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        代謝改造黑曲霉合成乙酰氨基葡萄糖

        2022-08-05 11:36:00張小茹閆榮媚曹威劉浩
        食品研究與開發(fā) 2022年15期
        關鍵詞:途徑

        張小茹,閆榮媚,曹威,3,劉浩,3*

        (1.天津科技大學生物工程學院,天津 300457;2.天津市工業(yè)微生物重點實驗室工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津 300457;3.代謝控制發(fā)酵技術國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津 300457)

        N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine,Glc-NAc)是一種重要的功能性單糖[1]。作為生物體內透明質酸、肝素等重要生物大分子的結構單元之一,在生物體多項生理功能中發(fā)揮重要作用[2]。另外,GlcNAc在微生物中廣泛存在,是幾丁質和殼聚糖的主要成分之一[3-4]。近年來,GlcNAc被廣泛應用于保健食品、醫(yī)藥、精細化工等眾多領域,展現(xiàn)出極大的市場潛力和經(jīng)濟價值[1,4]。

        目前生產(chǎn)GlcNAc的方法可分為3種:化學合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法[5-7]?;瘜W合成法是氨基葡萄糖鹽酸鹽-乙酸銀-無水甲醇-乙酸酐法,該方法反應時間長,反應過程中需要加熱沸騰,同時催化劑乙酸銀的使用使得生產(chǎn)成本高[8]。酶催化法是綜合利用多種幾丁質酶分解甲殼素獲取GlcNAc[9]。然而,甲殼素原料供給不穩(wěn)定,而且易誘發(fā)免疫反應,因此酶催化法應用受到限制[10-11]。微生物發(fā)酵法是對微生物進行遺傳改造,以葡萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc。由于底物來源廣泛,發(fā)酵條件溫和,產(chǎn)品無過敏反應等優(yōu)點,受到越來越多的關注[12-14]。目前,主要對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和谷氨酸棒桿菌等細菌進行遺傳工程改造用以生產(chǎn)GlcNAc。遺傳改造的方法包括增加酶活性、增強合成途徑中關鍵基因的表達,減少產(chǎn)物抑制等。Deng等[15]以大腸桿菌為底盤細胞,通過過表達GlcN6P乙酰轉移酶、GlcN6P合成酶和GlcN1P乙?;D移酶,弱化表達GlcN6P和GlcNAc1P尿苷酰轉移酶增加GlcNAc的碳流通量。由于葡萄糖是GlcNAc的主要底物,在發(fā)酵過程中補充果糖以保持菌體生長,最終發(fā)酵60 h,GlcNAc的最終濃度達到120 g/L。由于安全性問題,越來越多的研究集中于食品安全菌株的遺傳工程改造。王雅婷[16]以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為底盤細胞,通過增強GlcNAc的合成途徑、弱化降解途徑、消除主要副產(chǎn)物乳酸的合成使GlcNAc的合成水平達到2.23 g/L。Niu等[17-18]以枯草芽孢桿菌BSGN6(N6)為研究對象,通過平衡GlcNAc合成代謝與其他碳源代謝、增強合成代謝和GlcNAc6P外泌水平,在30 L發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵,GlcNAc的濃度達到87.5 g/L。

        黑曲霉是一種食品安全菌株,遺傳背景清晰且具有很高的碳源轉化效率,被廣泛應用于有機酸和酶制劑的生產(chǎn)[19-20]。另外,發(fā)酵工業(yè)中產(chǎn)生的大量黑曲霉菌絲體的資源化利用受到越來越多研究人員的重視。本研究以黑曲霉ATCC 1015(編號:S469[19])為底盤細胞,通過深入分析黑曲霉中GlcNAc合成代謝途徑,強化GlcNAc合成途徑、阻斷降解代謝、增加外泌水平、弱化支路代謝等手段,提高GlcNAc積累水平,為工業(yè)化黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 質粒、菌株和引物

        本文所用的菌株、質粒見表1和表2,本試驗所用的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)引物見表3。引物合成和DNA測序等由北京六合華大基因科技有限公司完成。

        表1 本研究所用菌株Table 1 Strain used in this study

        表2 本研究所用質粒Table 2 Plasmids used in this study

        表3 本研究所用引物Table 3 Primer used in this study

        續(xù)表3 本研究所用引物Continue table 3 Primer used in this study

        1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

        LB培養(yǎng)基:氯化鈉10 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母浸出物5 g/L。LB固體培養(yǎng)基另加15%瓊脂粉。

        馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基:切成小塊的去皮馬鈴薯1 kg,加入適量的蒸餾水煮沸約30 min,紗布過濾,取清液。加入100 g葡萄糖完全溶解,PDA固體培養(yǎng)基另加15%瓊脂粉。

        真菌生長完全培養(yǎng)基(complete medium,CM):葡萄糖10 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、酪蛋白水解物1 g/L、酵母浸出物5 g/L、CM微量元素母液1 mL/L、鈉鉀混合物母液20mL/L。其中CM微量元素母液:七水硫酸鋅21 g/L、硼酸11 g/L、四水氯化錳5 g/L、七水硫酸亞鐵5 g/L、六水氯化鈷1.7 g/L、五水硫酸銅1.6 g/L、二水鉬酸鈉1.5 g/L、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)51 g/L;ASP+N 母液:硝酸鈉 297.5 g/L、氯化鉀26.1 g/L、磷酸二氫鉀74.8 g/L,調節(jié)pH值為5.5。CM固體培養(yǎng)基另加15%瓊脂粉。根據(jù)需要添加潮霉素250 μg/mL、氨芐青霉素 100 μg/mL、鏈霉素 100 μg/mL、頭孢噻肟鈉 100 μg/mL。

        農(nóng)桿菌誘導真菌培養(yǎng)基(induction medium,IM):葡萄糖2 g/L、七水硫酸鎂0.6 g/L、二水氯化鈣0.1 g/L、氯化鈉0.3 g/L、七水硫酸亞鐵1 mg/L、硝酸銨0.5 g/L、甘油5 mL/L、IM微量元素母液5 mL/L、pH值為4.8的磷酸鉀緩沖液0.8 mL/L、pH值為5.5的嗎啉乙磺酸[2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid,MES]母液(濃度為1 mol/L)40 mL/L。其中IM微量元素母液:七水硫酸鋅0.1 g/L、五水硫酸銅0.1 g/L、硼酸0.1 g/L、一水硫酸錳0.1 g/L、二水鉬酸鈉0.1 g/L。IM固體培養(yǎng)基中葡萄糖1 g/L、15%瓊脂粉。根據(jù)需要添加卡那霉素100 μg/mL、乙酰丁香酮0.2 mol/L。

        黑曲霉液體培養(yǎng)基:七水硫酸鎂1 g/L、葡萄糖20 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、酵母浸出物10 g/L,調節(jié)pH值為4.0。

        基本培養(yǎng)基(minimal medium,MM):蔗糖 15 g/L、Vogel's Salts溶液20 mL/L。其中Vogel's Salts溶液:二水合檸檬酸鈉3 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、硝酸銨2 g/L、七水硫酸鎂0.2 g/L、二水氯化鈣0.1 g/L、MM微量元素溶液 100 μL/L、0.1 g/L 的生物素母液 50 μL/L。MM 微量元素溶液:六水硫酸亞鐵銨10 g/L、七水硫酸鋅50 g/L、五水硫酸銅2.5 g/L、一水硫酸錳0.5 g/L、一水檸檬酸50 g/L、硼酸0.5 g/L、二水鉬酸鈉0.5 g/L。MM固體培養(yǎng)基另加15%瓊脂粉。根據(jù)需要補加多西環(huán)素10 μg/mL。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖100 g/L、酵母浸出物10 g/L、磷酸二氫鉀1 g/L、七水硫酸鎂1 g/L、胰蛋白胨9 g/L。

        潮霉素:上海生工生物工程股份有限公司;氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素、頭孢噻肟鈉:北京solarbio公司;酵母浸出物、胰蛋白胨:英國OXOID公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。DNA回收、純化試劑盒、質粒提取試劑盒:北京天根生化科技有限公司;限制性內切酶:大連TaKaRa公司;Phanta Max高保真酶:北京全式金生物技術有限公司;PrimeSTAR HS(Premix)高保真酶:北京寶日醫(yī)生物技術有限公司;ClonExpress II One Step Cloning Kit:南京諾唯贊生物科技有限公司;PCR引物及質粒測序由華大基因股份有限公司合成。

        1.2 試驗方法

        1.2.1 ngtA基因敲除質粒構建方法

        以A.niger ATCC 1015基因組為模板,設計引物Primer2841、Primer2842(分別帶有 EcoR I和 BamH I酶切位點)和引物Primer2843、Primer2844(分別帶有Xba I和Spe I酶切位點)聚合酶鏈式反應擴增ngtA基因上下游片段,依次連接至pLH594中,獲得ngtA基因敲除質粒pLH813。

        1.2.2 基因表達重組質粒構建方法

        來源于E.coli K12的yqaB基因序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后由蘇州金唯智生物科技有限公司合成[21],連接至經(jīng)EcoR I和BamH I酶切的pLH454中,獲得yqaB表達質粒pLH826。引物Primer3069和Primer3070擴增gnaA基因片段,連接至經(jīng)EcoR I和Kpn I酶切的pLH509中,獲得gnaA表達質粒pLH896。引物Primer3071和Primer3072擴增gfaA基因片段,連接至經(jīng)Sac I和BamH I酶切的pLH454中,獲得gfaA表達質粒pLH897。

        1.2.3 RNA干擾質粒構建方法

        以A.niger ATCC 1015 cDNA為模板,設計引物Primer4043、Primer4044(分別帶有 EcoR I和 Sac I酶切位點)和引物Primer4045、Primer4046(分別帶有Pst I酶切位點)PCR擴增nagB正義鏈和反義鏈片段,依次連接至pLH1453中,獲得nagB弱化質粒pLH1216。nagA弱化質粒pLH1454和pfkA弱化質粒pLH1546與pLH1216的構建過程相似。擴增獲得nagA正義鏈和反義鏈的引物為Primer4686/Primer4687和Primer4688/Primer4689。擴增獲得pfkA正義鏈和反義鏈的引物為Primer4673/Primer4674和Primer4675/Primer4676。

        1.2.4 黑曲霉轉化方法

        農(nóng)桿菌介導的黑曲霉轉化方法參照Xu等[19]和Chen等[22]的方法,將1.2.1~1.2.3獲得的重組質粒電轉至農(nóng)桿菌AGL-1感受態(tài)細胞中。黑曲霉孢子液與農(nóng)桿菌菌液共培養(yǎng)于IM固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL卡那霉素、0.2 μmol/L乙酰丁香酮)上,25℃培養(yǎng)箱正置培養(yǎng)3 d。3 d后將菌體轉移到CM固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL 氨芐青霉素、80 μg/mL 鏈霉素、80 μg/mL 頭孢噻肟鈉、250 μg/mL潮霉素B)上,使用涂布器涂抹均勻。28℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)3 d~5 d,待轉化子長出后進行基因組驗證。

        1.2.5 hgh篩選標記基因的消除

        將1.2.1~1.2.3重組菌株的孢子液稀釋至300個孢子涂布于含有10 μg/mL多西環(huán)素的MM培養(yǎng)基上。在28℃條件下培養(yǎng)5 d~7 d,挑取重組子分別接種于PDA和含有250 μg/mL潮霉素B的PDA平板上,選擇潮霉素B敏感的重組子進行PCR檢測,獲得陽性重組子。

        1.2.6 搖瓶發(fā)酵及發(fā)酵罐分批發(fā)酵方法

        搖瓶發(fā)酵:將菌株接種在PDA平板上,28℃培養(yǎng)3 d~4 d,以2×106個孢子的接種量接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,然后置于28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

        黑曲霉分批發(fā)酵:將2×106個孢子的孢子懸液接種于裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中,置于28℃、200 r/min的搖床中振蕩培養(yǎng)20 h,然后轉接到2 L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵。發(fā)酵罐初始裝液量為1.26 L,葡萄糖初始濃度為100 g/L,發(fā)酵溫度28℃、通氣量1 vvm、轉速為300 r/min。

        1.2.7 樣品處理及高效液相色譜法測定方法

        樣品處理方法:發(fā)酵液經(jīng)12 000 r/min離心15 min后,取適量上清液用超純水稀釋,稀釋液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)分析。GlcNAc經(jīng)HPLC分析條件:檢測器為示差折光檢測器(refractive index detector,RID);色譜柱為伯樂 Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm),柱溫為40℃,檢測器溫度為35℃;流動相為5 mmol/L 硫酸;流速為 0.5 mL/min;進樣體積為 10 μL。

        2 結果與分析

        2.1 GlcNAc合成途徑的構建

        通過對基因組信息的挖掘,黑曲霉可以合成乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcNAc6P):葡萄糖依次在己糖激酶和磷酸己糖異構酶作用下生成果糖-6-磷酸(F6P),隨后谷氨酰胺作為氨基供體,在氨基葡萄糖-6-磷酸合成酶(GfaA)的催化下合成氨基葡萄糖-6-磷酸(GlcN6P),然后乙酰CoA提供乙?;?,在氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰轉移酶(GnaA)作用下生成GlcNAc6P。由于野生型黑曲霉中不存在乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸磷酸酶,因此無法合成GlcNAc。因此本研究中采取的代謝改造策略如圖1所示。

        圖1 黑曲霉中合成N-乙酰氨基葡萄糖代謝途徑改造策略Fig.1 Metabolic engineering for the synthesis of GlcNAc in Aspergillus niger

        以黑曲霉S469為出發(fā)菌株,首先將黑曲霉中Glc NAc特異性轉運蛋白ngtA編碼基因敲除,獲得GlcNAc的吸收利用缺陷型菌株S1379(ΔngtA),從而有利于胞外GlcNAc的積累。為了實現(xiàn)GlcNAc在黑曲霉中的合成,本研究克隆了來源于大腸桿菌鹵酸脫鹵酶樣磷酸酶編碼基因yqaB,結果見圖2。

        圖2 異源表達合成反應基因yqaB對GlcNAc產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of heterologous expression of yqaB on GlcNAc production

        通過構建yqaB表達盒,實現(xiàn)yqaB在黑曲霉中的異源表達(圖2A),獲得重組黑曲霉菌株S1552(ΔngtA,OEyqaB)。發(fā)酵分析表明,在S1552的發(fā)酵液中成功檢測到GlcNAc(圖2B)。發(fā)酵3 d和5 d時,GlcNAc濃度分別為1.15 g/L和1.78 g/L(圖2C)。由此,成功在黑曲霉中構建了GlcNAc合成途徑。

        為進一步提高GlcNAc的合成水平,通過過表達gnaA和gfaA兩個基因強化GlcNAc合成,結果見圖3。

        圖3 強化合成途徑關鍵基因表達對GlcNAc產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of enhanced key gene expressions of synthetic pathway on GlcNAc production

        在菌株S1552(ΔngtA,OEyqaB)基礎上依次過表達 gnaA(圖3A)和 gfaA(圖3B),獲得 GlcNAc合成菌株 S2078(ΔngtA,OEyqaB,OEgnaA)和 S2207(ΔngtA,OEyqaB,OEgnaA,OEgfaA)。發(fā)酵分析表明,S2078和S2207發(fā)酵5 d后,GlcNAc濃度分別為1.83 g/L和3.64 g/L(圖3C)。與S1552相比,S2207中GlcNAc合成水平提高了1.04倍。

        2.2 GlcNAc6P分解代謝途徑的弱化

        弱化GlcNAc6P分解代謝途徑對GlcNAc產(chǎn)量的影響見圖4。

        圖4 弱化GlcNAc6P分解代謝途徑對GlcNAc產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of weakening GlcNAc6P catabolic pathway on GlcNAc production

        GlcNAc6P作為GlcNAc的直接前體物質,在黑曲霉細胞中很容易在乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸脫乙酰酶NagA和氨基葡萄糖-6-磷酸脫氨基酶NagB的作用下形成F6P,從而在6-磷酸果糖激酶(PfkA)的作用下進入糖酵解途徑,從而減少GlcNAc6P的供給水平,進而導致GlcNAc合成水平下降。因此,為了增加GlcNAc合成前體GlcNAc6P的胞內供給,本研究首先以S2207(ΔngtA,OEyqaB,OEgnaA,OEgfaA)為出發(fā)菌株,通過弱化nagB的表達降低GlcN6P生成F6P的水平,得到菌株 S2497(ΔngtA,OEyqaB,OEgnaA,OEgfaA,sinagB)。轉錄分析表明,與S2207相比,nagB基因在S2497中的表達水平下降了97.4%(圖4A)。發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn),S2497發(fā)酵3 d和5 d時,GlcNAc濃度分別為1.55 g/L和3.85 g/L(圖4C),合成水平略微提高。在此基礎上,弱化nagA表達以進一步減少GlcNAc6P支路代謝,得到菌株 S2596(ΔngtA,OEyqaB,OEgnaA,OEgfaA,sinagB,sinagA)。轉錄分析表明,與S2497相比,nagA基因在S2596中的表達水平下降了90.1%(圖4B)。發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn),S2596發(fā)酵3 d和5 d時,GlcNAc濃度分別為1.77 g/L和4.03 g/L(圖4C),與S2207相比,S2596中GlcNAc合成水平提高了10.7%。以上結果表明,通過弱化GlcNAc6P分解代謝途徑可明顯提高黑曲霉合成GlcNAc水平。

        2.3 分支代謝途徑的弱化

        分支代謝途徑的弱化對GlcNAc產(chǎn)量的影響見圖5。

        圖5 分支代謝途徑的弱化對GlcNAc產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of weakened branched metabolic pathway on GlcNAc production

        黑曲霉具有旺盛的糖酵解代謝活性和檸檬酸合成能力[22],與GlcNAc合成途徑競爭共同前體物質F6P。在滿足菌體正常代謝、生長的條件下,進一步增強GlcNAc合成的前體物質供給,本研究構建了磷酸果糖激酶基因pfkA弱化表達菌株S2629(ΔngtA,OEyqaB,OEgnaA,OEgfaA,sinagB,sinagA,sipfkA)。pfkA 弱化后,菌株生長無明顯差異(圖5A)。轉錄分析表明,與S2596相比,pfkA基因在S2629中的表達水平下降了91.6%(圖5B)。發(fā)酵分析發(fā)現(xiàn),S2629發(fā)酵3 d和5 d時,GlcNAc濃度分別為1.97 g/L和4.61 g/L(圖5C),與S2596相比,S2629中GlcNAc合成水平提高了14.4%。以上結果表明,通過弱化F6P分支分解代謝途徑,增加GlcNAc合成前體供給,可明顯提高黑曲霉合成GlcNAc水平。

        2.4 黑曲霉重組菌株在2 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc

        為進一步評估黑曲霉發(fā)酵性能,在2 L發(fā)酵罐中進行了重組菌株S2629的規(guī)?;l(fā)酵試驗。黑曲霉重組菌株S2629在2 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc過程曲線見圖6。

        圖6 黑曲霉重組菌株S2629在2 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)GlcNAc過程曲線Fig.6 Process curve of the production of GlcNAc by batch fermentation of A.niger S2629 in a 2 L fermenter

        由圖6可知,在120 h的發(fā)酵周期中,24 h后葡萄糖消耗速率較快,120 h時葡萄糖幾乎耗盡。36 h后,GlcNAc開始明顯積累,重組菌株S2629在發(fā)酵120 h后GlcNAc濃度為10.8 g/L,產(chǎn)率為0.108 g/g葡萄糖。

        3 討論與結論

        GlcNAc是一種重要的功能性單糖,在保健食品、醫(yī)藥、精細化工等眾多領域被廣泛應用,并成為近年來的研究熱點。黑曲霉的遺傳背景清晰,能夠利用廉價的原料,具有很高的碳源轉化效率,是具有科學研究和工業(yè)生產(chǎn)價值的絲狀真菌細胞工廠。本研究通過深入分析黑曲霉中合成GlcNAc代謝途徑,將改造策略分為3個部分,即強化合成途徑、弱化GlcNAc6P分解代謝途徑、弱化分支代謝途徑。本研究首先將來源于大腸桿菌鹵酸脫鹵酶樣磷酸酶編碼基因yqaB經(jīng)密碼子優(yōu)化后進行異源表達,實現(xiàn)了GlcNAc在黑曲霉中的積累。進一步通過過表達gnaA和gfaA強化GlcNAc的合成,從而使GlcNAc的合成水平達到3.64 g/L,與上一代菌株相比GlcNAc合成水平提高了1.04倍。Glc-NAc6P作為GlcNAc的直接前體物質,通過弱化nagB和nagA基因表達,減弱GlcNAc6P的分解代謝,增加胞內GlcNAc6P供給,進而使GlcNAc的合成水平達到4.03 g/L,與上一代菌株相比GlcNAc合成水平提高了10.7%。GlcNAc的合成途徑與糖酵解途徑共用前體物質F6P,由于黑曲霉中糖酵解途徑代謝旺盛,為了使碳流更多地流向GlcNAc的合成,在前述改造的基礎上進一步弱化pfkA的表達,導致GlcNAc的合成水平進一步提高至4.61 g/L。另外,黑曲霉重組菌株在2 L發(fā)酵罐中進行分批發(fā)酵,GlcNAc的濃度提高至10.8 g/L。目前以黑曲霉為細胞工廠生產(chǎn)GlcNAc還存在一定的差距,在后續(xù)研究中將從中心代謝的支路代謝重新設計、輔因子工程優(yōu)化胞內氧化還原平衡等方面進一步提高GlcNAc合成水平,使黑曲霉成為GlcNAc等高值化合物合成的平臺菌株。

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