趙以恒，崔顥月，郭 鑫，羅健雅，黃紫貝，陳詩涵，劉金彪，王海燕，劉文博，4

（1.揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；3.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；4.揚州大學(xué)動物疾病檢測與技術(shù)服務(wù)中心，江蘇揚州 225009）

豬附紅細胞體?。╡perythrozoonosis）是由豬附紅細胞體（Eperythrozoon suis）引起的一種以貧血、黃疸、發(fā)熱為特征的人獸共患病，1932 年被美國首次報道[1]。豬附紅細胞體病發(fā)生后往往會大面積流行，嚴重時會造成大批仔豬死亡，商品豬生產(chǎn)性能下降，導(dǎo)致嚴重經(jīng)濟損失。研究證實：造成豬附紅細胞體傳播的主要因素是對豬進行手術(shù)時造成的腸胃道暴露以及群內(nèi)爭斗撕咬[2]；附紅細胞體還可以垂直傳播[3]。溶血性葡萄球菌是一種球形的革蘭氏陽性菌，無鞭毛和莢膜，不產(chǎn)生芽孢，在血平板上具有溶血性[3]，可引起皮膚化膿性炎癥，也可引起敗血癥、菌血癥以及內(nèi)臟器官的嚴重損傷[4]。生豬養(yǎng)殖過程中多種病原混合感染情況十分常見[5]，如仔豬巴氏桿菌與大腸桿菌的混合感染[6]、豬附紅細胞體與豬細小病毒的混合感染[7]、豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌的混合感染[8]等?；旌细腥静±呐R床癥狀及病理變化復(fù)雜，難以確診，無法及時采取針對性防控措施，對養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展和疫病防控帶來了不小的挑戰(zhàn)。目前，豬附紅細胞體與溶血性葡萄球菌混合感染病例尚未見報道。本研究對一大型豬場發(fā)生的附豬紅細胞體和溶血性葡萄球菌混合感染疫情的診治進行系統(tǒng)梳理，以期為類似豬病的診療提供參考。

1 疫情概況

2020 年8 月底開始，江蘇省某大型豬4 個場區(qū)5 個欄舍的仔豬，在斷尾閹割后2～3 d 出現(xiàn)精神沉郁、眼睛睜不開、后肢無力、觸碰尖叫、皮膚脫皮等癥狀，隨后出現(xiàn)急性死亡；死后鼻鏡、陰戶、腹部發(fā)紫，全身黃染。每批次（20 個欄舍）約有2個欄舍出現(xiàn)這種急性死亡。發(fā)病后使用“易速達”（頭孢噻呋注射液）進行全群治療，同時使用阿莫西林粉劑兌水供仔豬飲用，發(fā)病嚴重欄位注射“易速達”，后再次注射阿莫西林注射液，但效果并不明顯。各場區(qū)豬群批次、發(fā)病欄舍及死亡仔豬數(shù)如表1 所示。

表1 各場區(qū)仔豬死亡情況

為確診病因，2020 年9 月8 日，采集發(fā)病仔豬口、鼻、肛門拭子及內(nèi)臟組織樣品送第三方實驗室，通過熒光定量PCR 方法進行相關(guān)病毒檢測，包括豬瘟病毒（CSFV）、非洲豬瘟病毒（ASFV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬流感病毒（SIV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等，結(jié)果均為陰性，檢出新型豬圓環(huán)病毒（PCV3），分離出副傷寒沙門氏菌、馬鏈球菌。

繼而采集A 場區(qū)有臨床癥狀仔豬的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺臟，以及結(jié)腸（包括結(jié)腸系膜）、回腸、大腦、小腦、腦干、腸系膜淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、扁桃體、胸段脊髓、腰段脊髓、大腿肌肉等進行病理組織學(xué)檢測，結(jié)果見小腸絨毛輕微萎縮，其中一個肝臟呈局灶性壞死及炎癥。僅根據(jù)病理組織學(xué)檢測無法做出明確診斷。

通過與一線工作人員交流了解到，發(fā)病都是在斷尾和閹割之后短時間內(nèi)發(fā)生，因而推測可能是傷口感染或者疼痛激發(fā)應(yīng)激并繼發(fā)感染引起的。對臨床樣本通過測序檢測出不同的細菌，但由于不是細菌分離后的全基因測序，很難通過高通量測序結(jié)果確定具體病因。但因檢測出沙門氏菌片段，懷疑是沙門氏菌引起的全身性敗血癥，且其中一個肝臟呈局灶性炎癥和壞死，這也符合副傷寒沙門氏菌感染產(chǎn)生的病變。雖然PCR 檢測出PCV3，但在組織中未見到有心肌炎和血管炎等符合PCV3 感染的病變，所以也不確定是由PCV3 導(dǎo)致的死亡。與外籍顧問交流后，排除了上述病因，懷疑為馬鏈球菌感染所致，于是采取了初步處理措施（表2），但未見明顯效果。發(fā)病及死亡情況見圖1。

表2 初步處理措施

2 剖檢和臨床檢查

2020 年10 月底，對該場送檢的4 頭病死豬進行剖檢發(fā)現(xiàn)，病死豬皮膚黏膜出現(xiàn)大量紫斑、黃染（圖2-A），淋巴結(jié)腫大、出血（圖2-B），脾臟梗死（圖2-C），肺臟嚴重充血、淤血（圖2-D），肺門淋巴結(jié)呈索狀（圖2-E），心冠脂肪黃染（圖2-F），肝臟、心臟、脾臟等內(nèi)臟器官均發(fā)生出血、淤血等。

3 實驗室檢測

3.1 主要材料

3.1.1 主要試劑 血瓊脂培養(yǎng)基、綿羊血平板，均購自杭州微生物試劑有限公司；瓊脂粉、氯化鈉，均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；PCR 試驗所需引物，購自上海生工生物工程有限公司；Diff-Quik 染色液，購自南京建成科技有限公司；TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司。

3.1.2 主要儀器 SW-CJ-IL 超凈工作臺，蘇州凈化工作臺設(shè)備有限公司產(chǎn)品；PCR 儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品；電熱恒溫鼓風干燥箱、GNP9080 電熱恒溫生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；DYCP-31DN 凝膠電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；分光光度儀，德國 Eppendorf公司產(chǎn)品；CX21FS1C 奧林巴斯CX 系列生物顯微鏡，奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司產(chǎn)品；酶標儀（微孔板檢測系統(tǒng)），美國 Bio Tek 公司產(chǎn)品。

3.2 檢測方法

3.2.1 心血涂片染色鏡檢 無菌采集患病仔豬心血，按常規(guī)方法制作血涂片，Diff-Quik 染色后觀察。具體步驟：將血涂片靜置等待自然風干；將干燥后的血涂片浸入固定液a，10～15 s，用吸水紙吸去多余溶液；將涂片浸入染液1，染色10 s，用吸水紙吸去多余染液；將涂片浸入染液2，染色5 s，用吸水紙吸去多余染液；將涂片浸入流動蒸餾水中，清洗10～15 次，洗去多余染液，將玻片垂直豎立，使其自然風干；染色后的血涂片完全干燥后，放入顯微鏡下觀察并拍照。

3.2.2 臟器觸片染色鏡檢 采集病死豬的肝臟、脾臟制作觸片，染色后觀察。Diff-Quik 染色鏡檢步驟同3.2.1。

3.2.3 細菌分離培養(yǎng) 將采集的病死仔豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和淋巴結(jié)等病料進行編號后，嚴格按照無菌操作要求劃線接種于血瓊脂平板上，倒置于厭氧培養(yǎng)罐中，37 ℃條件下在恒溫箱中培養(yǎng)24 h，查看菌株生長情況及菌落形態(tài)特征，挑取優(yōu)勢單個菌落繼續(xù)傳代，在血瓊脂平板中進行純培養(yǎng)，用于種類鑒定。

3.2.4 病原鑒定 將采集的心血樣本及傳代得到的病原菌，按照TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒說明書步驟提取基因組DNA。按照寶生物工程（大連）有限公司所提供的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit 的方法進行PCR 擴增。將擴增得到的16S rRNA 基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。用于序列擴增的反應(yīng)體系：模板DNA 50～100 ng，PCR預(yù)混劑25.0μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，用16S-free H2O 補至50.0 μL；陽性對照取1.0 μL 的Positive Control DNA 作為模板。擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，50～55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，30 個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。將獲得的陽性樣本PCR 擴增產(chǎn)物使用切膠回收試劑盒（Code No.9762）回收后，送至南京金斯瑞生物科技公司進行DNA 測序（上游引物：5'-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'；下游引物：5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'）。將所測DNA 序列與GenBank 中的已知序列進行同源性比較，以判定檢測細菌種類。

3.2.5 豬附紅細胞體PCR 檢測 參照標準DB31/T 600—2012 中的PCR 檢測方法，對樣品進行附紅細胞體核酸檢測，使用KingFisher? Flex 全自動核酸提取儀及愛森磁珠法總核酸提取試劑盒，提取送檢樣品DNA 后進行PCR 擴增。

4 結(jié)果

4.1 心血涂片染色鏡檢

病豬1：可見多數(shù)紅細胞發(fā)生變形，呈星芒狀、鋸齒狀、菜花狀等，部分紅細胞破裂溶解（圖3-A）。

病豬2：與病豬1 相比更加嚴重，可見紅細胞幾乎全部溶解破裂，嚴重變形，失去其原有雙凹形狀，邊緣不整齊，呈刺球狀、鋸齒狀等不規(guī)則形狀；紅細胞表面附有大量形狀不規(guī)則的藍紫色顆粒，經(jīng)鑒定為附紅細胞體（圖3-B）。

4.2 臟器觸片染色鏡檢

病豬2 脾臟觸片（圖4-A）與肝臟觸片（圖4-B）Diff-Quik 染色后鏡檢結(jié)果顯示：視野中可見大量球形與圓形藍紫色的細菌，無莢膜，無鞭毛。

4.3 分離培養(yǎng)與形態(tài)觀察

在37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h 后，腦、肝臟、淋巴結(jié)中均分離到細菌，血平板出現(xiàn)表面隆起、濕潤光滑的淡黃或檸檬黃葡萄串狀圓形小菌落，在血瓊脂培養(yǎng)基上呈β 溶血（圖5-A）。挑取優(yōu)勢單個菌落至血瓊脂培養(yǎng)基，繼續(xù)傳代厭氧培養(yǎng)，仍可見大量光滑、濕潤的淡黃色葡萄串狀溶血性菌落（圖5-B）。

4.4 細菌16S rRNA 基因序列鑒定

將分離純化細菌PCR 擴增得到的16S rRNA測序結(jié)果在NCBI 里進行BLAST 分析。結(jié)果顯示，本試驗病料中分離細菌的16S rRNA 擴增產(chǎn)物核苷酸序列與GenBank 中公布的溶血葡萄球菌同源性約為99.9%，證明該分離菌為溶血葡萄球菌，GenBank 登錄號為MZ778798。

4.5 豬附紅細胞體PCR 檢測

參照標準DB31/T 600—2012[9]中 的PCR 檢測方法，對樣品進行附紅細胞體核酸檢測，使用KingFisher? Flex 全自動核酸提取儀及愛森磁珠法總核酸提取試劑盒提取送檢樣品DNA，結(jié)果如圖6 所示，陰陽性對照成立，送檢樣品出現(xiàn)396 bp 特征條帶，判為陽性。將測序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫進行比對，確認送檢血樣中的致病菌為豬附紅細胞體。

5 治療和防控

該豬場在疫情未被確診時，全群仔豬斷尾閹割時肌注“倍扶欣”；發(fā)病后，發(fā)病單元全群肌注“易速達”，同時使用阿莫西林粉劑兌水，但效果不明顯。更換阿莫西林注射液后，效果也不明顯；更換磺胺、青霉素治療，仔豬酸化劑飲水，效果仍不明顯。在確診為豬附紅細胞體及溶血性葡萄球菌混合感染后，選擇針對附紅細胞體和葡萄球菌的強力霉素或磺胺六甲氧拌料，豬群注射“血蟲凈”，進行全群給藥治療，并建議豬場采取加強消毒，及時隔離并淘汰病豬死豬等措施。在采取措施5 d 后，從養(yǎng)殖企業(yè)得到反饋，病情得到有效控制，并計劃用金霉素對下一批次仔豬進行保健，斷尾閹割時再注射土霉素。

6 討論

近年來，我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展越來越迅速。集約化養(yǎng)殖方式極大提高了生產(chǎn)效率，但環(huán)境和群體中病原體的大量存在易造成混合感染，導(dǎo)致疫病暴發(fā)。一旦發(fā)病，疾病的診斷就顯得尤為重要。而常規(guī)措施的效果常不理想，因此在確診前應(yīng)嚴格遵守傳染病防控原則，切斷傳播途徑，并且盡快找出傳染源，對癥下藥。此次江蘇省某豬場疫病暴發(fā)，通過病毒學(xué)和細菌學(xué)檢測未能得到及時有效的診斷，而血液涂片染色鏡檢法對血液性疾病的診斷起到了重要作用[10]，由此可見，經(jīng)典檢測方法在動物疫病防控中仍然有著很大作用。豬場長期在飼料中添加抗生素或發(fā)病時濫用廣譜抗生素等使得病原菌產(chǎn)生了耐藥性[11]。在臨床病例治療中，應(yīng)根據(jù)病原細菌鑒定結(jié)果進行藥敏試驗，再根據(jù)藥敏試驗結(jié)果給藥，采取聯(lián)合用藥或交替使用敏感藥物，以達到理想的治療效果。

該次疫情的診斷為類似混合感染的診療提供了很好的借鑒，以下幾個方面的診療總結(jié)，可參考應(yīng)用于動物疫病防控中。

（1）病豬隔離與淘汰。豬群中出現(xiàn)發(fā)病個體時，要及時對同豬群進行隔離，對病死仔豬尸體必須進行深埋或焚燒等無害化處理，對未發(fā)病豬體表噴灑1%敵百蟲液或其他殺蟲劑，及時殺滅蚊蟲等節(jié)肢動物傳播媒介[12-13]。

（2）加強場舍消毒。消滅散播在外界環(huán)境中的病原體意義重大。平時應(yīng)加強消毒，每周1～2 次，選用廣譜類消毒藥[14]，有發(fā)病個體的豬舍應(yīng)使用2%氫氧化鈉進行嚴格消毒。同時，在每次引種進入棚舍之前，都需要進行全面徹底的清掃消毒，對于消毒死角，可用清水沖洗后再噴灑2%氫氧化鈉。在場舍條件允許的情況下，應(yīng)在場內(nèi)實施熏蒸消毒，充分殺滅環(huán)境中的病原微生物。

（3）減少病原傳播途徑。養(yǎng)殖場應(yīng)嚴格采用全進全出的飼養(yǎng)方式，防止不同日齡、不同批次豬群發(fā)生交叉感染[11]。同時采用封閉式管理，防止豬群接觸到病原體。

（4）加強飼養(yǎng)管理，提高個體抵抗力。相關(guān)工作人員上崗前進行嚴格培訓(xùn)，打耳號、采樣等操作過程中應(yīng)盡量避免出血情況[15]。飼喂時選擇全價配方飼料，同時對飼料進行定期檢查，防止因環(huán)境潮濕等造成飼料發(fā)霉；定期消毒豬舍提供的飲水，及時清除場舍內(nèi)的糞便與垃圾。場舍應(yīng)保持良好通風，注意氣溫變化。最后，控制好豬群飼養(yǎng)密度，有效防止疫病擴散。