汪一萍，倪劍鋒，魯 勇，應(yīng)建飛，蔣 磊，史俊穎

1.寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江寧波 315105；2.寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司，浙江寧波 315200

碳青霉烯類抗菌藥物一直是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)或AmpC酶的腸桿菌科細(xì)菌治療首選藥物[1-2]。隨著此類抗菌藥物的廣泛使用，臨床耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率逐年升高，增加了臨床用藥的選擇難度[3-4]。產(chǎn)碳青霉烯酶是形成CRE菌株的主要耐藥機(jī)制，不同類型碳青霉烯酶具有不同的水解抗菌藥物活性，其耐藥譜也存在一定差異[5-6]。按照Ambler分子分類原則，編碼碳青霉烯酶的耐藥基因可分為A、B、D 3類[7]。本研究對(duì)2017—2020年臨床分離的CRE菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)、耐藥基因鑒定，并對(duì)耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)進(jìn)行同源性分析，為CRE的耐藥檢測(cè)，以及預(yù)防和控制CRE的院內(nèi)傳播提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集2017—2020年寧波大學(xué)附屬人民醫(yī)院臨床分離的CRE 222株，作為對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)(或參考)菌株均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2儀器與試劑 所用儀器主要包括全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海恒一科學(xué)儀器有限公司)、熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)、離心機(jī)及金屬浴(德國(guó)Eppendorf公司)。主要試劑包括大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌及3種碳青霉烯酶耐藥基因(NDM、KPC和OXA-48)檢測(cè)試劑盒(寧波基內(nèi)生物技術(shù)有限公司)，美羅培南、亞胺培南、阿米卡星與環(huán)丙沙星等抗菌藥物(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。本研究中引物的合成和擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序均由上海杰李生物技術(shù)有限公司完成。

1.3CRE菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 222株CRE菌株均使用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，并對(duì)各種抗菌藥物的耐藥率進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4CRE菌株的基因檢測(cè) (1)CRE菌株的熒光定量PCR檢測(cè)：以CRE菌株DNA為模板，分別對(duì)兩種常見(jiàn)細(xì)菌的基因進(jìn)行檢測(cè)，包括大腸埃希菌的特異性基因(ydij)和肺炎克雷伯菌的特異性基因(phoE)中3種常見(jiàn)碳青霉烯酶耐藥基因(NDM、KPC和OXA-48)，反應(yīng)體系為25 μL，包括6 μL DNA模板和19 μL PCR反應(yīng)混合液。PCR反應(yīng)條件為37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min，循環(huán)1次；93 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，循環(huán)35次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)溫度為60 ℃。熒光通道檢測(cè)選擇：ydij、KPC基因選用 FAM 通道，NDM、OXA-48 基因選用 ROX 通道，內(nèi)標(biāo)基因選用 JOE 通道。(2)基因測(cè)序：設(shè)計(jì)CRE常見(jiàn)碳青霉烯酶耐藥基因(NDM、KPC、OXA-48、IMP和VIM)引物進(jìn)行測(cè)序[8]，將CRE菌株測(cè)序后所得的序列與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)(NDM：JX104760；KPC：1i844849；OXA-48：NC_049454.1；IMP：JX104760；VIM：NG_022326.1)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，見(jiàn)表1。

表1 耐藥基因測(cè)序引物

1.5CRKP的同源性分析 以CRKP菌株DNA為模板，參考多位點(diǎn)序列分析(MLST)官方網(wǎng)站(https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella /klebsiella.html)上提供的肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB、tonB)序列合成引物，見(jiàn)表2；依次擴(kuò)增CRKP菌株的這7個(gè)管家基因。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，循環(huán)35次；72 ℃，10 min。將CRKP菌株的7個(gè)管家基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。得到測(cè)序結(jié)果后分析CRKP菌株的親緣性關(guān)系，即進(jìn)行同源性分析。

表2 肺炎克雷伯菌的7個(gè)管家基因引物序列

2 結(jié) 果

2.1菌株分布 在222株CRE中，細(xì)菌培養(yǎng)鑒定法檢出大腸埃希菌78株(35.1%)，肺炎克雷伯菌71株(32.0%)，陰溝腸桿菌28株(12.6%)，霍氏腸桿菌13株(5.9%)，費(fèi)氏檸檬酸桿菌9株(4.1%)，植生拉烏爾菌8株(3.6%)，產(chǎn)氣腸桿菌6株(2.7%)，產(chǎn)酸克雷伯菌5株(2.3%)，解鳥(niǎo)氨酸拉烏爾菌3株(1.4%)，克氏檸檬酸桿菌1株(0.5%)。將熒光定量PCR鑒定+基因測(cè)序鑒定的結(jié)果與細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，細(xì)菌培養(yǎng)鑒定為大腸埃希菌的78株中，測(cè)序鑒定76株符合細(xì)菌培養(yǎng)鑒定結(jié)果，另2株分別為產(chǎn)酸克雷伯菌與霍氏腸桿菌。細(xì)菌培養(yǎng)鑒定的符合率為97.4%。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果 222株CRE菌株對(duì)大部分抗菌藥物的耐藥率都大于80.0%，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、米諾環(huán)素具有較好的敏感性，見(jiàn)表3。

表3 222株CRE菌株對(duì)常用抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3熒光定量PCR與基因測(cè)序結(jié)果 222株CRE熒光定量PCR與基因測(cè)序同時(shí)檢出NDM基因陽(yáng)性131株(59.0%)，熒光定量PCR檢出KPC基因陽(yáng)性56株(24.3%)，基因測(cè)序檢出IMP基因陽(yáng)性13株(5.9%)，VIM基因陽(yáng)性僅有1株(0.5%)，OXA-48基因陽(yáng)性僅1株(0.5%)，熒光定量PCR未檢出耐藥基因20株(9.0%)，見(jiàn)表4。通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)耐藥基因NDM、KPC、OXA-48的檢出率為84.7%；通過(guò)基因測(cè)序檢測(cè)耐藥基因NDM、KPC、OXA-48、IMP、VIM的檢出率為91.0%。將NDM、KPC和OXA-48基因的熒光定量PCR結(jié)果與基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示NDM熒光定量PCR的陽(yáng)性符合率為98.5%，陰性符合率為97.8%；KPC基因熒光定量PCR的陽(yáng)性符合率為94.6%，陰性符合率為99.4%；OXA-48基因熒光定量PCR的陽(yáng)性符合率為100.0%，陰性符合率為100.0%。

表4 CRE耐藥基因熒光定量PCR和耐藥基因測(cè)序結(jié)果(n)

2.4MLST結(jié)果 對(duì)49株CRKP的MLST結(jié)果顯示，ST11型最多為26株，其次為ST15型7株，ST2357型4株，ST1810型3株，ST278型2株，ST2388型2株，ST86型1株，ST347型1株，ST697型1株，ST1326型1株，ST2790型1株。

3 討 論

CRE往往對(duì)多種抗菌藥物嚴(yán)重耐藥，治療極其困難，已成為全球范圍的公共衛(wèi)生問(wèn)題[9]。本研究收集的222株CRE，檢出株數(shù)位居前兩位的依次為大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌，與CHINET的調(diào)查結(jié)果一致[10]。

NDM型碳青霉烯酶于2009年在印度新德里被發(fā)現(xiàn)后迅速播散至全球，亞洲是產(chǎn)NDM型碳青霉烯酶菌株流行的主要區(qū)域[11-13]。本研究通過(guò)對(duì)78株耐碳青霉烯類大腸埃希菌(CREC)的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，大腸埃希菌以NDM基因最多(65株)，耐碳青霉烯類陰溝腸桿菌也以NDM耐藥基因?yàn)橹?，占比達(dá)85.7%(24/28)。NDM耐藥基因表型的傳播機(jī)制不同于其他碳青霉烯酶，該基因型多見(jiàn)于我國(guó)北方醫(yī)院[14]。新型含酶抑制劑的復(fù)方制劑頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)產(chǎn)金屬酶的CRE無(wú)效，但卻是目前治療產(chǎn)KPC型和OXA-48型CRE的最好藥物[15]，并且該藥適用于復(fù)雜性尿路感染和院內(nèi)獲得性肺炎[16]，是治療CRE感染的理想藥物。

自2007年浙江省報(bào)道CRKP后，相關(guān)研究也證實(shí)KPC基因是我國(guó)肺炎克雷伯菌攜帶的最常見(jiàn)的碳青霉烯酶耐藥基因[17]。本研究通過(guò)對(duì)71株肺炎克雷伯菌的基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肺炎克雷伯菌以KPC耐藥基因最多(49株)，與前文報(bào)道一致。

OXA-48耐藥基因最早發(fā)現(xiàn)于2001年的土耳其，很快引起醫(yī)院內(nèi)暴發(fā)流行，有研究表明OXA-48基因比KPC、NDM基因更易于在腸桿菌科細(xì)菌中播散[18]，主要在兒童患者中分離[19]。產(chǎn)VIM酶的CRKP最早于2001-2003年在南歐被發(fā)現(xiàn)，本研究發(fā)現(xiàn)1株攜帶VIM基因的肺炎克雷伯菌。

本研究49株CRKP的MLST結(jié)果顯示ST11型為主要的流行克隆株，占53.1%，這與ST11型CRKP為我國(guó)流行克隆株的報(bào)道一致[20]。

CRE引起的院內(nèi)感染導(dǎo)致了病死率升高與醫(yī)療成本的明顯增加，鑒于目前CRE的治療難度，采取有效措施防止耐藥菌的蔓延為當(dāng)務(wù)之急。對(duì)于此類耐藥細(xì)菌所致感染或定植的防控應(yīng)多管齊下，有效感染防控措施包括手衛(wèi)生、加強(qiáng)監(jiān)測(cè)、接觸預(yù)防、患者隔離(單間隔離或集中隔離)和環(huán)境清潔等。