郝鋮 牟晶晶 趙彬 趙晶晶 方真華*

1.武漢市第四醫(yī)院 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，湖北 武漢 430000 2.湖北省腫瘤醫(yī)院，湖北 武漢 430079

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種可分化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織的多能干細(xì)胞[1]。MSC可分化為成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，影響骨修復(fù)和血管生成，并可產(chǎn)生生長因子，通過旁分泌作用促進壞死區(qū)的血液供應(yīng)[2-3]。MSC不僅在疾病的發(fā)展中起著非常重要的作用，而且還是再生治療種子細(xì)胞的主要來源，目前認(rèn)為激素性股骨頭壞死(steroid-induced osteonecrosis of femoral head，SANFH)的發(fā)病機制與MSC有關(guān)[4]。外泌體是直徑小于150 nm的細(xì)胞外囊泡，內(nèi)容物主要有蛋白質(zhì)、miRNA及脂質(zhì)等[5-6]。近年來，MSC來源的外泌體可在多種組織和器官中發(fā)揮作用[1]。Guo等[7]研究證實人滑膜來源的MSC外泌體可通過增強增殖和抗凋亡作用來預(yù)防糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的大鼠SANFH。但MSC外泌體在SANFH中的作用機制仍需進一步研究。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β信號通路參與細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)的合成等，并可調(diào)節(jié)MSC的譜系選擇和向特定細(xì)胞分化的進程[8]。本研究從MSC外泌體對MSC成骨分化的影響著手，探究其與TGF-β信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)；hMSC無血清培養(yǎng)液套裝(中科院)；DMEM-LG(HyClone公司)；地塞米松(Sigma公司)；成骨誘導(dǎo)分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Cyagen公司)；堿性磷酸酶試劑盒(南京建成)；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(BD公司)；SYBR FAST qPCR Master Mix(KAPA Biosystems公司)；RIPA(強)組織細(xì)胞快速裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒(Solarbio公司)；PVDF轉(zhuǎn)移膜和化學(xué)發(fā)光試劑(Millipore公司)；兔抗轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)抗體、兔抗Smad3抗體和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2，RUNX2)抗體(Bioswamp公司)。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

將凍存于液氮罐中的MSC置于37 ℃水浴中至完全融化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，400 g離心3 min，棄上清，加入1 mL培養(yǎng)液后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中。加入4 mL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。MSC用hMSC無血清培養(yǎng)液套裝培養(yǎng)。

1.3 外泌體提取及鑒定[9]

將MSC按5 000 cells/cm2的濃度接種于十二孔板內(nèi)，在不含胎牛血清的DMEM-LG完全培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，將MSC分為兩組：對照組和地塞米松干預(yù)組。地塞米松干預(yù)組將10 μmol/L地塞米松[10]加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72 h。

收集上述兩組培養(yǎng)基，500 g離心10 min，收集上清。2 000 g離心20 min，收集上清，1×105g離心70 min。20 mL PBS重懸后，1×105g離心70 min。所得沉淀與PBS按照1∶20比例稀釋，2 000 g離心200 min。40%蔗糖梯度1×105g離心70 min；收集上清。1×105g離心70 min，收集沉淀。最終得到兩種外泌體：Exo-1(對照組MSC分泌的外泌體)和Exo-2(地塞米松干預(yù)組MSC分泌的外泌體)。電鏡下觀察到提取得到的細(xì)胞外囊泡形態(tài)特征為茶托樣結(jié)構(gòu)，且Western blot檢測到外泌體標(biāo)志物CD63的表達，說明分離得到了外泌體。

1.4 細(xì)胞分組與處理

取對數(shù)生長期MSC細(xì)胞在不含胎牛血清的DMEM-LG完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 mg/L L-抗壞血酸、1%青霉素及2.5 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基)。將MSC分為3組：對照組、Exo-1組和Exo-2組。外泌體處理組分別加入20 μg/mL Exo-1或Exo-2[11]，進行成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d。對照組加入等量PBS正常成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)7 d。

1.5 生化檢測堿性磷酸酶活性

嚴(yán)格按照堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)試劑盒說明書進行實驗。

1.6 流式檢測細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，取約1×106個重懸，400 g、4 ℃離心5 min，棄上清。加入1 mL預(yù)冷PBS，輕輕吹打混勻，400 g、4 ℃離心5 min，棄上清。將細(xì)胞重懸于200 μL PBS，加入10 μL Annexin V-FITC和10 μL PI，輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min。加入300 μL PBS，隨即進行流式檢測。

1.7 qRT-PCR檢測炎癥因子及TGF-β信號通路相關(guān)基因表達

取細(xì)胞約1×106個，加1 mL Trizol提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參，進行qRT-PCR檢測。每組實驗設(shè)3個重復(fù)，得到的數(shù)據(jù)采用2-△△Ct計算細(xì)胞中TGF-β、Smad3和RUNX2的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列Table.1 Primer sequences

1.8 Western blot檢測TGF-β信號通路相關(guān)蛋白表達

收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。以每孔20 μg蛋白上樣量進行SDS-PAGE電泳。然后將蛋白轉(zhuǎn)移至PCDF膜上。使用5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入一抗TGF-β、Smad3和RUNX2(稀釋比1∶1000)室溫孵育1 h。用PBST洗膜，加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，用PBST漂洗后，加入化學(xué)發(fā)光試劑，曝光顯影后，讀取蛋白條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 19.0對所得實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對ALP活性的影響

生化檢測MSC細(xì)胞中ALP活性，結(jié)果見圖1。對照組與Exo-1組ALP活性無顯著差異(P>0.05)。與對照組和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞ALP活性顯著降低(P<0.05)。表明經(jīng)地塞米松(10 μmol/L)干預(yù)的MSC外泌體可顯著抑制MSC成骨分化。

圖1 ALP試劑盒檢測ALP活性(*P<0.05 vs. Control/Exo-1)Fig.1 ALP activity was assessed with ALP kit (*P<0.05 vs Control/Exo-1)

2.2 對細(xì)胞凋亡的影響

流式檢測MSC細(xì)胞凋亡率，結(jié)果見圖2。對照組與Exo-1組細(xì)胞凋亡率無顯著差異(P>0.05)。與對照組和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。表明經(jīng)地塞米松(10 μmol/L)干預(yù)的MSC外泌體可顯著促進MSC凋亡。

圖2 流式檢測細(xì)胞凋亡率(*P<0.05 vs. Control/Exo-1)Fig.2 Apoptosis rate was detected with flow cytometry (*P<0.05 vs Control/Exo-1)

2.3 對炎癥因子表達的影響

qRT-PCR檢測MSC細(xì)胞中炎癥因子NF-κB、IL-1β和TNF-α mRNA表達量的變化，結(jié)果見圖3。對照組與Exo-1組細(xì)胞中NF-κB、IL-1β和TNF-α mRNA表達量無顯著差異(P>0.05)。與對照組和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞中NF-κB mRNA表達量顯著降低(P<0.05)，IL-1β和TNF-α mRNA表達量顯著升高(P<0.05)。表明經(jīng)地塞米松(10 μmol/L)干預(yù)的MSC外泌體可顯著促進MSC炎癥反應(yīng)。

圖3 qRT-PCR檢測炎癥因子表達(*P<0.05 vs. Control/Exo-1)Fig.3 qRT-PCR was used to detect the expression of inflammatory factors (*P<0.05 vs Control/Exo-1)

2.4 對TGF-β信號通路相關(guān)基因和蛋白表達的影響

qRT-PCR和Western blot檢測TGF-β、Smad3和RUNX2 mRNA和蛋白表達量的變化，結(jié)果見圖4、5。對照組與Exo-1組細(xì)胞TGF-β、Smad3和RUNX2 mRNA和蛋白表達量無顯著差異(P>0.05)。與對照組和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞中TGF-β mRNA和蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，Smad3和RUNX2 mRNA和蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。

圖4 qRT-PCR檢測TGF-β、Smad3和RUNX2 mRNA表達(*P<0.05 vs. Control/Exo-1)Fig.4 The mRNA expressions of TGF-β, Smad3, and RUNX2 were detected with qRT-PCR (*P<0.05 vs Control/Exo-1)

圖5 Western blotting 檢測TGF-β、Smad3和RUNX2蛋白表達(*P<0.05 vs. Control/Exo-1)Fig.5 The protein expressions of TGF-β, Smad3, and RUNX2 were detected with Western blotting (*P<0.05 vs Control/Exo-1)

3 討論

SANFH是臨床上應(yīng)用糖皮質(zhì)激素引起的一種嚴(yán)重的骨科疾病，其病理特征是骨細(xì)胞和骨髓逐漸發(fā)生壞死，最終導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變甚至塌陷[12]。SANFH的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，主要包括MSC成骨與成脂分化失衡理論、脂肪代謝紊亂理論、骨質(zhì)疏松理論、炎癥與細(xì)胞凋亡理論和血管內(nèi)凝血理論等，其中，MSC成骨和成脂分化失衡被認(rèn)為是SONFH發(fā)生和發(fā)展的主要機制[13-14]。地塞米松是最常用的糖皮質(zhì)激素藥物之一，長期使用糖皮質(zhì)激素會產(chǎn)生許多不良反應(yīng)，例如骨質(zhì)流失、低骨量、脆性骨折和骨壞死等[15-16]。已有許多研究報道證明了地塞米松對MSC的作用具有時間和劑量依賴性，如短時間和低劑量地塞米松處理MSC可促進成骨，而長期暴露在高劑量(10-6mol/L)的地塞米松下會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制MSCs的增殖，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松和SONFH[17]。研究表明，高濃度地塞米松(10-5mol/L)可導(dǎo)致MSC功能障礙，從而導(dǎo)致MSC成骨和成脂分化失衡[18]。近年來，許多研究表明外泌體在MSC成骨分化中起著重要作用。Fang等[19]研究了MSC外泌體對SANFH的成骨作用，結(jié)果顯示經(jīng)MSC外泌體處理的SANFH細(xì)胞中有11個基因表達上調(diào)，9個基因表達下調(diào)；這些差異表達基因主要參與成骨分化、免疫應(yīng)答和TGF-β/BMP信號通路等，從而影響SANFH的成骨作用。本研究探討用地塞米松(10 μmol/L)干預(yù)的MSC來源外泌體是否通過TGF-β/Smad3信號通路對MSC成骨分化產(chǎn)生影響。

ALP富含于成骨細(xì)胞胞質(zhì)中，是反映成骨細(xì)胞活力的功能酶之一，ALP活性水平是成骨細(xì)胞分化和礦化的指標(biāo)[20]。本研究結(jié)果顯示，與對照組和和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞中ALP活性顯著降低，這表明經(jīng)10 μmol/L地塞米松干預(yù)的MSC來源外泌體可顯著抑制MSC成骨分化。研究表明，長期過量使用激素會引起股骨頭成骨細(xì)胞微環(huán)境的改變，導(dǎo)致細(xì)胞色素C、Bax、C-caspase3和C-caspase9等凋亡相關(guān)因子過度表達，這些因子通過一系列反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和組織破壞[21]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測了MSC凋亡率，結(jié)果顯示，與對照組和和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞凋亡率顯著升高，這表明經(jīng)10 μmol/L地塞米松干預(yù)的MSC來源外泌體顯著促進MSC凋亡。NF-κB是最具代表性的炎癥因子，是炎癥反應(yīng)的中心介質(zhì)，研究表明，TLR/NF-κB過度激活可能會相互抑制Wnt/β-catenin通路并誘導(dǎo)SANFH[22]。IL-1β和TNF-α均為促炎因子，研究表明，SANFH大鼠血清中IL-1β和TNF-α濃度顯著升高[23]。本研究結(jié)果顯示，與對照組和和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞中NF-κB mRNA表達量顯著降低，IL-1β和TNF-α mRNA表達量顯著升高，這表明經(jīng)10 μmol/L地塞米松干預(yù)的MSC來源外泌體可顯著促進MSC炎癥反應(yīng)。

MSC成骨分化過程是通過一系列信號轉(zhuǎn)到途徑實現(xiàn)的，TGF-β蛋白家族的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在調(diào)節(jié)MSC成骨分化中起著重要作用[8]。Smads蛋白家族是TGF-β信號通路中的重要組成部分，TGF-β通過絲氨酸/蘇氨酸受體激酶啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，隨后使Smad2/3磷酸化，磷酸化的Smad2/3與Smad4結(jié)合，并將其轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核中，激活的Smads蛋白通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合調(diào)控生物學(xué)過程[24-25]。RUNX2是MSC成骨分化的關(guān)鍵特異性細(xì)胞因子，在TGF-β信號通路的介導(dǎo)下，Smad3可調(diào)控RUNX2的表達水平進而影響MSC的功能[26]。本研究結(jié)果顯示，與對照組和和Exo-1相比，Exo-2組MSC細(xì)胞中TGF-β mRNA和蛋白表達量顯著升高，Smad3和RUNX2 mRNA和蛋白表達量顯著降低，這表明經(jīng)10 μmol/L地塞米松干預(yù)的MSC來源外泌體可能通過TGF-β信號通路對MSC成骨分化產(chǎn)生影響。

綜上所述，用10 μmol/L地塞米松干預(yù)的MSC來源外泌體可能通過TGF-β信號通路抑制MSC成骨分化，促進細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)，參與SANFH的發(fā)生發(fā)展。