張 月，王耀一，武雪亮，張志生，楊修明，姜 洋，喬志飛，梁晚平，薛 軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北 張家口 075000)

乳腺癌已被證實(shí)是一種個(gè)體異質(zhì)性腫瘤，三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)生物學(xué)上更具有侵襲性，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的靶向治療藥物，內(nèi)科治療仍以化療為主，可供選擇的治療藥物有限，臨床預(yù)后較差[1-2]。故TNBC 治療研究的焦點(diǎn)逐漸集中在靶向藥物，而多手段聯(lián)合應(yīng)用為TNBC 的治療提供了良好的前景。

Aurora 激酶作為一個(gè)新的研究靶點(diǎn)，其相關(guān)抑制劑聯(lián)合放療已成為治療TNBC的研究方向[2]。AZD1152為高選擇性Aurora B抑制劑，已被證實(shí)可有效誘導(dǎo)急性骨髓淋巴細(xì)胞系凋亡[3]，但關(guān)于AZD1152抑制TNBC的研究較少，125I 放射性粒子治療又稱“粒子刀”，是將放射性粒子植入腫瘤內(nèi)部，利用放射性核素衰變發(fā)射射線持續(xù)作用于腫瘤，導(dǎo)致DNA損傷，阻滯細(xì)胞于G2/M期，從而達(dá)到抑制腫瘤增殖的目的[4]。研究[5-6]表明125I放射性粒子可增加AZD1152對(duì)TNBC治療的敏感性。因此，本研究旨在探索125I 放射性粒子聯(lián)合AZD1152 處理對(duì)TNBC 細(xì)胞增殖和凋亡的影響，從而為TNBC新治療方法的開展提供試驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑

MDA-MB-231細(xì)胞系由河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室傳代保存。AZD1152由Selleck Chemicals公司惠贈(zèng)(S1147)。RPMI-1640 培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自新西蘭Hyclone 公司；BCA 蛋白分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce 公司；CCK-8 細(xì)胞增殖及毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索來(lái)寶公司(CA1210)；磷酸化組蛋白H3(phosphorylated histone H3，p-Histone H3)、細(xì)胞周期蛋白B1(Cyclin B1)、Bcl-XL、Bcl-2、腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly adenosinediphosphateribose polymerase，PARP)、β-actin 一抗均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司。染料Hoechst 333342 購(gòu)于美國(guó)Invitrogen 公 司(BLI894A-1)；Annexin V/碘化丙啶(propidium iodide，PI)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司。

1.2 方 法

1.2.1 體外125I 粒子照射模型125I 粒子離體照射模型采用約3 mm 厚的聚苯乙烯板構(gòu)成框架，設(shè)計(jì)為抽屜式方便放入及取出粒子，框架將細(xì)胞的培養(yǎng)皿/板作為上層，將粒子盤作為下層，14個(gè)4.5 mm×0.8 mm的粒子凹槽以等距離方式刻在以35 mm為直徑(d)的圓形粒子盤上，保證粒子的位置穩(wěn)定，細(xì)胞培養(yǎng)板放在照射模型上方，可放置活動(dòng)度一致的粒子，讓培養(yǎng)皿中心與粒子盤中心相對(duì)應(yīng)，使12 mm為粒子盤距培養(yǎng)皿底部的距離(h)，即d/h為2.9，將其放于孵箱中，調(diào)整細(xì)胞密度為8×104個(gè)/孔，劑量為2.77 cGy/h，照射1 min，順時(shí)針定期轉(zhuǎn)動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)皿保證均勻照射。

1.2.2 熒光染料顯色觀察細(xì)胞核的變化鋪6 孔板，細(xì)胞數(shù)目為8×104個(gè)/孔，MDA-MB-231 細(xì)胞分為對(duì)照組(RPMI-1640 培養(yǎng)液)和1 μmol/L AZD1152 作用組，分別處理細(xì)胞24、48 h 后，PBS 沖洗，用Hoechst 33342(5 μg/mL)染色，因?yàn)镠oechst 33342 為DNA 特異性染料，可將細(xì)胞核染為藍(lán)色，室溫孵育30 min后在倒置熒光顯微鏡(萊卡，德國(guó))下觀察細(xì)胞核的變化。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率將MDA-MB-231細(xì)胞分為對(duì)照組(RPMI-1640培養(yǎng)液)、125I粒子照射組(照射組)、1 μmol/L AZD1152作用MDA-MB-231細(xì)胞48 h 組(抑制組)、125I 粒子照射與1 μmol/L AZD1152 聯(lián)合作用MDA-MB-231 細(xì)胞48 h 組(聯(lián)合組)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，各組處理后加入四甲基噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)，溫箱孵育4 h后棄上清，加入二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)震蕩10 min 溶解顯色，用酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力將MDA-MB-231 細(xì)胞接種到96 孔板中，分組同1.2.3。每組分別孵育12、24、36、48 h，每孔添加10 μL 的CCK-8 試劑，37 ℃，孵育2～3 h，使用酶標(biāo)儀(Thermo)檢測(cè)波長(zhǎng)460 nm處的光密度值。

1.2.5 細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞分組同1.2.3，對(duì)照組和抑制組各設(shè)24、48 h 2個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。胰酶消化收集細(xì)胞，用7 mL PBS 洗滌，1 000 r/min 離心5 min，無(wú)水乙醇固定，繼續(xù)離心將乙醇棄去，加入PI/RNase后，在流式細(xì)胞儀上分析，應(yīng)用Multicycle 軟件分析細(xì)胞倍數(shù)和周期。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡分組同1.2.3，收集細(xì)胞，PBS洗滌，分別加入Annexin V和PI(5 mg/L)各5 μL，混勻，室溫避光孵育15 min 后，加入500 μL結(jié)合緩沖液，4 ℃靜置30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)按1.2.3 處理MDA-MB-231 細(xì)胞后常規(guī)進(jìn)行裂解、變性、蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜。封閉后將膜轉(zhuǎn)入p-Histone H3、Histone H3、Cyclin B1、Bcl-XL、Bcl-2 和PARP 一抗稀釋(1∶1 000)液中，4 ℃冰箱搖床過(guò)夜，TBST洗膜，每次10 min，洗3次，室溫羊抗兔二抗孵育1 h，洗膜后ECL 發(fā)光，曝光[7]。應(yīng)用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件分析數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，不同組間差異的比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AZD1152誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞多核的形成

熒光染料顯色觀察對(duì)照組MDA-MB-231細(xì)胞系培養(yǎng)24 和48 h 后可見正常的核形態(tài)，未見多核細(xì)胞(圖1A 和C)；1 μmol/L AZD1152 作用24 h 可見正常的核分裂(圖1B)，作用48 h 時(shí)可見到多核細(xì)胞(圖1D 箭頭所示)。

圖1 熒光染色顯示AZD1152誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞多核形成

2.2 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)細(xì)胞增殖的影響

MTT 檢測(cè)結(jié)果見圖2。對(duì)照組的抑制率為(0.61±0.32)%，與對(duì)照組比較，照射組、抑制組、聯(lián)合組細(xì)胞的增殖抑制率分別為(17.62±1.41)%、(29.67±0.41)%、(53.17±1.26)%，均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞抑制率的影響

2.3 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)細(xì)胞存活率的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果見圖3。孵育12、24、36和48 h時(shí)對(duì)照組的細(xì)胞存活率分別為(97.85±0.02)%、(96.75±0.21)%、(95.83±0.31)%、(94.88±0.22)%，照射組為(75.12±0.11)%、(68.09±0.21)%、(65.11±0.34)%、(59.21±0.14)%，抑制組為(65.33±0.31)%、(60.27±0.25)%、(59.03±0.31)%、(42.05±0.17)%，聯(lián)合組為(56.15±0.28)%、(50.25±0.52)%、(43.17±0.44)%、(32.12±0.36)%，照射組、抑制組和聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率均較對(duì)照組明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在48 h作用最明顯。

圖3 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞存活率的影響

2.4 125I 粒子聯(lián)合AZD1152 對(duì)細(xì)胞周期和DNA 倍體的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖4。抑制組在48 h 時(shí)，在細(xì)胞周期G1 期、G2 期、S 期和M 期均出現(xiàn)了多倍體，或更高DNA 含量的細(xì)胞數(shù)目增加，形成明顯的G2/M 期阻滯(圖4D)，125I 粒子照射組較抑制組在24 h時(shí)G2/M 期阻滯升高，125I 粒子照射與1 μmol/L AZD1152聯(lián)合作用48 h組易誘導(dǎo)發(fā)生多核、多倍體形成，出現(xiàn)G2/M 期阻滯最明顯，最終發(fā)生凋亡(見表1，圖4F)。

圖4 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞DNA倍體的影響

表1 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期的影響

2.5 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示125I 粒子照射組、抑制組、聯(lián)合組細(xì)胞的凋亡率分別為(17.48±0.24)%、(29.23±0.02)%、(63.11±0.27)%，與對(duì)照組的(0.31±0.03)%相比明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見125I 粒子照射與1 μmol/L AZD1152 聯(lián)合作用組，細(xì)胞的凋亡率增加最顯著(圖5)。

圖5 125I粒子聯(lián)合AZD1152對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率的影響

2.6 125I 粒子聯(lián)合AZD1152 對(duì)細(xì)胞p-Histone H3、Cyclin B1、Bcl-2、Bax、PARP的影響

Western blot 檢測(cè)結(jié)果見圖6。抑制組和聯(lián)合組抗凋亡蛋白Bcl-2、組蛋白H3的磷酸化和Cyclin B1蛋白表達(dá)減少，而促凋亡蛋白Bax 和PARP 剪切體明顯增強(qiáng)。125I 粒子聯(lián)合AZD1152 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期和凋亡蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析見圖7。與對(duì)照組比較，聯(lián)合組Bcl-2、磷酸化組蛋白H3和Cyclin B1蛋白表達(dá)水平明顯減少(均為P<0.05)；PARP 剪切體和Bax 蛋白的表達(dá)水平明顯升高(均為P<0.05)，提示聯(lián)合組可有效抑制磷酸化組蛋白H3 及Cyclin B1 的表達(dá)，促進(jìn)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡。

圖6 Western blot檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖7 125I 粒子聯(lián)合AZD1152 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

TNBC 作為惡性行為最高的一類乳腺癌，具有侵襲性強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、易復(fù)發(fā)、分期晚及患者的預(yù)后差等特點(diǎn)，目前化療仍然為TNBC 最主要的系統(tǒng)性治療措施，因此如何進(jìn)行個(gè)體化的精準(zhǔn)治療是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。此外針對(duì)TNBC的局部治療(包括手術(shù)及放療)亦不容忽視，局部放療又包括體內(nèi)照射和體外照射，放射線可破壞DNA 的完整性，使細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[5-6]。放射性核素125I粒子治療屬于體內(nèi)照射，其通過(guò)破壞DNA 結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞核遭到破壞，從而殺傷癌細(xì)胞。125I粒子半衰期較長(zhǎng)可持續(xù)近距離殺傷腫瘤細(xì)胞[8]。125I 粒子照射在前列腺、肺癌、肝癌、胰腺癌、直腸癌和脊柱轉(zhuǎn)移瘤等治療中療效顯著[9-10]，但是關(guān)于乳腺癌的報(bào)道相對(duì)較少，單獨(dú)的放射治療不能成為乳腺癌治療的唯一手段，新型小分子靶向治療與放射聯(lián)合成為治療晚期乳腺癌的新方向。

Aurora 激酶作為潛在的乳腺癌治療靶點(diǎn)，可參與細(xì)胞周期檢查點(diǎn)而發(fā)揮作用。Aurora 激酶可控制中心體循環(huán)，調(diào)節(jié)染色體凝聚和協(xié)調(diào)，并影響紡錘體形成和胞質(zhì)分裂，參與G2 向M 期過(guò)渡[11]。在有絲分裂期Aurora B 激酶可催化組蛋白起作用，組蛋白在細(xì)胞周期G2 晚期達(dá)到高峰，隨著細(xì)胞周期進(jìn)行，可擴(kuò)展到染色體的各個(gè)部分，磷酸化組蛋白H3 持續(xù)存在于整個(gè)有絲分裂期過(guò)程中[12]。Cyclin B1是調(diào)控細(xì)胞增殖過(guò)程的周期蛋白，與組蛋白同時(shí)起作用，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入G1期，Cyclin B1 蛋白的表達(dá)較低，隨著細(xì)胞周期的推進(jìn)，到S 期和G2 期其表達(dá)逐漸升高，并與CDK1 形成有絲分裂促進(jìn)因子(mitosis promoting factor，MPF)酶復(fù)合物，直到G2 晚期Cyclin B1 蛋白的表達(dá)達(dá)到峰值，一直持續(xù)到有絲分裂中末期[13-15]。

AZD1152 是Aurora 激酶的特異性抑制劑[3，16]，AZD1152 抑制磷酸化組蛋白H3，出現(xiàn)G2/M 期阻滯，使4倍體或更高DNA含量的細(xì)胞數(shù)量增加，多核細(xì)胞及多倍體細(xì)胞產(chǎn)生以及細(xì)胞凋亡增多。本研究顯示1 μmol/L AZD1152 作用MDA-MB-231 細(xì)胞48 h 出現(xiàn)多核細(xì)胞和多倍體細(xì)胞，易發(fā)生細(xì)胞凋亡。在后續(xù)的研究中，將125I 粒子照射與1 μmol/L AZD1152 聯(lián)合進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率為(53.17±1.26)%，細(xì)胞存活率為(32.12±0.36)%，G2/M期阻滯達(dá)到(75.52±0.45)%，且聯(lián)合組中抗凋亡蛋白Bcl-2、磷酸化組蛋白及Cyclin B1 減少而促凋亡蛋白Bax、PARP剪切體增加明顯，凋亡率為(63.11±0.27)%。

綜上所述，125I 粒子對(duì)AZD1152 有增敏作用，125I聯(lián)合Aurora激酶抑制劑AZD1152可抑制MDA-MB-231細(xì)胞組蛋白H3 磷酸化及Cyclin B1 水平，從而抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)凋亡，為晚期三陰性乳腺癌治療提供了新思路。