張玉鈴，劉迪填，陳春發(fā)

(1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)療質(zhì)量管理科，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院胸部外科，廣東 汕頭 515041；3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺中心，廣東 汕頭 515041)

食管癌是惡性實(shí)體腫瘤之一，在所有癌癥中其發(fā)病率居第7 位，死亡率居第6 位。原發(fā)性食管小細(xì)胞癌(primary esophageal small cell carcinoma，PESC)是最為常見的肺外小細(xì)胞癌。根據(jù)2019年世界衛(wèi)生組織的分類，PESC 是神經(jīng)內(nèi)分泌癌一種亞型[1]，是一種少見的侵襲性惡性疾病。1952 年，McKeown 等[2]首次報(bào)道了PESC，主要發(fā)生在食管中下節(jié)段，約占我國所有食管腫瘤的0.36%～2.81%[3]，其臨床表現(xiàn)與食管鱗癌及腺癌相似。但與鱗癌、腺癌相比，其生長(zhǎng)更快、侵襲性更強(qiáng)，早期便可出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移，因此預(yù)后也更差。由于其罕見性和缺乏前瞻性研究，目前尚缺乏標(biāo)準(zhǔn)的治療方案和預(yù)后標(biāo)記物。

越來越多的研究顯示，巨噬細(xì)胞在不同腫瘤微環(huán)境的刺激下發(fā)生的活化性質(zhì)不盡相同，其表達(dá)的表型及各自發(fā)揮的功能也不相同，使得腫瘤患者出現(xiàn)不同的疾病發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。對(duì)于這些浸潤(rùn)在腫瘤中的巨噬細(xì)胞，我們將其統(tǒng)稱為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumorassociated macrophages，TAMs)。目前認(rèn)為浸潤(rùn)在腫瘤中的巨噬細(xì)胞按不同的活化狀態(tài)主要分為2 種類型：①M(fèi)1型，又稱經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞，具有抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；②M2型，又稱替代性活化的巨噬細(xì)胞，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤疾病的進(jìn)展[4-5]。TAMs與PESC臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性尚缺乏充分的研究，近來研究表明，CD68是一種可用于標(biāo)記M1、M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，而CD163 是一種可特異性識(shí)別M2 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物[6-7]。因此本研究采用CD68 與CD163 分別標(biāo)記巨噬細(xì)胞，嘗試了解M1及M2型TAMs在PESC中的浸潤(rùn)情況，并分析其與PESC的臨床病理指標(biāo)及預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床病例及標(biāo)本

收集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院2000年1月—2019 年12 月有完整臨床病理資料的PESC 患者手術(shù)切除組織標(biāo)本。該研究已獲得汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)療技術(shù)醫(yī)學(xué)倫理審查委員會(huì)的審查批準(zhǔn)通過(批準(zhǔn)文號(hào)2019030)?；颊呋蚱浼覍偻鈪⑴c該研究并簽署知情同意書。所有患者在手術(shù)前均未接受任何治療，首次治療為食管部分切除并頸內(nèi)食管胃吻合術(shù)及區(qū)域淋巴結(jié)清掃，術(shù)后分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會(huì)2017年第8 版TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[8]。本研究共收集標(biāo)本69例，其中男性49例，女性20例，年齡44～76歲，中位年齡61歲。

1.2 主要抗體和試劑

鼠抗人CD68 及CD163 單克隆抗體，DAB 顯色試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果判定

免疫組化EnVision 二步法操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行。CD68陽性巨噬細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為標(biāo)記，CD163 陽性巨噬細(xì)胞則以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)黃褐色或棕褐色顆粒為標(biāo)記。計(jì)數(shù)CD68和CD163 巨噬細(xì)胞數(shù)量的方法參考本課題組已發(fā)論文[9]，在低倍鏡(×100)下觀察整張切片，選取陽性細(xì)胞最密集區(qū)，利用LEICA數(shù)字圖像采集系統(tǒng)于高倍視野(×400)下選取5～10 個(gè)陽性細(xì)胞最密集部位拍照，計(jì)算每張不重疊照片內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)并取平均值代表該例標(biāo)本瘤內(nèi)浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)值，選擇中位數(shù)為高、低浸潤(rùn)分組的截?cái)帱c(diǎn)[10-11]。

1.4 隨 訪

從患者術(shù)后出院起開始隨訪，主要采用門診及電話隨訪，隨訪截止時(shí)間為2021 年12 月或死亡，生存時(shí)間從患者手術(shù)之日起至最后隨訪時(shí)間或死亡時(shí)間，死亡不包括意外死亡者。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CD68和CD163 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況與患者臨床病理指標(biāo)關(guān)系的分析采用卡方檢驗(yàn)和Fisher 精確檢驗(yàn)，Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox 回歸分析各變量與預(yù)后的關(guān)系，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PESC組織中CD68、CD163巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況

免疫組化染色顯示CD68 及CD163 為胞質(zhì)或胞膜染色，在腫瘤組織中可見胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯棕黃色或棕褐色顆粒的細(xì)胞浸潤(rùn)，這部分細(xì)胞就是TAMs(圖1)。PESC 組織中CD68、CD163 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度平均每個(gè)視野為(16.1±7.9)個(gè)和(10.5±5.1)個(gè)，中位數(shù)分別為15.0 個(gè) 和9.3 個(gè)。CD68 高 浸潤(rùn)組36 例(52.2%，36/69)，CD163高浸潤(rùn)組織占35例(50.7%，35/69)。

圖1 食管小細(xì)胞癌組織中CD68和CD163巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)情況(IHC，×400)

2.2 CD68、CD163巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況與PESC臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

如表1所示，CD68巨噬細(xì)胞除了與腫瘤T分期有關(guān)(χ2=6.336，P=0.012)外，與其他臨床病理指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。T1-T2 分期的PESC 患者中CD68 巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)情況更常見。而CD163巨噬細(xì)胞與各臨床病例指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)。

表1 CD68、CD163巨噬細(xì)胞與食管小細(xì)胞癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系

2.3 PESC總體生存情況及影響因素分析

69 例患者生存時(shí)間為2～209 個(gè)月，中位生存時(shí)間21個(gè)月。按不同臨床病理指標(biāo)分類的患者中位生存期和總生存期如表2 所示，其中pTNM 分期、手術(shù)淋巴結(jié)清掃數(shù)目、N分期、輔助性化療、CD68巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況對(duì)中位生存期均有影響(組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05)。其中，PESC原發(fā)灶中CD68巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)的患者預(yù)后更好(圖2)。

表2 食管小細(xì)胞癌患者生存分析

圖2 食管小細(xì)胞癌組織中CD68和CD163巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的生存分析

2.4 PESC患者預(yù)后的多因素分析

將表2 中Kaplan-Meier 生存分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)pTNM 分期、手術(shù)淋巴結(jié)清掃數(shù)目、N 分期、輔助性化療、CD68巨噬細(xì)胞等參數(shù)分別納入多因素Cox 回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pTNM 分期、手術(shù)淋巴結(jié)清掃數(shù)目、CD68 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是PESC 患者獨(dú)立的預(yù)后影響因素(表3)。CD68 巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度與患者的預(yù)后顯著相關(guān)[風(fēng)險(xiǎn)比=0.340，95%置信區(qū)間(0.179，0.645)，P=0.001]，CD68巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)組的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)降低約66%。

表3 PESC患者預(yù)后的多因素Cox回歸分析

3 討論

在PESC 的發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤免疫微環(huán)境起著關(guān)鍵作用。其中，起源于外周血單核細(xì)胞的TAMs是腫瘤免疫微環(huán)境的重要組成部分。作為腫瘤微環(huán)境中的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，TAMs 可極化成M1 或M2 表型，細(xì)胞表型的不同可導(dǎo)致不同的細(xì)胞因子分泌和功能的變化[12]。一般認(rèn)為M1型TAMs 具有限制腫瘤生長(zhǎng)的功能[13]，而M2型TAMs 更多的是與血管生成和腫瘤進(jìn)展有關(guān)[14]。常用檢測(cè)TAMs 相關(guān)表面標(biāo)志物包含CD68、CD206 和CD163 等等。目前缺乏標(biāo)記M1 型巨噬細(xì)胞的特異性標(biāo)記物，一般認(rèn)為CD68可作為巨噬細(xì)胞M1型的標(biāo)記物[15]。與常用于標(biāo)記M1 型巨噬細(xì)胞的CD68相比，特異性標(biāo)記CD163 檢測(cè)M2 型細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞具有更強(qiáng)的針對(duì)性，故CD163 可作為M2 型巨噬細(xì)胞高特異性標(biāo)志物[16]。

本研究中，我們用CD68、CD163分別標(biāo)記巨噬細(xì)胞，分析其與PESC 臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅CD68巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)與腫瘤的T分期相關(guān)，T1-T2分期中的CD68 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度更高。而CD68、CD163 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的情況和其他臨床病理指標(biāo)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在臨床上，惡性腫瘤的T 分期越早的患者往往具有更好的預(yù)后結(jié)果，這可能預(yù)示著高浸潤(rùn)C(jī)D68 巨噬細(xì)胞的PESC 患者可能具有更好的生存結(jié)果。鑒于CD68 常常被作為M1 型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物，我們推測(cè)以M1 型巨噬細(xì)胞為主的CD68 巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，在早期PESC 抗腫瘤中起著重要作用。而CD163巨噬細(xì)胞與各病理指標(biāo)間均無明顯相關(guān)，這點(diǎn)與以往其他惡性腫瘤的相關(guān)研究不符[17-18]。一方面可能與本實(shí)驗(yàn)PESC 例數(shù)少有關(guān)，另一方面也有可能CD163 巨噬細(xì)胞在不同的惡性腫瘤所起的作用不一樣，需要擴(kuò)充樣本量以及進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

本研究的多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示，pTNM分期、手術(shù)淋巴結(jié)清掃數(shù)目、CD68巨噬細(xì)胞表達(dá)是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，CD68巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度高的患者生存期較長(zhǎng)。這與之前報(bào)道的在前列腺、肺和腦腫瘤中的情況相符[19]。另外生存曲線顯示CD163 巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)患者與低浸潤(rùn)患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，該結(jié)果與其他實(shí)性腫瘤如宮頸癌、食管鱗癌、乳腺癌等相左[11，20-21]，這可能與本實(shí)驗(yàn)例數(shù)相對(duì)較少有關(guān)，也有可能與CD163巨噬細(xì)胞在不同類型的惡性腫瘤中的作用不一致有關(guān)。

雖然CD68是一種可用于標(biāo)記M1、M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，但目前有研究支持CD68可作為M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記物[15，21]。結(jié)合本研究的結(jié)果，我們推測(cè)在PESC 組織中浸潤(rùn)的CD68 巨噬細(xì)胞以具有抗腫瘤作用的M1 型巨噬細(xì)胞為主。當(dāng)然，還需要尋找更具有特異性M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

在PESC 治療上尚缺乏前瞻性隨機(jī)對(duì)照臨床研究及治療規(guī)范，手術(shù)是PESC 局部控制的常用手段，而后續(xù)聯(lián)合化療可以進(jìn)一步改善患者預(yù)后[22]。我們的研究結(jié)果也顯示術(shù)后接受化療的患者預(yù)后優(yōu)于未化療的患者，最近的研究結(jié)果也支持化療明顯提高PESC 患者的生存[23]。另外，基于前面提到的M1型巨噬細(xì)胞和M2型巨噬細(xì)胞在腫瘤中作用的不同，是否可以通過調(diào)控TAMs表型轉(zhuǎn)化，使腫瘤組織中浸潤(rùn)的M2型巨噬細(xì)胞向M1 型轉(zhuǎn)化，達(dá)到有效地抑制腫瘤細(xì)胞增殖和發(fā)展而起到治療作用，這將會(huì)是一個(gè)很有意義的研究方向。

綜上所述，高浸潤(rùn)的CD68巨噬細(xì)胞是PESC患者的獨(dú)立預(yù)后因子，CD68巨噬細(xì)胞高浸潤(rùn)的患者預(yù)后明顯優(yōu)于CD68巨噬細(xì)胞低浸潤(rùn)的患者。