羅星雨，轉(zhuǎn) 黎，胥 琴，田冀雯，馬艷萍*

0 引言

宮腔粘連是指女性子宮內(nèi)膜基底層受損，子宮內(nèi)膜恢復(fù)障礙，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)異常、閉經(jīng)、流產(chǎn)、不孕等一系列綜合征[1]。纖維化是宮腔粘連的主要病理改變，不同研究顯示，終止妊娠后宮腔粘連發(fā)生率為8.1%～21.2%[2-4]。目前針對(duì)宮腔粘連的治療最常采用和最有效的方法是宮腔鏡下粘連分解術(shù)加術(shù)后雌、孕激素治療，該方法在改善月經(jīng)和提高妊娠率方面具有重要作用，但有部分研究表明，重度宮腔粘連的復(fù)發(fā)率可高達(dá)63%左右[5-6]。因此，尋找新的治療藥物及治療方法仍然十分重要。有大量研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(Angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI)可以通過降低血管緊張素Ⅱ水平，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)TGFβ相關(guān)的mRNA水平，延緩多種器官纖維化進(jìn)展，目前發(fā)現(xiàn)，ACEI類藥物鹽酸貝那普利可以通過調(diào)節(jié)TGF-β參與的信號(hào)通路延緩腎、肝、肺等器官的纖維化進(jìn)展[7-10]，TGF-β作為始動(dòng)因子主要參與TGF-β1-smad2/smad3信號(hào)通路途徑，當(dāng)損傷發(fā)生時(shí)TGF-β表達(dá)增加，該信號(hào)通路活化，纖維化發(fā)生[11-12]。本研究選取人子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(AN3CA)及人子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞(hESC)，用TGF-β1誘導(dǎo)其纖維化改變，給予鹽酸貝那普利治療，觀察鹽酸貝那普利對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的AN3CA細(xì)胞及hESC細(xì)胞纖維化改變的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器 TGF-β1蛋白購于Sinobiological公司；鹽酸貝那普利、Cell Counting Kit-8(CCK8)購于MedChemExpress公司；AN3CA細(xì)胞、hESC細(xì)胞購于賽百慷生物技術(shù)股份有限公司(中國上海)；MEM培養(yǎng)基、DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、0.25% Trypsin-EDTA購于GIBCO公司(美國)；ANNEXIN V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于Solarbio公司；CellTiter-Glo細(xì)胞活力檢測系統(tǒng)購于Promega公司；Anti-Fibronectin antibody ab2413抗體、Anti-TGFβ1 antibody ab170874抗體購于Abcam公司；Smad3(C67H9)Rabbit mAb 9523抗體購于Cell Signaling Technology公司；KPL CyTM3-Labeled Antibody to Rabbit IgG(H+L)二抗購于Seracare公司；熒光倒置顯微鏡(Carl zeiss Microscopy GmbH，型號(hào)：Axio Scope A1)；流式細(xì)胞儀(BD公司，型號(hào)：JANUARY 2007)；酶標(biāo)儀(BioTek公司，型號(hào)：ELX800)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 預(yù)實(shí)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)分組 預(yù)實(shí)驗(yàn)用CCK8檢測TGF-β1對(duì)AN3CA細(xì)胞的50%抑制率(IC50)，將細(xì)胞接種于96孔板，與不同濃度的TGF-β1共培養(yǎng)，按CCK8說明書方法進(jìn)行細(xì)胞增殖活力測定，分別在24 h、48 h、72 h檢測細(xì)胞增殖活力；用CCK8檢測鹽酸貝那普利對(duì)AN3CA細(xì)胞的安全濃度，將細(xì)胞接種于96孔板，與不同濃度的鹽酸貝那普利共培養(yǎng)，按CCK8說明書方法進(jìn)行細(xì)胞增殖活力測定，分別在24 h、48 h、72 h檢測細(xì)胞增殖活力。將凍存的AN3CA細(xì)胞及hESC細(xì)胞復(fù)蘇后，AN3CA細(xì)胞培養(yǎng)于MEM(含10%FBS)培養(yǎng)基，hESC細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM/F-12(含10%FBS)培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37 ℃，5%CO2。細(xì)胞傳代2次正常培養(yǎng)24 h后,將其分為對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組、BNPL5組和BNPL8組，對(duì)照組更換正常培養(yǎng)基(含10%FBS)，實(shí)驗(yàn)組更換含TGF-β1 5 ng/ml的培養(yǎng)基(含10%FBS)，BNPL5組更換含TGF-β1(5 ng/ml)+貝那普利(5 μmol/L)的培養(yǎng)基(含10%FBS)，BNPL8組更換含TGF-β1(5 ng/ml)+貝那普利(8 μmol/L)的培養(yǎng)基(含10%FBS)，AN3CA細(xì)胞培養(yǎng)48 h后終止培養(yǎng)，hESC細(xì)胞培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞生長情況以及細(xì)胞形態(tài)改變。

1.2.3 CellTiter-Glo法測定細(xì)胞活力 按說明書方法測定細(xì)胞增殖活力，分別在0 h、24 h、48 h和72 h檢測細(xì)胞增殖活力。

1.2.4 細(xì)胞凋亡水平檢測 四組細(xì)胞終止培養(yǎng)后，制備細(xì)胞懸液，按凋亡試劑盒說明書方法應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5 免疫熒光法測定纖維連接蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)含量 將細(xì)胞按一定密度接種于24孔板專用細(xì)胞爬片，根據(jù)分組給予相應(yīng)藥物處理后終止培養(yǎng)，按一抗Anti-Fibronectin antibody及二抗KPL免疫熒光說明書方法進(jìn)行免疫熒光檢測，應(yīng)用倒置相差熒光顯微鏡觀察及拍攝，用Image J進(jìn)行免疫熒光圖片定量分析。

1.2.6 Western blot檢測FN、TGF-β1、Smad3蛋白 按BCA蛋白測定試劑盒說明書測定蛋白濃度，并制膠，加樣，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，使用5%BSA室溫封閉1.5 h后,加入TGF-β1(1∶1 000)、Smad3(1∶1 000)、Fibronectin(1∶500)和GAPDH(1∶2 000)的抗體在4 ℃孵育過夜，洗膜后用過氧化物酶連接的二抗孵育1.5 h后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯示蛋白條帶，然后檢測灰度值，采用Image J圖像分析軟件計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 CCK8篩查TGF-β1的IC50及鹽酸貝那普利的安全濃度 AN3CA細(xì)胞與TGF-β1共培養(yǎng)48 h時(shí)實(shí)驗(yàn)組的抑制率為51%，故取TGF-β1的IC50(5 ng/ml)為實(shí)驗(yàn)組藥物濃度(見表1)。當(dāng)鹽酸貝那普利的濃度≤8 μmol/L時(shí)，AN3CA細(xì)胞的存活率基本不受影響，且細(xì)胞形態(tài)無改變，生長狀態(tài)好。當(dāng)濃度>8 μmol/L時(shí)，AN3CA細(xì)胞的存活率下降，故考慮鹽酸貝那普利的安全濃度≤8 μmol/L，故選取鹽酸貝那普利濃度5 μmol/L和8 μmol/L為治療濃度(見表2)。

表1 CCK8檢測TGF-β1對(duì)AN3CA細(xì)胞的抑制率(n=3)

表2 CCK8檢測AN3CA細(xì)胞的存活率(n=3)

2.2 鹽酸貝那普利對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的AN3CA細(xì)胞及hESC細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響 終止培養(yǎng)后，熒光鏡下結(jié)果顯示，AN3CA細(xì)胞：對(duì)照組的細(xì)胞生長狀態(tài)好，呈多角形或短梭形，貼壁牢靠，細(xì)胞數(shù)量多；實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞呈長梭形，纖維化樣外觀，貼壁不牢靠，活細(xì)胞數(shù)量較少，死亡細(xì)胞較多，細(xì)胞間隙大，形態(tài)學(xué)改變明顯；BNPL5組的細(xì)胞部分恢復(fù)為短梭形或多角形，死亡細(xì)胞數(shù)較B組減少；BNPL8組的細(xì)胞部分恢復(fù)為短梭形或多角形，細(xì)胞死亡數(shù)較BNPL5組更少(圖1)。hESC細(xì)胞：四組細(xì)胞形態(tài)均無明顯改變，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞數(shù)量增多，BNPL5組細(xì)胞數(shù)量較實(shí)驗(yàn)組下降，BNPL8組進(jìn)一步下降(圖2)。

圖1 AN3CA細(xì)胞形態(tài)圖(400×)注：A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

圖2 hESC細(xì)胞形態(tài)圖(400×)注：A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

2.3 鹽酸貝那普利對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的AN3CA細(xì)胞及hESC細(xì)胞增殖的影響 CellTiter-Glo法根據(jù)上述分組檢測細(xì)胞增殖活力：AN3CA細(xì)胞用TGF-β1處理后細(xì)胞增殖活力下降，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異，加用貝那普利處理后細(xì)胞增殖活力增加，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)；hESC細(xì)胞用TGF-β1處理后增殖活力增加，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異，加用貝那普利后細(xì)胞增殖活力下降，BNPL8組與實(shí)驗(yàn)組在處理72 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(實(shí)驗(yàn)組：781 632.3±2 089.2，BNPL8組：668 127±17 293，P<0.001)(表4)。

表3 AN3CA細(xì)胞CellTiter-Glo測定結(jié)果

表4 hESC細(xì)胞CellTiter-Glo測定結(jié)果

2.4 鹽酸貝那普利對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)AN3CA、hESC細(xì)胞凋亡的影響 AN3CA細(xì)胞：與對(duì)照組相比，加用TGF-β1處理后AN3CA細(xì)胞凋亡率增加，使用鹽酸貝那普利8 μmol/L處理后細(xì)胞凋亡率下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表5，圖3)。

圖3 AN3CA細(xì)胞凋亡圖注：A.對(duì)照組;B.實(shí)驗(yàn)組;C.BNPL5組;D.BNPL8組

表5 AN3CA細(xì)胞凋亡率

hESC細(xì)胞：與對(duì)照組比較，加用TGF-β1處理后細(xì)胞凋亡情況無明顯變化。使用鹽酸貝那普利8 μmol/L共培養(yǎng)后，細(xì)胞凋亡率增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表6，圖4)。

圖4 hESC細(xì)胞凋亡圖注：A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

表6 hESC細(xì)胞凋亡率

2.5 鹽酸貝那普利對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)AN3CA、hESC細(xì)胞的FN含量的影響 AN3CA細(xì)胞：根據(jù)分組處理4組細(xì)胞，終止培養(yǎng)后用免疫熒光法檢測FN表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)組FN表達(dá)量較對(duì)照組顯著增加(P<0.001)，BNPL8組表達(dá)量較實(shí)驗(yàn)組降低(P<0.001)(表7，圖5)。

表7 AN3CA細(xì)胞FN測定表

圖5 AN3CA細(xì)胞FN免疫熒光圖(100×)注：A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組；C.BNPL5組；D.BNPL8組

hESC細(xì)胞：終止培養(yǎng)后用免疫熒光法檢測FN表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)組FN表達(dá)量較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BNPL8組FN表達(dá)量較實(shí)驗(yàn)組降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表8，圖6)。

圖6 hESC細(xì)胞FN免疫熒光圖(免疫熒光，100×)注：A.對(duì)照組;B.實(shí)驗(yàn)組;C.BNPL5組;D.BNPL8組

表8 hESC細(xì)胞免疫熒光FN測定表

2.6 鹽酸貝那普利對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的AN3CA、hESC細(xì)胞的FN、TGF-β1、smad3蛋白含量的影響 根據(jù)分組分別處理4組細(xì)胞，終止培養(yǎng)后應(yīng)用Western blot檢測FN、TGF-β1、smad3的蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，2種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組FN、TGF-β1、smad3含量較對(duì)照組均顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BNPL5組、BNPL8組較實(shí)驗(yàn)組FN、TGF-β1、smad3均有明顯降低(表9～表10，圖7～圖8)。

表9 AN3CA細(xì)胞Western blot測定表

表10 hESC細(xì)胞Western Blot測定表

圖7 AN3CA細(xì)胞FN、TGF-β1、smad3的Western blot檢測灰度圖

圖8 hESC細(xì)胞FN、TGF-β1、smad3的Western blot檢測灰度圖

3 討論

TGF-β1-smad2/smad3途徑是參與子宮內(nèi)膜纖維化的主要信號(hào)通路之一，TGF-β作為該通路的配體，結(jié)合細(xì)胞表面的1型和2型受體，即絲/蘇氨酸激酶，觸發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至2型受體，使1型受體磷酸化激活R-smad(smad1、2、3、5、8)，R-smad結(jié)合到Co-smad的結(jié)合位點(diǎn)上，從而使信號(hào)分子能跨越細(xì)胞核膜，將信息傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄[13]，正常情況下該通路維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，TGF-β1為該通路的始動(dòng)因子，smad3是該信號(hào)通路的下游因子。有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用SD大鼠進(jìn)行宮腔搔刮構(gòu)建宮腔粘連模型后，其TGF-β1及smad3蛋白表達(dá)增加，表明smad3蛋白的過度表達(dá)在子宮內(nèi)膜纖維化進(jìn)展中可能發(fā)揮重要作用[14]；纖維連接蛋白(FN)是細(xì)胞外基質(zhì)的主要纖維成分之一，目前發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞均可分泌纖維連接蛋白，其中間質(zhì)細(xì)胞分泌纖維連接蛋白的作用更加明顯，它們的共同作用參與子宮內(nèi)膜纖維化的進(jìn)展；目前，纖維連接蛋白被認(rèn)為是纖維化程度的判斷因子[15]，當(dāng)子宮內(nèi)膜纖維化發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞-間質(zhì)化的比例增加，上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，其分泌纖維連接蛋白的能力隨之增加，稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)，EMT有助于纖維化的發(fā)展[16]。

目前大量研究認(rèn)為,血管緊張素II(Angiotensin II,ATII)可能作為TGF-β1-smad2/smad3信號(hào)通路的上游因子調(diào)控纖維化[17-18]，并且有大量研究證明ACEI類藥物可以通過TGF-β1參與的信號(hào)通路改善腎、肺、肝等臟器的纖維化[7-9,19]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用TGF-β1誘導(dǎo)AN3CA細(xì)胞及hESC細(xì)胞纖維化，并給予鹽酸貝那普利作用于2種細(xì)胞，擬探索ACEI類藥物鹽酸貝那普利對(duì)人子宮內(nèi)膜細(xì)胞纖維化的影響。結(jié)果顯示，AN3CA細(xì)胞用TGF-β1處理后，細(xì)胞形態(tài)呈纖維化樣改變，細(xì)胞活力降低，用貝那普利處理后，細(xì)胞活力部分恢復(fù)(雖然CellTiter-Glo顯示并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以看到使用鹽酸貝那普利后細(xì)胞的增殖活力呈現(xiàn)上升趨勢)，細(xì)胞形態(tài)部分逆轉(zhuǎn)，F(xiàn)N、TGF-β1以及smad3蛋白在給予鹽酸貝那普利治療后表達(dá)量均較TGF-β1損傷組顯著下降；用TGF-β1誘導(dǎo)hESC細(xì)胞后細(xì)胞形態(tài)無改變，但細(xì)胞增殖活力增強(qiáng)，鹽酸貝那普利抑制了TGF-β1處理后的hESC細(xì)胞增殖活力(CellTiter-Glo顯示，使用鹽酸貝那普利后細(xì)胞的增殖活力下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，增加了該細(xì)胞的凋亡水平，并且鹽酸貝那普利治療組FN、TGF-β1以及smad3蛋白表達(dá)量均顯著低于TGF-β1處理組。子宮內(nèi)膜主要由腺體發(fā)揮正常生物學(xué)功能，腺體由子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞構(gòu)成，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞參與子宮內(nèi)膜的再生和修復(fù)，有利于抵抗炎癥和纖維化，而子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞主要參與炎癥、纖維化的發(fā)展。本結(jié)果顯示，TGF-β1可降低AN3CA細(xì)胞的增殖活性，增加凋亡，降低其正常生物學(xué)活性，使子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥和纖維化；TGF-β1誘導(dǎo)后，hESC細(xì)胞的增殖活性增加，使其參與炎癥和纖維化進(jìn)展的功能增強(qiáng)。因此，本研究證明，TGF-β1同時(shí)促進(jìn)了AN3CA細(xì)胞和hESC細(xì)胞的纖維化進(jìn)展。鹽酸貝那普利可以通過促進(jìn)TGF-β1損傷后的AN3CA細(xì)胞的增殖活力降低其凋亡水平，并降低FN、TGF-β1、smad3蛋白表達(dá)水平，從而保護(hù)TGF-β1誘導(dǎo)纖維化的AN3CA細(xì)胞，延緩其纖維化進(jìn)展；同時(shí)鹽酸貝那普利可以通過抑制TGF-β1處理后hESC細(xì)胞的增殖活力增加其凋亡水平，并降低其FN、TGF-β1、smad3蛋白表達(dá)水平，從而降低hESC細(xì)胞的生物學(xué)功能，延緩其纖維化進(jìn)展。因此，研究證明鹽酸貝那普利同時(shí)改善了AN3CA細(xì)胞及hESC細(xì)胞的纖維化改變。

宮腔操作后子宮內(nèi)膜損傷是臨床上宮腔粘連的主要原因，在宮腔操作前或操作后給予患者安全濃度的貝那普利處理，是否可以降低患者的宮腔粘連率仍需要進(jìn)一步探索。