測RUL 值小于50，表示達(dá)到試驗可接受水平；試驗車輛車頭前鋪設(shè)20 m長的潔凈厚塑料薄膜，在薄膜上沿車輪碾壓路線鋪設(shè)15 m長麻袋，噴灑1:200稀釋的杜邦衛(wèi)可消毒劑，直至充分浸潤。在車輛一側(cè)每個車輪的底部均勻選擇6 個5 cm×5 cm 的采樣點(diǎn)并用著色劑標(biāo)記，用1:100 稀釋的PRV 活疫苗均勻噴灑整個車輪；開動車輛緩慢碾壓浸潤杜邦衛(wèi)可消毒液的麻袋，并在碾壓后0、1、2、3、4、5 min 對每個車輪的標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行采樣，同一車輪的樣品混樣裝入同一采樣管（含10 mL PBS）內(nèi)，4 ℃送至實(shí)驗室進(jìn)行檢測。

1.2.2 消毒池消毒試驗 試驗車輛和消毒池經(jīng)過充分清洗，經(jīng)ATP 生物熒光檢測儀檢測RUL 值小于50，表示達(dá)到試驗可接受水平；車輛一側(cè)每個車輪的側(cè)面均選擇6 個5 cm×5 cm 的采樣點(diǎn)并用著色劑標(biāo)記，用1:100 稀釋的PRV 活疫苗均勻噴灑4 個車輪；開動車輛緩慢駛過注滿2%火堿消毒液的消毒池，并在駛過消毒池后0、2、5、10 min對每個車輪的標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行采樣，同一車輪的樣品混樣裝入同一采樣管（含10 mL PBS）內(nèi)，4 ℃送至實(shí)驗室進(jìn)行檢測。

1.3 樣本檢測

1.3.1 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 以PRV Bartha K-61 株gB基因為靶序列設(shè)計1對引物，優(yōu)化建立了1 套SYBR Green 染料熒光定量PCR檢測方法。上游引物F：5'-GTCTGTGAAGCGGTTCGTGAT-3'；下游引物R：5'-ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC-3'。反應(yīng)體系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL，無菌除酶水3.6 μL，模板1.0 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各0.2 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，共40 個循環(huán)。

1.3.2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備 以PRV Bartha K-61 株gB基因為靶序列另外設(shè)計1 對引物。上游引物F：5'-CTGGCCTCGGACGTCTT-3'；下游引物R：5'-GCGGTCACCTTGTGGTTG-3'。目標(biāo)擴(kuò)增片段包含熒光定量PCR 檢測方法的擴(kuò)增片段。反應(yīng)體系：2×TaqPlus Master Mix 50 μL，無菌除酶水32 μL，模板10 μL，上下游引物（10 pmol/μL）各4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，58℃ 20 s，72℃ 1 min，共30 個循環(huán)；72℃ 10 min。以PRV Bartha K-61 株DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后回收目的片段連接到pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)。挑選鑒定正確的陽性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍倍比稀釋，采用建立的SYBR Green 染料熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，每種梯度標(biāo)準(zhǔn)品做3 個重復(fù)，以拷貝數(shù)的次方值為橫坐標(biāo)，Ct 值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 PRV 核酸檢測 對樣本拭子進(jìn)行渦旋震蕩洗脫，各取同一采樣時間點(diǎn)（消毒墊模式0、1、2、3、4、5 min；消毒池模式0、2、5、10 min）4個車輪的洗脫液50 μL 混合成200 μL 的混合洗脫液，提取樣本DNA，采用建立的熒光定量PCR 方法進(jìn)行檢測，以滅菌水為陰性對照，“喜可凈”PRV活疫苗為陽性對照，每個樣本做3 個重復(fù)。

1.3.4 細(xì)菌培養(yǎng)計數(shù) 對樣本拭子進(jìn)行渦旋震蕩洗脫，各取同一采樣時間點(diǎn)（消毒墊模式0、1、2、3、4、5 min；消毒池模式0、2、5、10 min）4 個車輪的洗脫液100 μL 混合成400 μL 的混合洗脫液；分別取100 μL 混合洗脫液均勻涂布于麥康凱瓊脂培養(yǎng)皿上，以滅菌水為陰性對照，車輪駛過消毒墊和消毒池前4 個車輪棉拭子樣本PBS 洗脫液為陽性對照，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h 后采用平板菌落計數(shù)法進(jìn)行菌落計數(shù)，每個樣本做3 個重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備與檢測方法建立

經(jīng)測定，標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)為3.968×106copies/μL，通過10 倍倍比稀釋至3.968×102copies/μL，采用建立的SYBR Green染料熒光定量PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=-3.299 9x+36.965，R2=0.993，R2＞0.99 表示所建方法和線性回歸方程有效（表1 和圖1）。

表1 10 倍梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR 檢測結(jié)果

2.2 碾壓消毒墊消毒效果

試驗條件下車輛碾壓駛過消毒墊后0、1、2、3、4、5 min，車輪PRV 檢測的Ct 值隨時間增加而增加，將Ct 值分別帶入線性回歸方程y=-3.299 9x+36.965，得到樣本中病毒拷貝數(shù)的次方值（表2）；車輛碾壓駛過消毒墊后0、1、2、3、4、5 min，車輪可被檢測的菌落數(shù)呈下降趨勢（表3）。結(jié)果說明，車輛碾壓消毒墊（含衛(wèi)可）對PRV 和細(xì)菌均有殺滅作用，殺滅效果隨時間增加而增強(qiáng)，但消毒墊模式消毒后5 min 仍無法殺滅所有PRV，細(xì)菌殺滅率為92.5%。鑒于PRV 與ASFV 在生物學(xué)特性和理化特性上具有高度相似性，因此推定在相同試驗條件下杜邦衛(wèi)可消毒液對ASFV 具有相似的殺滅效果。

表2 消毒墊方式PRV 殺滅效果

表3 消毒墊方式細(xì)菌計數(shù)結(jié)果

2.3 駛過消毒池消毒效果

試驗條件下車輛駛過消毒池后0、2、5、10 min，車輪PRV 檢測的Ct 值隨時間增加而增大，可被檢測的PRV 含量呈逐漸下降趨勢，駛過消毒池后10 min 未檢測到PRV 核酸，將Ct 值帶入線性回歸方程y=-3.299 9x+36.965，得到樣本中病毒拷貝數(shù)的次方值（表4）；車輛駛過消毒池后0、2、5、10 min，車輪可被檢測的菌落數(shù)呈下降趨勢，5 min 后殺菌率為94.6%，10 min 后殺菌率達(dá)到98.3%（表5）。結(jié)果說明，車輛駛過消毒池（含火堿）對PRV 和細(xì)菌均有殺滅作用，殺滅效果隨時間增加而增強(qiáng)，駛過消毒池后10 min 即可有效殺滅所有PRV。鑒于PRV 與ASFV 在生物學(xué)特性和理化特性上具有高度相似性，因此推定在相同試驗條件下火堿對ASFV 具有相似的殺滅效果。

表4 消毒池方式PRV 殺滅效果

表5 消毒池方式細(xì)菌計數(shù)結(jié)果

3 討論

本研究經(jīng)過試驗確定了兩種消毒方法對ASFV和細(xì)菌均能起到有效殺滅作用，但殺滅效果受消毒時間長短影響較大。陳家锃[6]從消毒劑作用機(jī)理方面歸納了影響ASFV 消毒效果的七大因素，發(fā)現(xiàn)消毒時間不足是ASFV 消毒中最常見的誤區(qū)之一，每種消毒劑在特定濃度下都有最短殺菌時間，消毒作用時間必須長于最短消菌時間才能起到消毒作用。本試驗結(jié)果顯示，碾壓消毒墊方式在消毒后5 min 仍能檢測到病毒核酸，也無法殺滅所有細(xì)菌，提示一次性無停留短時碾壓消毒墊方式對車輪攜帶病毒和細(xì)菌的殺滅效果有限，與相關(guān)類似研究結(jié)果具有一致性。建議在使用消毒墊方式消毒時，在消毒劑有效使用期內(nèi)延長車輛在消毒墊上的停留時間或使用多組消毒墊間隔組合等方式延長病毒和細(xì)菌與消毒劑的作用時間，確保消毒效果。本試驗用消毒池長15 m，車輪在消毒池中的行進(jìn)長度大于5個輪胎周長，因此輪胎攜帶的病毒和細(xì)菌與消毒液接觸時間較長，但基層多數(shù)消毒池實(shí)際長度達(dá)不到此標(biāo)準(zhǔn)，建議通過往復(fù)行駛多次等方法延長車輛駛過消毒池的時間來增強(qiáng)消毒效果。

“杜邦衛(wèi)可”溶解于水后會發(fā)生鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，持續(xù)產(chǎn)生小分子自由基、次氯酸、新生態(tài)氧和活性氧衍生物，通過氧化和氯化反應(yīng)使病原體蛋白變性，產(chǎn)生的羥基自由基可作用于病原體DNA 磷酸二酯鍵，干擾其合成，從而破壞殺滅病原微生物[7-8]。余婷等[9]研究“杜邦衛(wèi)可”對ASFV 的消毒殺滅效果發(fā)現(xiàn)，在1:800 的稀釋比例下，衛(wèi)可消毒劑對ASFV 仍然有效；南文龍等[10]也證實(shí)過硫酸氫鉀類消毒劑對ASFV 熒光定量PCR 檢測Ct 值影響顯著。火堿屬于強(qiáng)堿類，火堿溶液作用于病原體可以使其蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生變性和降解。綜上可知，杜邦衛(wèi)可和火堿均能對ASFV 核酸產(chǎn)生降解作用，而以被降解的核酸為模板會直接影響到熒光定量PCR 的Ct 值。因此，應(yīng)用SYBR Green 熒光定量PCR 方法評價“杜邦衛(wèi)可”和火堿的消毒效果是可行的[11]。如王巍等[12]發(fā)現(xiàn)，針對ASFV 消毒效果的評價，應(yīng)該在確定ASFV 滅活方法的機(jī)理基礎(chǔ)上，通過分析ASFV 基因組結(jié)構(gòu)和序列特點(diǎn)，挖掘ASFV 的代謝脆弱區(qū)進(jìn)行核酸檢測。該論述為尋找更加科學(xué)的ASFV 消毒效果評價方法提供了新思路，對本研究方法改進(jìn)提供了科學(xué)借鑒。