張菁菁,馬定遠(yuǎn),孫 云,洪冬洋,劉 剛,王玉國(guó),曾華沙,胡 平,許爭(zhēng)峰

[南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院(南京市婦幼保健院)遺傳醫(yī)學(xué)中心,南京 210004]

甲基丙二酸血癥(methylmalonic acidemia,MMA)是一種常染色體隱性遺傳病，是目前中國(guó)最常見(jiàn)的有機(jī)酸尿癥[1]。MMA的發(fā)病率在不同地區(qū)有較大差異，亞太地區(qū)較低，為0.79/10萬(wàn)，中東和北非地區(qū)可達(dá)6.04/10萬(wàn)，國(guó)內(nèi)各地發(fā)病率約為(1.5～2)/10萬(wàn)[2]。MMA是由于特定的氨基酸(如異亮氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸等)、膽固醇和奇數(shù)鏈脂肪酸代謝障礙引起，由于上述代謝途徑中的甲基丙二酸輔酶A或其輔酶鈷胺素代謝缺陷導(dǎo)致體內(nèi)甲基丙二酸的蓄積，從而對(duì)機(jī)體，特別是腦組織產(chǎn)生損傷，引起一系列多樣的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)常危及患兒生命。根據(jù)是否合并同型半胱氨酸血癥，MMA可分為兩型：?jiǎn)渭冃图谆嵫Y和甲基丙二酸血癥合并同型半胱氨酸血癥，在中國(guó)最常見(jiàn)的是合并型MMA[3]。

MMA患者發(fā)病年齡跨度較大，臨床表現(xiàn)多樣，首次就診時(shí)易誤診和漏診。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)MMA患者進(jìn)行基因檢測(cè)有助于早期明確診斷和制定治療方案。研究表明，單純型MMA多由MUT(OMIM,609058)基因突變引起[4]，合并型MMA中最常見(jiàn)的是由MMACHC(OMIM,611935)基因突變引起的cblC型MMA，其它致病基因還有MMAA、MMAB、MMADHC及HCF1等[5-6]。通過(guò)測(cè)序技術(shù)檢測(cè)MMA相關(guān)基因，早期診斷MMA并對(duì)其家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)降低出生缺陷率有著較高的臨床價(jià)值。本研究收集了2016至2020年在南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心就診的35個(gè)MMA家系，對(duì)其進(jìn)行基因檢測(cè)，在明確基因突變位點(diǎn)的前提下，對(duì)再次妊娠需要產(chǎn)前基因檢測(cè)的家系提供產(chǎn)前診斷。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2016年1月至2020年12月南京市婦幼保健院遺傳醫(yī)學(xué)中心共收集到35例MMA家系，其中30例為MMA合并高半胱氨酸血癥患兒家系，5例為單純型MMA患兒家系。所有患兒的新篩結(jié)果中丙酰基肉堿C3，C3/乙酰肉堿C2的比值，C3/游離肉堿C0的比值及尿氣相-質(zhì)譜尿甲基丙二酸結(jié)果均超出正常范圍。30例合并型MMA患兒血清同型半胱氨酸升高。臨床診斷后建議患兒家庭進(jìn)行基因檢測(cè)，對(duì)于再次妊娠后要求產(chǎn)前診斷的孕婦,采集羊水進(jìn)行檢測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有新生兒篩查、基因診斷及產(chǎn)前診斷工作均取得患兒家長(zhǎng)同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 樣本收集與DNA提取 對(duì)35例患兒及其父母抽取2mL EDTA抗凝的外周血，需要產(chǎn)前診斷的孕婦再次妊娠18～22周，通過(guò)羊膜腔穿刺術(shù)抽取15mL羊水。采用DNA提取試劑盒(QIAamp，QIAGEN公司，德國(guó))提取外周血或羊水基因組DNA，Nanodrop分光光度計(jì)(ThermoFisher，美國(guó))測(cè)定DNA濃度，并且把DNA濃度稀釋在10～20ng/μL，OD260nm/280nm比值在1.8～2.0之間。

1.3 目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序及生物信息學(xué)分析 目標(biāo)區(qū)域捕獲測(cè)序是針對(duì)目的基因組區(qū)域涉及特異性的探針，將其與基因組DNA雜交，富集到目標(biāo)基因組區(qū)域的DNA片段，再利用高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序的方法。本研究中將MMA疾病相關(guān)的基因MMUT、MCEE、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、LMBRD1、ABCD4、HCFC1、GPHN、PCCA以及PCCB基因的外顯子區(qū)域作為目標(biāo)基因區(qū)域，應(yīng)用捕獲芯片(MyGenostics,GenCap)對(duì)這些區(qū)域進(jìn)行捕獲。具體步驟：首先將基因組DNA隨機(jī)打斷成片段，與Illumina PE接頭寡核苷酸混合物鏈接，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行鏈接介導(dǎo)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LM-PCR)，將擴(kuò)增純化后得到的DNA文庫(kù)與目標(biāo)基因區(qū)域捕獲芯片進(jìn)行雜交富集目標(biāo)區(qū)域序列，通過(guò)Illumina Next500測(cè)序平臺(tái)對(duì)捕獲序列進(jìn)行測(cè)序。將原始測(cè)序數(shù)據(jù)利用伯羅斯-惠勒比軟件(BWA,http://bio-bwa.sourceforge.net/)過(guò)濾，得到的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中人類基因組參考序列進(jìn)行比對(duì)，利用基因組分析工具包軟件(GATK，https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出單核苷酸變異(SNV)和插入缺失突變的相關(guān)信息。然后通過(guò)ANNOVAR軟件(http://annovar.openbioinformati cs.org/en/latest/)對(duì)所有的SNP和插入缺失突變進(jìn)行注釋。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和以下數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)突變的致病性進(jìn)行分析：正常人數(shù)據(jù)庫(kù)包括千人基因組計(jì)劃(http://www.1000genomes.or/)、Exome Variant Server(http://evs.gs.Washingto n.edu/EVS/)和EXAC(http://exac.broadinstitute.org/)。錯(cuò)義突變使用SIFT(http://sift.jcvi.org/)，PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)和GERP++(http://mende l.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)。所有突變均經(jīng)過(guò)Sanger測(cè)序驗(yàn)證。根據(jù)2015年ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南[7]，將突變分為致病性變異、可疑致病性變異、臨床意義不明變異以及良性變異。

1.4 產(chǎn)前診斷 對(duì)于患兒及父母明確基因型的家庭，再次妊娠至18～22周，抽取羊水進(jìn)行相應(yīng)突變位點(diǎn)的Sanger測(cè)序，并且采用21、18、13和性染色體倍型檢測(cè)試劑盒(上海晶準(zhǔn)生物醫(yī)藥有限公司)進(jìn)行STR分析以排除母體污染。

1.5 隨訪 對(duì)進(jìn)行產(chǎn)前診斷的胎兒結(jié)局進(jìn)行隨訪，對(duì)于足月分娩的新生兒進(jìn)行常規(guī)足底血串聯(lián)質(zhì)譜篩查，并且進(jìn)行尿GC-MS檢測(cè)以及血中同型半胱氨酸檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 35例家系中基因突變分析 35例家系患兒中有5例患兒(5/35,14.3%)為MMUT基因突變所致，共包含9種MUT基因突變(表1)，分別為c.323G>A、c.470T>A、c.577A>T、c.693C>G、c.1280 G>A、c.1591delG、c.1610T>A、c.1663G>A以及c.2216_2219del。經(jīng)查閱文獻(xiàn)及軟件分析提示c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A以及c.2216_2219del是為新突變。5例家系分析均為復(fù)合雜合突變。

35例家系患兒中有30例患兒(30/35，85.7%)為MMACHC基因突變所致，共包含MMACHC基因突變12種(表2)，其中c.609G>A無(wú)義突變最常見(jiàn)，占40.3%，其次為c.658_660delAGG缺失突變，占21%，c.482G>A和c.80A>G分別占11.3%和8.1%，無(wú)義突變c.79C>T為首次報(bào)道的新突變。30例家系中3例為純合突變，其余均為復(fù)合雜合突變。

2.2 產(chǎn)前診斷結(jié)果 35例家系中有8對(duì)夫婦再次妊娠時(shí)接受產(chǎn)前基因檢測(cè)，首先對(duì)采集到的羊水樣本進(jìn)行STR分析排除母血污染，保障基因檢測(cè)結(jié)果的可靠性，再對(duì)羊水樣本進(jìn)行家系基因突變的檢測(cè)。結(jié)果提示，8個(gè)家系中有2例胎兒為野生型，1例胎兒為雜合突變攜帶者，5例胎兒基因型與先證者一致，這5個(gè)家系中有3個(gè)家庭第三次妊娠時(shí)羊水基因結(jié)果提示2例為野生型，1例為雜合變異攜帶者。對(duì)于基因檢測(cè)結(jié)果與先證者一致的胎兒均終止妊娠，其余野生型和雜合變異攜帶者均繼續(xù)妊娠(表3)。

表1 MUT基因突變匯總

表2 MMACHC基因突變匯總

表3 8例家系的產(chǎn)前診斷結(jié)果

2.3 隨訪結(jié)果 進(jìn)行產(chǎn)前診斷的家系在胎兒出生后1月、6月、1年均進(jìn)行隨訪，8個(gè)家系中經(jīng)1次或2次妊娠足月分娩的新生兒均接受新生兒足跟血篩查，結(jié)果均在正常范圍內(nèi)，且1年隨訪生長(zhǎng)發(fā)育均正常。

3 討 論

甲基丙二酸血癥是一種臨床表型多樣、癥狀嚴(yán)重的疾病[8]。近年來(lái)，各地區(qū)陸續(xù)報(bào)道了本地區(qū)范圍內(nèi)的MMA臨床篩查和基因檢測(cè)結(jié)果，對(duì)該病的防治有著重要的臨床意義[9-12]。本研究總結(jié)近5年MMA病例的基因診斷和產(chǎn)前診斷結(jié)果，共收集35例MMA家系。通過(guò)基因檢測(cè)結(jié)果提示5例家系為單純型MMA，即MMUT基因突變所致；30例家系為cblC型MMA，即MMACHC基因突變所致，并且對(duì)8個(gè)家系再次妊娠時(shí)采集羊水行產(chǎn)前基因檢測(cè)。該研究為進(jìn)一步明確本地區(qū)甲基丙二酸血癥的疾病譜和基因譜提供了參考依據(jù)，并且通過(guò)產(chǎn)前診斷可有效降低MMA患兒的出生率，減少出生缺陷率。

35例家系中，有30例均為MMACHC基因突變所致的cblC型MMA，占總病例數(shù)的85.7%(30/35)，這與以往文獻(xiàn)報(bào)道一致，即cblC型MMA是中國(guó)人群中最常見(jiàn)的類型[13]。MMACHC基因定位于1號(hào)染色體p34.1，共包含5個(gè)外顯子，其中外顯子1-4為編碼區(qū)，共編碼282個(gè)氨基酸，目前全世界范圍內(nèi)報(bào)道的突變大約有一百余種，在白種人群中，c.271dupA為最常見(jiàn)的突變類型，而在中國(guó)人群中c.609G>A為cblC型MMA中最常見(jiàn)的突變[14]。Wang等[15]報(bào)道，在中國(guó)人群中，c.609G>A約占MMACHC基因所有突變的47.63%。于玥等[14]對(duì)攜帶c.609G>A突變的720例MMA患兒臨床及隨訪分析提示，攜帶該突變的患兒多為出生后1月內(nèi)發(fā)病，且c.609G>A純合變異的患兒較攜帶c.609G>A與其它位點(diǎn)的復(fù)合雜合變異預(yù)后差。本研究中，30例cblC型MMA中共發(fā)現(xiàn)12種突變，c.609G>A為最常見(jiàn)類型，約占40.3%，與已報(bào)道的文獻(xiàn)一致。本研究的突變中，還發(fā)現(xiàn)一種新的無(wú)義突變c.79C>T，該變異導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生p.Gln27Ter突變，該突變?cè)谌祟惢蛲蛔償?shù)據(jù)庫(kù)(human gene mutation database,HGMD)無(wú)記載，但由于該突變使MMACHC基因的編碼信息發(fā)生錯(cuò)誤，可使編碼的蛋白質(zhì)提前終止，從而導(dǎo)致表達(dá)截短形式的蛋白質(zhì)。此外，查閱正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)，該變異位點(diǎn)均無(wú)記載，評(píng)估為罕見(jiàn)變異，該患兒的另一個(gè)突變位點(diǎn)為MMACHC基因的經(jīng)典突變位點(diǎn)c.609G>A，評(píng)估其為致病性突變，綜合評(píng)估c.79C>T新變異為致病性變異。

本研究病例中，除最常見(jiàn)的MMACHC基因所致的cblC型MMA外，5例均為MUT基因突變所致的單純型MMA。MUT基因定位于6號(hào)染色體p12.3，共有13個(gè)外顯子，編碼750個(gè)氨基酸。目前全世界范圍內(nèi)已報(bào)道的突變類型有近300種，大多數(shù)突變僅在一個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)，所以沒(méi)有明確的熱點(diǎn)突變類型[2]。以往研究報(bào)道中，在我國(guó)較常見(jiàn)的突變位點(diǎn)是c.729_730insTT、c.323G>A以及c.1106G>A，但還需積累更多病例和基因突變信息，確定MUT基因的突變熱點(diǎn)[16]。本研究中5個(gè)家系共包含9種基因突變類型，其中有4種為新突變：c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A以及c.2216_2219del。對(duì)這些新突變進(jìn)行了致病性評(píng)估：(1)c.1591delG為移碼突變，可導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生p.Glu531 Asnfs*7改變，可使編碼的蛋白質(zhì)提前終止，從而導(dǎo)致表達(dá)截短形式的蛋白質(zhì)，從而影響蛋白功能，在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中記載頻率極低，屬于罕見(jiàn)變異。且該患兒另一個(gè)突變位點(diǎn)為明確致病位點(diǎn)，綜合評(píng)估該變異為致病性突變。(2)c.1610T>A為錯(cuò)義突變，可導(dǎo)致氨基酸p.Leu537Gln改變，在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中均無(wú)頻率記載或頻率極低，評(píng)估屬于罕見(jiàn)變異。攜帶c.1610T>A的患兒另一個(gè)突變位點(diǎn)為明確致病變異，且患兒臨床表現(xiàn)及血檢指標(biāo)均符合MMA診斷，評(píng)估c.1610T>A為可能致病變異。(3)c.577A>T為錯(cuò)義突變，可導(dǎo)致氨基酸p.Ile193Phe改變，在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中無(wú)頻率記載，屬于罕見(jiàn)變異，攜帶c.577T>A的患兒另一個(gè)突變也為新發(fā)變異(c.2216_2219del)，所以評(píng)估該變異為臨床意義不明的變異。(4)c.2216_2219del為移碼變異，可導(dǎo)致氨基酸序列發(fā)生p.Ile739Argfs*18改變，但該變異位于MMUT基因最后一個(gè)外顯子，導(dǎo)致甲基丙二酰輔酶A變位酶最后12個(gè)氨基酸發(fā)生變化，并多延伸5個(gè)氨基酸，評(píng)估該變異不導(dǎo)致無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解，關(guān)于該變異是否在蛋白質(zhì)水平上影響功能未見(jiàn)研究報(bào)道，評(píng)估該變異為臨床意義不明的變異。因此，c.557A>T和c.2216_2219del的致病性還有待進(jìn)一步的數(shù)據(jù)及功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

串聯(lián)質(zhì)譜應(yīng)用于新生兒遺傳代謝病的篩查以及基因診斷MMA的普及以來(lái)[17]，MMA患兒能做到早診斷、早治療[18]，但一些患兒治療后仍遺留一定的智力或運(yùn)動(dòng)障礙，對(duì)家庭和社會(huì)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。因此，孕期的產(chǎn)前診斷顯得尤為重要[19]。本研究對(duì)明確基因位點(diǎn)的8個(gè)家系再次妊娠時(shí)采集羊水進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，有效阻斷MMA患兒的出生，對(duì)產(chǎn)前基因檢測(cè)陰性，正常分娩胎兒的隨訪各項(xiàng)指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。

本研究總結(jié)了近5年MMA患兒的基因檢測(cè)結(jié)果，不僅發(fā)現(xiàn)了本地區(qū)MMACHC基因的熱點(diǎn)突變，并且檢測(cè)到MMACHC和MUT基因共5種新突變，豐富了MMA患兒的基因突變譜。通過(guò)分析，一些新突變被證實(shí)為致病或可能致病變異，但有些新突變的致病性還有待更多的病例和功能實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。對(duì)已確定基因型的家系提供產(chǎn)前診斷，對(duì)避免MMA患兒的出生，降低出生缺陷率有著重要的臨床意義。