李福榮，呂曉彤，閆昕，李汶軒，劉治國，張翠英

（省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）在葡萄酒發(fā)酵過程中具有明顯的降蘋果酸[1]、降葡萄糖酸[2]和增加丙酮酸[3]的能力，能有效改善葡萄酒口感[4]、增強葡萄酒色澤穩(wěn)定性[5]，同時還能有效控制氨基甲酸乙酯、生物胺和曲霉毒素A[6]的含量，以確保葡萄酒的安全性[7]。最重要的是粟酒裂殖酵母具備與釀酒酵母不相上下的酒精發(fā)酵能力[8]，且在高酒精度、高滲透壓和高SO2等[2，9-10]極端環(huán)境中具有良好的耐受性。然而使用粟酒裂殖酵母發(fā)酵葡萄酒的同時會產(chǎn)生影響葡萄酒質(zhì)量的代謝產(chǎn)物，如過量的乙酸、硫化氫、乙醛、乙酰丁香和乙酸乙酯等[10-13]。至今為止，全世界僅有一株粟酒裂殖酵母符合直接釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒的條件，但發(fā)酵工藝復(fù)雜、成本高[14]，因此并沒有在葡萄酒發(fā)酵工業(yè)中得到廣泛使用。目前為了將粟酒裂殖酵母應(yīng)用在葡萄酒發(fā)酵中，很多研究者嘗試從優(yōu)良性能菌株的篩選[10]、多菌種混合發(fā)酵[15]、原生質(zhì)體融合及基因克隆表達相關(guān)酶等方向進行研究[16-18]。

本試驗通過優(yōu)選粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒的最適發(fā)酵溫度和最適接菌量，然后用16株粟酒裂殖酵母對玫瑰香葡萄進行單獨發(fā)酵，通過對發(fā)酵速率、有機酸含量、主要揮發(fā)性物質(zhì)和顏色等理化指標(biāo)進行測定和比較分析，旨在優(yōu)選出用于發(fā)酵玫瑰香葡萄酒效果最佳的粟酒裂殖酵母菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰香葡萄：2021年8月采自河北省秦皇島，含糖量為200 g/L（以還原糖計）、pH值為3.4、蘋果酸含量為9.07 g/L。

酒石酸飽和溶液：在500 mL燒杯中加入250 g未潮解的酒石酸晶體和150 mL蒸餾水，用微火加熱，不斷攪拌，使其完全溶解。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，115℃條件下滅菌20 min；生理鹽水：0.9%氯化鈉，115℃條件下滅菌20 min。

粟酒裂殖酵母（Sp-4、Sp-7、Sp-12、Sp-13、Sp-14、Sp-19、Sp-20、Sp-64、Sp-65、Sp-410、Sp-412、Sp-413、Sp-414、Sp-417、Sp-419、Sp-420）和葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）WY-1：天津科技大學(xué)天津工業(yè)微生物重點實驗室保存。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204S電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；LDZM-60KCS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司；Agilent 7890A氣相色譜儀、Agilent 1260高效液相色譜儀：美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

將玫瑰香葡萄分選、除雜、去梗、破碎后裝瓶，60℃滅菌30 min，待溫度降至28℃，加入50 mg/L～100 mg/L SO2（根據(jù)葡萄損壞程度改變用量），置于4℃冰箱靜置12 h左右，發(fā)酵前使用飽和酒石酸溶液將葡萄汁的pH值調(diào)至3.4。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 菌種擴大培養(yǎng)

酵母的一級種子培養(yǎng)液：挑取一環(huán)酵母接種于裝有5 mL YEPD三角瓶中，30℃、180 r/min培養(yǎng)12 h；

酵母的二級種子培養(yǎng)液：將5 mL一級種子接入到裝有45 mL YPED的三角瓶中，30℃、180 r/min離心至細胞濃度為1×108CFU/mL。

1.3.2.2 發(fā)酵工藝

提前將準(zhǔn)備好的葡萄汁分裝于250 mL廣口三角瓶中，裝液量為190 mL備用。

將培養(yǎng)好的種子液用無菌生理鹽水離心（6 000 r/min、3 min）洗滌2次，備用。

1）將粟酒裂殖酵母以5×106CFU/mL的接菌量接種于葡萄汁中，搖勻后，分別置于23、25、28℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵，直至發(fā)酵結(jié)束（24h的平均失重小于0.2g）。

2）將粟酒裂殖酵母分別以 1×106、5×106、1×107CFU/mL的接種量接種于葡萄汁中，搖勻后，置于25℃培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵，直至發(fā)酵結(jié)束（24h的平均失重小于0.2g）。

3）將 16 株粟酒裂殖酵母菌液（Sp-4、Sp-7、Sp-12、Sp-13、Sp-14、Sp-19、Sp-20、Sp-64、Sp-65、Sp-410、Sp-412、Sp-413、Sp-414、Sp-417、Sp-419、Sp-420）和對照組葡萄汁酵母（WY-1）（接菌量為 5×106CFU/mL）接種于葡萄汁中搖勻后，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置發(fā)酵，直至發(fā)酵結(jié)束（24 h的平均失重小于0.2 g）。

每組發(fā)酵試驗重復(fù)3次。每隔12h稱重并取樣1次，直至發(fā)酵結(jié)束。

1.3.3 分析檢測

1.3.3.1 發(fā)酵速率的測定

根據(jù)GB 15037—2006《葡萄酒》測定菌株的發(fā)酵速率。

1.3.3.2 葡萄酒顏色的測定

準(zhǔn)確吸取葡萄酒發(fā)酵液1 mL，用蒸餾水定容至10 mL容量瓶中，取稀釋后的酒樣于1 cm光程比色皿中，分別在 420、520、620 nm 下測定吸光度[19]，色度值計算公式如下。

1.3.3.3 有機酸的測定

運用高效液相色譜法測定有機酸含量[10]。葡萄酒發(fā)酵液經(jīng)0.22 μm纖維濾膜過濾后采用高效液相色譜儀測定。試驗條件：色譜柱為Bio-Rad Aminex-HPX 87H，檢測器為紫外檢測器，波長為210 nm，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為 0.5 mL/min，柱溫為 35 ℃，進樣量為20 μL。根據(jù)標(biāo)品出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線信息，計算出發(fā)酵樣品中有機酸含量。

1.3.3.4 主要風(fēng)味物質(zhì)的測定

根據(jù)GB 15037—2006《葡萄酒》中氣相色譜法測定樣品中的主要風(fēng)味物質(zhì)。葡萄酒發(fā)酵液經(jīng)蒸餾后采用氣相色譜法測定：自動進樣器為Agilent G4512A，色譜柱為Agilent HP-INNOW A X（30 m×0.32 mm×0.5 μm），檢測器為火焰離子化檢查器；進樣口溫度200℃，檢測器溫度恒定150℃。升溫條件：起始柱溫度50℃保持8 min，以5℃/min升至150℃保溫15 min，分流進樣。測試條件：進樣量 1 μL，分流比為 10∶1，流速0.8 mL/min，載氣為高純氮氣。

1.3.3.5 指標(biāo)測定

根據(jù)GB 15037—2006《葡萄酒》中的高效液相色譜法測定葡萄酒中的重要指標(biāo)。葡萄酒發(fā)酵液經(jīng)0.22μm纖維濾膜過濾后采用液相色譜儀測定。色譜柱為Sil green GH0830078H（300 mm×7.8 mm×9 μm）；檢測器為示差折光檢測器；流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min；檢測器溫度為45℃，柱溫為65℃，進樣量為20 μL，根據(jù)標(biāo)品出峰時間和標(biāo)準(zhǔn)曲線信息，計算出發(fā)酵樣品中葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各項理化指標(biāo)進行3次平行取樣。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05表示差異有顯著性；并使用Origin 8.5和Excel分別進行圖和表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵溫度和接菌量的優(yōu)選

2.1.1 發(fā)酵溫度與接菌量對降蘋果酸能力的影響

蘋果酸含量過高會使葡萄酒帶有一種尖銳的酸味。傳統(tǒng)的葡萄酒發(fā)酵，通過蘋果酸-乳酸發(fā)酵來降解蘋果酸，以解決葡萄酒中蘋果酸過量的問題[20]。粟酒裂殖酵母同樣具備高效降解蘋果酸的能力，但不同發(fā)酵溫度和不同接菌量會對粟酒裂殖酵母的降解蘋果酸能力產(chǎn)生一定影響。不同發(fā)酵溫度和不同接菌量的蘋果酸降解能力見表1。

表1 不同發(fā)酵條件蘋果酸的降解能力Table 1 Degradation ability of malic acid under different fermentation conditions

由表1可知，發(fā)酵溫度為23、25、28℃時，蘋果酸降解率分別為89.21%、96.81%、96.36%。發(fā)酵溫度為25℃時，對蘋果酸的降解能力較高。而接菌量為1×106、5×106、1×107CFU/mL 時，蘋果酸的降解率分別為84.80%、96.81%、96.15%。接菌量為5×106CFU/mL時，對蘋果酸的降解能力較高。由此可見，當(dāng)接菌量為5×106CFU/mL、發(fā)酵溫度為25℃時，具有有效降解蘋果酸的能力。

2.1.2 發(fā)酵溫度與接菌量對發(fā)酵速率和殘?zhí)呛康挠绊?/p>

在葡萄酒發(fā)酵過程中，主體菌株發(fā)酵速度越慢，感染其他菌株的風(fēng)險就越大。因此，較快的發(fā)酵速度至關(guān)重要。不同發(fā)酵溫度與不同接菌量下CO2釋放量以及殘?zhí)呛恳妶D1。

圖1 不同發(fā)酵條件下CO2釋放量和殘?zhí)呛縁ig.1 CO2release and residual sugar content under different fermentation conditions

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為23℃時葡萄酒的發(fā)酵速度最慢，28℃時發(fā)酵速度最快，25℃時發(fā)酵速度適中，且與28℃時的發(fā)酵速率相近。通過對比不同接菌量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接菌量為1×106CFU/mL時，葡萄酒的發(fā)酵速度最慢，接菌量為1×107CFU/mL時發(fā)酵速度最快，接菌量為5×106CFU/mL時，發(fā)酵速度適中，且與接菌量為1×107CFU/mL時的發(fā)酵速率相近（圖1a）。當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃、接菌量為5×106CFU/mL時，粟酒裂殖酵母對殘?zhí)堑南哪芰εc發(fā)酵速度最快的發(fā)酵溫度和接菌量持平（圖1b）。綜上所述，當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃、接菌量為5×106CFU/mL時，既能充分發(fā)酵葡萄酒中的糖，又處于較快的發(fā)酵速率。

2.1.3 發(fā)酵溫度與接菌量對葡萄酒中酯類物質(zhì)的影響

乙酸乙酯過量會令葡萄酒充斥著指甲油的味道[20]，乙酸乙酯含量的多少直接影響葡萄酒的品質(zhì)。不同發(fā)酵溫度與不同接菌量下主要酯類物質(zhì)含量見圖2。

圖2 不同發(fā)酵條件下主要酯類物質(zhì)含量Fig.2 Content of main esters in wine under different fermentation conditions

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為25℃、接菌量為5×106CFU/mL 時，乙酸乙酯含量為（12.2±2.58）mg/L，在葡萄酒中屬于正常值[20]。同時，該條件下的乙酸異戊酯含量和乳酸乙酯含量分別為（0.43±0.01）mg/L和（6.26±0.10）mg/L，均在正常范圍內(nèi)（乙酸異戊酯0.1 mg/L～12.0 mg/L，乳酸乙酯 1 mg/L～50 mg/L）[20]。

2.1.4 發(fā)酵溫度與接菌量對葡萄酒中高級醇含量的影響

高級醇含量過高會令人“上頭”，而高級醇含量太低又會使酒體香氣寡淡，適當(dāng)?shù)母呒壌己坑欣谄咸丫普w的豐富度。葡萄酒中異戊醇、異丁醇和苯乙醇3種高級醇的含量占總高級醇的92%～96%[20]。不同發(fā)酵溫度和不同接菌量對葡萄酒中高級醇含量的影響見圖3。

圖3 主要高級醇類物質(zhì)的含量Fig.3 Content of main higher alcohols

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為28℃時，4種主要高級醇（正丙醇、異丁醇、異戊醇、苯乙醇）的總含量為138.91 mg/L，不在正常范圍（140 mg/L～420 mg/L），而當(dāng)發(fā)酵溫度為23℃和25℃時，4種高級醇總含量分別為172.62 mg/L和170.85 mg/L均符合篩選范圍；接菌量為1×106CFU/mL和1×107CFU/mL時，4種高級醇總含量分別為60.41 mg/L和71.47 mg/L，不在正常范圍，而當(dāng)接菌量在5×106CFU/mL時，4種高級醇總含量（170.85 mg/L）符合篩選范圍。因此，發(fā)酵溫度為23℃和25℃時，4種高級醇含量正常，接菌量在5×106CFU/mL時，高級醇總含量正常。

2.1.5 發(fā)酵溫度與接菌量對葡萄酒中主要醇類物質(zhì)的影響

乙醇是葡萄酒中含量最多的醇類物質(zhì)，甘油是葡萄酒中含量排名第二的醇類物質(zhì)。其中甘油含量直接影響葡萄酒的口感。在標(biāo)準(zhǔn)范圍（5 g/L～14 g/L）內(nèi)，甘油含量越多，葡萄酒的品質(zhì)越好。不同接菌量和不同發(fā)酵溫度下乙醇含量和甘油含量如圖4所示。

圖4 不同發(fā)酵條件最主要的兩種醇類物質(zhì)含量Fig.4 Content of two main alcohols in wine under different fermentation conditions

由圖4可知，發(fā)酵溫度25℃的甘油含量（6.51±0.11）g/L 和乙醇含量（68.36 ±0.33）g/L，與其他發(fā)酵溫度甘油含量相比處于較好的水平，接菌量為5×106CFU/mL的甘油含量（6.51±0.11）g/L和乙醇含量（68.36±0.33）g/L與其他接菌量相比也處于較好的水平。

綜上所述，對于粟酒裂殖酵母菌株發(fā)酵玫瑰香葡萄酒的最適發(fā)酵溫度為25℃，最適接菌量為5×106CFU/mL。

2.2 16株粟酒裂殖酵母的優(yōu)選

2.2.1 蘋果酸含量的對比

葡萄酒中的蘋果酸含量仍是優(yōu)選粟酒裂殖酵母菌株的重要因素之一。該試驗對16株粟酒裂殖酵母進行單獨發(fā)酵，優(yōu)選蘋果酸降解能力最強的粟酒裂殖酵母。葡萄汁酵母和16株粟酒裂殖酵母的降蘋果酸能力見圖5。

圖5 葡萄汁酵母與粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒中蘋果酸的含量Fig.5 Content of malic acid in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由圖5可知，粟酒裂殖酵母Sp-410菌株發(fā)酵玫瑰香葡萄酒的蘋果酸含量為0.18 g/L，且粟酒裂殖酵母Sp-410菌株對玫瑰香葡萄酒中蘋果酸的降解能力顯著高于其他粟酒裂殖酵母，降解率達到97.98%。由此可見，Sp-410菌株是16株粟酒裂殖酵母中降解蘋果酸能力最好的菌株。

2.2.2 發(fā)酵速率和殘?zhí)呛康膶Ρ?/p>

16株粟酒裂殖酵母中的發(fā)酵速率和殘?zhí)呛恳妶D6。

圖6 葡萄汁酵母與粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒中的發(fā)酵速率和殘?zhí)呛縁ig.6 Fermentation rates and residual sugar content in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由圖6可知，通過對比發(fā)酵過程中CO2釋放量發(fā)現(xiàn)，當(dāng)發(fā)酵時間超過12 h后，粟酒裂殖酵母Sp-410的CO2釋放量占總釋放量的10.53%，相較于其他14株粟酒裂殖酵母，Sp-410菌株的發(fā)酵啟動速度最快（圖6a）。通過對比發(fā)酵結(jié)束后葡萄酒中的殘?zhí)呛堪l(fā)現(xiàn)，Sp-410菌株能夠充分發(fā)酵葡萄汁中的糖（圖6b）。

2.2.3 乙酸及乙酸的代謝產(chǎn)物含量對比

粟酒裂殖酵母菌發(fā)酵葡萄酒的過程中，隨著蘋果酸的降低，乙酸、乙酸乙酯、乙醛的含量開始增高。正常葡萄酒中乙酸的含量為0.1 g/L～0.6 g/L，超出該范圍越多，葡萄酒聞起來越刺鼻；乙醛含量超過125 mg/L時，會有青蘋果和鮮切草的味道，對葡萄酒的香氣造成嚴(yán)重的負面影響；正常葡萄酒中的乙酸乙酯的含量范圍為5 mg/L～200 mg/L，乙酸乙酯過量會令葡萄酒充斥著一股指甲油味[10]。粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒的乙酸及其代謝產(chǎn)物的含量見圖7。

圖7 葡萄汁酵母與粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒中的乙酸、乙醛及乙酸乙酯的含量Fig.7 Content of acetic acid，acetaldehyde，and ethyl acetate in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由圖7可知，Sp-410菌株發(fā)酵后的乙酸含量[（0.18±0.01）g/L]和乙醛含量[（48.46±1.95）mg/L]明顯低于其他15株粟酒裂殖酵母，而乙酸乙酯的含量（5.67±0.73）mg/L處于中等水平。因此，優(yōu)選出的Sp-410菌株符合乙酸代謝產(chǎn)物的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.4 主要醇類物質(zhì)含量對比

16株粟酒裂殖酵母菌中的乙醇和甘油含量如圖8所示。

圖8 葡萄汁酵母與粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒中的乙醇和甘油的含量Fig.8 Content of ethanol and glycerin in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由圖8可知，粟酒裂殖酵母Sp-410的乙醇含量（52.49±0.15）g/L在16株粟酒裂殖酵母菌中最高（圖8a），其甘油含量（4.93±0.03）g/L相較于其他 15株粟酒裂殖酵母菌處于較高的水平（圖8b）。

2.2.5 酒體色度值對比

葡萄酒的色度值是評價葡萄酒感官質(zhì)量的一項重要指標(biāo)，根據(jù)葡萄酒的色度值，能夠判斷葡萄酒的氧化程度和質(zhì)量好壞，葡萄酒色度的高低主要由酚類物質(zhì)花色苷等決定。色度值越高，花色素含量越高，葡萄酒的顏色越深，反之葡萄酒顏色越淺[20]。葡萄汁酵母與16株粟酒裂殖酵母的酒體色度值如圖9所示。

圖9 葡萄汁酵母與粟酒裂殖酵母發(fā)酵玫瑰香葡萄酒中的色度值對比Fig.9 Comparison of chromaticity value of wine fermented by S.uvarum and S.pombe

如圖9所示，粟酒裂殖酵母Sp-410的色度值1.26±0.01明顯高于其他15株粟酒裂殖酵母的色度值。因此，粟酒裂殖酵母Sp-410菌株釀造的玫瑰香葡萄酒的酒色更深，更符合優(yōu)選發(fā)酵玫瑰香葡萄酒色澤的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

粟酒裂殖酵母在發(fā)酵溫度為25℃和接菌量為5×106CFU/mL的條件下，具有有效降解蘋果酸的能力，主要酯類物質(zhì)和醇類物質(zhì)的含量均處于最佳水平。優(yōu)選的粟酒裂殖酵母Sp-410單獨發(fā)酵玫瑰香葡萄酒的各項指標(biāo)均符合標(biāo)準(zhǔn)，相比于其他15株粟酒裂殖酵母，Sp-410菌株的蘋果酸降解率（97.98%）和色度值（1.26）最高，乙酸含量（0.18 g/L）和乙醛含量（48.46 mg/L）較低，乙酸乙酯的含量（5.67 mg/L）和甘油含量（4.93 g/L）均處于較高的水平。因此，粟酒裂殖酵母的最適發(fā)酵溫度為25℃，最適接菌量為5×106CFU/mL，優(yōu)選出的粟酒裂殖酵母菌Sp-410為釀造優(yōu)質(zhì)玫瑰香葡萄酒的優(yōu)良菌種。

本試驗為使用粟酒裂殖酵母發(fā)酵葡萄探索了最適發(fā)酵溫度和最適接菌量，為釀造優(yōu)質(zhì)玫瑰香葡萄酒提供優(yōu)良菌種。粟酒裂殖酵母的篩選有利于推動粟酒裂殖酵母在葡萄酒發(fā)酵的發(fā)展，為葡萄酒產(chǎn)業(yè)增添新的色彩。