王 婷，張雯雯，張永欣，曾 勇，王俊玲，李成云

(蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730000)

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，長度為21～25 個(gè)核苷酸，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，是一類重要的高度保守的非編碼小分子單鏈RNA，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)活性的功能[1]。大量研究證實(shí)miRNA異常表達(dá)可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，并影響其發(fā)展和預(yù)后[2-3]。Hou 等[4]研究發(fā)現(xiàn)miRNA 與食管癌的發(fā)生相關(guān)，可作為潛在的腫瘤診斷或預(yù)后判定標(biāo)志。

已有研究發(fā)現(xiàn)，由兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)的miRNA基因組成的miRNA 基因簇(miRNA cluster)總是以多順反子轉(zhuǎn)錄并具有相似的表達(dá)模式[5]，作用共同的靶基因或同一信號通路中的蛋白分子，從而多層次地監(jiān)控該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這種多靶點(diǎn)調(diào)控比單個(gè)miRNA的作用模式更復(fù)雜，功能更高效[6]。而目前關(guān)于miRNA 與食管癌的研究多局限于單一或成熟的miRNA。因此，對miRNA基因簇的深入研究有助于更好的探索食管癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制[7]。

本研究采用高通量芯片測序技術(shù)對食管癌患者癌組織及癌旁組織差異表達(dá)的miRNAs 表達(dá)譜進(jìn)行分析?；诘捅磉_(dá)較為顯著的miR-101-3p，據(jù)miRbase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)顯示：miR-101基因簇由has-miR-101-3p、has-miR125a-5p、has-miR-127-5p與has-miR-145-5p 基因共同組成。目前，對于miR-101 基因簇有研究報(bào)道has-miR-101-3p 和has-miR-1455p 在食管癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)且發(fā)揮競爭內(nèi)源性RNA功能，可影響靶基因功能，調(diào)控食管癌發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，但確切功能機(jī)制仍不明確；has-miR125a-5p和has-miR-127-5p 在食管癌調(diào)控方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在通過檢測miR-101基因簇編碼的各miRNA在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)水平，進(jìn)而分析該基因簇的表達(dá)與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，擬為后續(xù)miR-101基因簇在食管癌進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集與microRNA芯片高通量檢測

收集并選取甘肅省武威腫瘤醫(yī)院2019—2020年收治的食管癌進(jìn)展期3 例患者(男性2 例，女性1 例)癌組織及其癌旁組織(距癌組織邊緣大于5 cm)新鮮標(biāo)本進(jìn)行組織芯片高通量microRNA 檢測；另收集33 例食管癌患者(男性28 例，女性5 例)癌組織及其癌旁新鮮組織標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescence quantitative PCR，qPCR)檢測。所有食管癌患者術(shù)前均未接受放化療及免疫治療，對所采集的全部組織標(biāo)本進(jìn)行病理組織形態(tài)學(xué)檢查，病理檢查采用常規(guī)HE染色，并由2 位專職病理醫(yī)師完成，食管癌組織標(biāo)本鏡檢腫瘤組織大于80%，癌旁對照組織鏡檢均未發(fā)現(xiàn)腫瘤組織。將采集的組織樣品(約0.5 cm3)浸入RNAlater 中，并在-80 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。人群生物樣本收集通過甘肅省蘭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院倫理委員會(huì)的審查(倫理審查編號為LZUGWLL-180301)。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫原始數(shù)據(jù)下載及分析

選取截止日期為2020年11月1日，進(jìn)入腫瘤基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/) 食管癌(esophageal carcinoma，ESCA)頁面，以miRNAseq 數(shù)據(jù)集所收錄的162 例食管癌組織樣本和11例癌旁對照組織樣本的測序數(shù)據(jù)作為本研究對象。miRNA 數(shù)據(jù)選level 3 級別，RNAseq 選項(xiàng)中勾選rsem.genes.normalized_results.txt 文件，在miRNAseq 選項(xiàng)中勾選miRNA.quantification.txt 文件，確定并開始下載。將樣本分組編號并審核是否有完整的轉(zhuǎn)錄組Illumina Seq System microRNA(Illumina Inc.，Hayward，CA，USA)測序數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)的下載和使用均經(jīng)TCGA 數(shù)據(jù)庫授權(quán)，原始測序結(jié)果可用于后續(xù)分析使用和公開發(fā)表。

1.3 主要試劑和設(shè)備

組織microRNA 芯片高通量檢測(南京金麥普生物科技有限公司)；TRIzol 試劑及RNA-later 購自美國賽默飛世爾科技公司；DEPC 購自美國Sigma-Aldrich 公司；miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p、miR-145-5P和U6基因的qPCR引物購自上海生物工程股份有限公司，相關(guān)基因引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄和qPCR試劑盒購自日本TaKaRa 公司。低溫高速離心機(jī)及水平離心機(jī)購自美國Beckman 公司；Real time PCR 擴(kuò)增儀購自美國Bio-Rad 公司；核酸蛋白測定儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

表1 miR-101基因簇相關(guān)引物序列

1.4 總RNA提取及qPCR驗(yàn)證

使用TRIzol 試劑，按試劑說明書操作提取組織總RNA，核酸蛋白測定儀NanoDrop2000檢測RNA純度及濃度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行miRNA 莖環(huán)法逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃暫存，將cDNA置于-20 ℃冰箱保存。qPCR反應(yīng)體系為25.0 μL，包括12.5 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ、10 μmol/L 上下游引物各1.0 μL、2.0 μL RT 反應(yīng)液(cDNA)、8.5 μL RNase free dH2O。反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，55～65 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)。U6為內(nèi)參，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，檢測重復(fù)3 次。qPCR 判斷基因高低表達(dá)水平采用2-ΔΔCT法，2-ΔΔCT值>1時(shí)判斷為高表達(dá)，2-ΔΔCT值<1判斷為低表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以表示。配對t檢驗(yàn)分析miR-101 基因簇在食管癌及其癌旁組織中的表達(dá)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。Logistic回歸分析miR-101基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。采用受試者特征曲線(receiver operator characteristics curve，ROC)評價(jià)miR-101 基因簇對食管癌的診斷效力，通過計(jì)算曲線下面積(area under curve，AUC)來判斷診斷價(jià)值，F(xiàn)isher 檢驗(yàn)分析基因簇各miRNA 的表達(dá)和食管癌患者臨床病理指標(biāo)之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 食管癌相關(guān)差異化表達(dá)的miRNA 篩選及miR-101基因簇表達(dá)水平TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證

對3 例新發(fā)食管鱗癌患者的食管癌組織及其癌旁組織進(jìn)行miRNA 芯片高通量檢測。結(jié)果顯示288 種miRNAs在兩種組織中表達(dá)有差異，其中在食管鱗癌組織中有179種miRNAs表達(dá)下調(diào)。miR-101基因簇相關(guān)基因在食管癌組織中下調(diào)倍數(shù)(fold change)分別為hasmiR-101-3p(-11.90)、has-miR-125a-5p(-4.76)、hasmiR-127-5p(-4.35)、has-miR-145-5p(-2.17)，見 圖1。TCGA數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證miR-101基因簇相關(guān)基因表達(dá)水平，其中TCGA數(shù)據(jù)庫162例食管癌和正常食管組織樣本11例測序數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，與食管正常組織相比，miR-101-3p、miR-125a-5p和miR-145-5p在食管癌組織中表達(dá)均顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖2。

圖1 食管癌及其癌旁組織中表達(dá)下調(diào)的部分miRNAs

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中miR-101基因簇的表達(dá)水平

2.2 miR-101基因簇在食管癌患者中的表達(dá)水平

應(yīng)用qPCR檢測miR-101基因簇在33例人群食管癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p和miR-145-5p在食管癌患者癌組織中均呈低表達(dá)(P<0.05)，見表2。結(jié)果與芯片高通量測序及TCGA數(shù)據(jù)庫生物信息學(xué)分析相符。

2.3 miR-101基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的分析

Logistic 回歸分析食管癌組織與癌旁組織中miR-101 基因簇各miRNA 的△CT值與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性，見表3。多因素logistic 回歸分析結(jié)果提示，miR-101-3p、miR-127-5p和miR-145-5p的表達(dá)水平與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，增加其表達(dá)可以顯著降低食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(均為P<0.05)。

表3 miR-101基因簇表達(dá)與食管癌發(fā)病相關(guān)性的logistic回歸分析(n=33)

2.4 miR-101基因簇對食管癌的診斷效力

采用ROC特征曲線法評價(jià)miR-101基因簇對食管癌的診斷效力，并通過計(jì)算AUC來確定食管癌的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p 診斷的AUC 分別為0.753、0.792、0.763 和0.800(P<0.05)，提示miR-101 基因簇在食管癌的診斷中具有一定診斷效力(圖3)。

圖3 miR-101基因簇對食管癌的診斷效力

2.5 miR-101 基因簇的表達(dá)與食管癌臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

對miR-101基因簇中4個(gè)基因的表達(dá)水平與33例食管癌患者的臨床病理資料進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，miR-101-3p、miR-145-5p 的表達(dá)水平與腫瘤大小相關(guān)(P<0.05)，miR-125a-5p的表達(dá)水平與是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)，其他指標(biāo)之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 miR-101基因簇表達(dá)水平與33例食管癌患者臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析

3 討論

食管癌作為惡性程度較高的消化道腫瘤之一，其病理類型中90%屬食管鱗狀細(xì)胞癌，中晚期的食管癌預(yù)后差且死亡率高[8]。目前，食管癌診斷主要依賴于內(nèi)鏡活檢后的病理形態(tài)學(xué)觀察，但其漏診率大于30%[9]，在實(shí)驗(yàn)室診斷方面尚缺乏特異性分子診斷標(biāo)志物。探尋能夠準(zhǔn)確反映食管癌癌變機(jī)制并能應(yīng)用于食管癌高危人群早期診斷的生物標(biāo)志是當(dāng)前食管癌防治的重點(diǎn)。因此，本研究在食管癌芯片高通量檢測的基礎(chǔ)上，應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)挖掘比對以及qPCR驗(yàn)證的方式研究了miR-101基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)及其作為食管癌診斷生物標(biāo)志物的可能性。

miRNA基因簇是由兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)的miRNA基因組成，并在染色體上成簇排列形成的基因群，這些基因可通過綜合調(diào)控編碼基因并在多個(gè)層面上參與個(gè)體發(fā)育、代謝過程和疾病發(fā)生的調(diào)控[10]，可作為潛在的綜合性腫瘤診斷或預(yù)后判定標(biāo)志。研究發(fā)現(xiàn)，與正常食管黏膜上皮組織比較，食管癌組織呈現(xiàn)不同的miRNA 表達(dá)模式[11]，其異常表達(dá)可為食管癌診斷和預(yù)后生物標(biāo)志的探尋提供新的方向。

miR-101 具有兩個(gè)前體發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在人類中分別在1 號和9 號染色體轉(zhuǎn)錄而成，其臨近位置成簇排列miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p。其中，miR-101-3p在食管癌[12]、肝癌[13]和子宮內(nèi)膜癌[14]中呈低表達(dá)，發(fā)揮類似抑癌基因的作用。miR-125a-5p 在食管癌[15]和膀胱癌[16]細(xì)胞中呈低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-127-5p 和miR-145-5p 在食管癌[17-18]、胃癌[19-20]和結(jié)腸癌[21]中呈低表達(dá)，也發(fā)揮抑癌基因的作用。為進(jìn)一步研究miR-101基因簇的表達(dá)與食管癌之間的關(guān)系，確認(rèn)芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究檢測了miR-101基因簇在33例食管癌及癌旁組織的表達(dá)水平。結(jié)果顯示miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p 和miR-145-5p 在食管癌組織中表達(dá)均為低表達(dá)，結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果相一致(miR-127-5p除外)。

同時(shí)，我們分析了miR-101基因簇與食管癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)增加miR-101基因簇的表達(dá)可以降低食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，臨床病理相關(guān)性分析結(jié)果提示miR-101-3p、miR-145-5p 的表達(dá)水平與食管癌患者腫瘤大小相關(guān)，miR-125a-5p 的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。表明miR-101-3p、miR-145-5p和miR-125a-5p 參與了食管癌的發(fā)生和發(fā)展，在食管癌進(jìn)程中可能發(fā)揮重要功能，提示其可作為食管癌的潛在生物標(biāo)志物。但本研究樣本的收集時(shí)間為1 年，所獲得的樣本量較小，可能不能完全代表整體水平。本研究33 例樣本中發(fā)現(xiàn)miR-127-5p 在食管癌患者癌組織中呈低表達(dá)與TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果不完全一致，這可能與樣本量較小有關(guān)，在接下來工作中我們擬收集更大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，本研究分析和檢測了miR-101基因簇在食管癌中的表達(dá)情況，miR-101-3p、miR-125a-5p、miR-127-5p和miR-145-5p的表達(dá)水平與食管癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，且miR-101-3p、miR-145-5p和miR-125a-5p的表達(dá)與食管癌患者的臨床病理因素具有相關(guān)性，提示miR-101基因簇在食管癌生物標(biāo)志研究方面具有深入研究的價(jià)值。然而，miR-101 基因簇的各基因是否作為一個(gè)整體，參與復(fù)雜的分子信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響食管癌的發(fā)生發(fā)展仍不清楚，其調(diào)控食管癌的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。