梁劍鋒，李亞*，賓月景，奚廣生，陳金輝，曾勇謀，陳美華

（1.梧州學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院（六堡茶現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院），廣西 梧州 543002；2.廣西六堡茶產(chǎn)業(yè)科研人才小高地，廣西 梧州 543002）

梧州六堡茶為中國名茶，具有1500多年歷史，采用特殊的渥堆、陳化等發(fā)酵工藝加工而成，梧州六堡茶以“紅、濃、陳、醇”特殊品質(zhì)深受廣大消費(fèi)者喜愛[1-3]。近年來消費(fèi)者十分關(guān)注后發(fā)酵黑茶受到真菌毒素污染而引起的食品安全問題[4-5]。由于六堡茶屬于后發(fā)酵的黑茶，因此其飲用安全性也受到廣大消費(fèi)者的關(guān)注[6-8]。雖然六堡茶在加工過程中有高溫雙蒸、干燥等工藝進(jìn)行滅菌，但是在渥堆發(fā)酵、陳化、倉儲過程中六堡茶水分比較高，容易滋生真菌，存在受到真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)。目前國內(nèi)對六堡茶中真菌分布情況以及是否會(huì)產(chǎn)生有害真菌毒素等問題鮮有研究。因此，對六堡茶中真菌毒素種類及關(guān)鍵的真菌毒素含量進(jìn)行相關(guān)研究，對確保廣大六堡茶消費(fèi)者飲用安全具有一定研究與現(xiàn)實(shí)意義[9-11]。

六堡茶中在發(fā)酵陳化過程中各類真菌種類、數(shù)量繁多，而且不同企業(yè)、原料生產(chǎn)六堡茶其微生物多樣性也變化較大；如果僅從形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、微生物學(xué)的特征上分析，難以準(zhǔn)確分離和鑒定[9-11]。隨著基因測序技術(shù)的出現(xiàn)，高通量測序技術(shù)快速發(fā)展，該技術(shù)采用合成與測序同時(shí)進(jìn)行方法對樣本的DNA分子進(jìn)行測序，具有檢測速度快、檢驗(yàn)量大、結(jié)果精密度高的優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)廣泛應(yīng)用可以為分析六堡茶中真菌菌群結(jié)構(gòu)提供技術(shù)手段。

茶葉中常見真菌有黑曲霉、米曲霉、寄生曲霉、黃曲霉、土曲霉、雜色曲霉、煙曲霉和構(gòu)巢曲霉等[14-16]。黃曲霉常見有害代謝物包括黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素 G1、黃曲霉毒素 G2、黃曲霉毒素 M1、黃曲霉毒素M2[17]和赭曲霉毒素A[18-19]；鐮刀菌產(chǎn)生的有害代謝物包括伏馬菌素[20]、雪腐鐮刀菌烯醇、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮[21]、鐮刀菌烯酮X和T-2毒素等單端孢霉烯族毒素[22-23]。茶葉中青霉屬常見的有黃綠青霉（P.citreo-viride）、桔青霉（P.citrinum）、產(chǎn)黃青霉（P.chrysogenum）、婁地青霉（P.roqueforti）、展青霉（P.patulum）、繩狀青霉（P.funiculosum）和產(chǎn)紫青霉（P.purpurogenum）等，日常生活中青霉素有害代謝產(chǎn)物為桔青霉素[24-25]。

本文采用基于18S宏基因組測序技術(shù)的Illumina HiSeq TM2500分析儀器，提取六堡茶DNA樣本后，利用ITS1F和ITS2R序列測定方法，分析對比10種不同廠家、批次、年份的六堡茶中的真菌微生物組成。同時(shí)采用 QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged、safe）-液相/質(zhì)譜聯(lián)用方法，分析樣品中常見真菌的代謝毒素殘留量。通過研究樣品探討六堡茶中真菌毒素群落結(jié)構(gòu)、組成，并對食品中常見的真菌素殘進(jìn)行留量檢測分析，為科學(xué)防控六堡茶中真菌毒素對消費(fèi)者可能產(chǎn)生的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，提供實(shí)際檢測數(shù)據(jù)與理論研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

樣品：市售不同廠家、批次、年份（陳化時(shí)間1年～12年）的六堡茶成品10份。樣品具體編號、陳化開始時(shí)間及樣品含水量見表1。

表1 試驗(yàn)樣品信息Table 1 Test sample information

16種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度＞98%）：美國Romer Labs公司；DNA提取試劑：北京諾博萊德科技公司；乙腈（色譜純）：美國霍尼韋爾公司；甲酸（色譜純）：美國熱電公司；HC-C18型吸附劑（40 μm～60 μm）、N-丙基乙二胺（40 μm～60 μm）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硫酸鎂（分析純）：西隴化工股份有限公司。凈化管：分別稱取80 mg N-丙基乙二胺、0.25 g硫酸鎂、15 mg HC-C18至2.0 mL離心管中。

LC1290-QQQ6490液質(zhì)聯(lián)用儀：美國安捷倫公司；X-30R冷凍離心機(jī)：德國貝克曼庫爾特公司。

1.2 樣品總DNA提取方法

按照提取試劑的使用說明對六堡茶樣品進(jìn)行真菌的DNA進(jìn)行提取。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增

提取樣品中真菌毒素DNA，對DNA的濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測后，利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物質(zhì)量并進(jìn)行擴(kuò)增，樣品真菌ITS檢測選用引物為ITS1F-ITS2R （ITS1F：5′－CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA－3′，ITS2R：5′－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3′）。

1.4 測序

樣品中真菌毒素ITS測序試驗(yàn)由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.5 真菌多樣性數(shù)據(jù)處理和分析

對高通量測序檢測到的數(shù)據(jù)與已有的ITS區(qū)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比分析。對檢測到的數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾拼接，獲得有效序列。利用R語言中的函數(shù)制作微生物群落組成的柱狀分析圖。相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)利用Excel軟件。

1.6 樣品中真菌毒素殘留量測定方法

1.6.1 QuEChERS樣品前處理方法

采用中藥粉碎機(jī)對六堡茶樣品進(jìn)行粉碎并過80目篩后混勻，先在離心管（50 mL）中稱取2.50 g樣品，向離心管中小心逐滴加入2.0 mL純水濕潤樣品，加入20.0 mL有機(jī)提取溶劑（1%甲酸-乙腈溶液）后用渦旋混合器振搖3 min，4℃下4 000 r/min離心10 min，取出后放置恢復(fù)至室溫（25℃）分層；吸取1.0 mL上層澄清液到凈化管中，在渦旋混合器混勻3 min后冷凍離心分離（15 000 r/min、4℃、10 min），取出待離心管恢復(fù)至室溫（25℃）、分層后取上層澄清液過濾膜（孔徑0.22 μm）后上機(jī)檢測。

1.6.2 色譜條件

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient elution procedure

1.6.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（electron spray ionization，EI）；采用正負(fù)離子源切換模式掃描；毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥氣溫度325℃；干燥氣流速9 L/min；其它參數(shù)見表3。

表3 質(zhì)譜儀檢測參數(shù)Table 3 Detection parameters of mass spectrometer

2 結(jié)果與分析

2.1 門和屬分類水平下真菌類群分析

本文將六堡茶中真菌分為優(yōu)勢門或?qū)伲ㄕ婢男蛄衅骄鄬看笥?.00%）、其它（真菌的序列平均相對含量小于1.00%）、不可鑒定（不能鑒定到門或者屬水平真菌的序列）。

2.1.1 基于門分類學(xué)的真菌類群分析

門分類水平下，10批次六堡茶真菌類群結(jié)構(gòu)分析見圖1。

圖1 基于門水平10個(gè)樣品中真菌類群的比較分析Fig.1 Comparative analysis of fungal groups in 10 samples based on phylum level

由圖1可知，10個(gè)六堡茶樣品中真菌類群主要是子囊菌門（Ascomycota），其相對含量在85.2%～94.2%，平均相對含量為90.9%；有3個(gè)樣品含有擔(dān)子菌門（Basidiomycota），其相對含量在1.2%～3.2%。其中子囊菌門在同一產(chǎn)品系列中，平均含量隨著陳化時(shí)間先降后升。采用SPSS 25.0軟件經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)，采集的10個(gè)六堡茶樣品在門水平上真菌類群差異均不顯著（P＞0.05）。

2.1.2 基于屬分類學(xué)的真菌類群分析

屬分類水平下，10批次六堡茶樣品所有序列可鑒定出24個(gè)真菌屬，其中平均相對含量大于1.00%的有6個(gè)，具體真菌類群結(jié)構(gòu)相對含量分析見圖2。

圖2 基于屬水平10個(gè)樣品中真菌類群的比較分析Fig.2 Comparative analysis of fungal groups in 10 samples based on genus level

由圖2可知，6個(gè)平均相對含量大于1.00%的真菌屬分別為曲霉屬（Aspergillus）、青霉屬（Penicillium）、節(jié)擔(dān)菌屬（Wallemia）、肉座菌（Hypocreale）、芽生葡萄孢酵母屬（Blastobotrys）、德巴利氏酵母屬（Debaryomyces），其中10個(gè)樣品均含有曲霉屬，平均相對含量在50.6%～99.9%，10個(gè)樣品曲霉屬平均相對含量為86.4%，是六堡茶樣品的優(yōu)勢真菌屬。采用SPSS 25.0軟件經(jīng)Mann-Whitney檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，編號LBC-6、LBC-8、LBC-10 3個(gè)樣品中曲霉屬（Aspergillus）含量差異明顯，其平均相對含量分別為50.6%、89.2%、57.9%。

2.2 樣品中16種真菌毒素殘留量檢測結(jié)果

試驗(yàn)檢測真菌毒素線性范圍、檢出限、定量限和10批次六堡茶樣品中16種真菌毒素殘留量見表4。

表4 真菌毒素線性范圍、檢出限、定量限Table 4 Linear range，limit of detection and limit of quantification of mycotoxins

由表4可知，本文試驗(yàn)方法的檢出限、定量限與現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)相一致；通過對10批次六堡茶樣品中常見16種真菌毒素殘留量檢測，檢測結(jié)果為均未檢出。初步研究表明，樣品六堡茶中真菌雖以曲霉類為主，但暫未發(fā)現(xiàn)以上常見的有害真菌代謝毒素殘留。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)首先對不同年份、不同企業(yè)生產(chǎn)的10批次六堡茶樣品進(jìn)行茶葉樣品的總DNA提取，采用18S宏基因組測序技術(shù)進(jìn)行ITS測序與分析，結(jié)果表明：10個(gè)六堡茶樣品在門分類水平真菌類群主要是子囊菌門，其平均相對含量在85.2%～94.2%，平均相對含量90.9%；在屬分類水平6個(gè)平均相對含量大于1.00%的依次為曲霉屬、青霉屬、節(jié)擔(dān)菌屬、肉座菌、芽生葡萄孢酵母屬、德巴利氏酵母屬，其中10個(gè)樣品均含有曲霉屬，平均相對含量在50.6%～99.9%，10個(gè)樣品曲霉屬平均相對含量為86.4%。采用超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀對實(shí)際樣品中黃曲霉毒素、伏馬毒素等真菌代謝毒素殘留量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明樣品中16種真菌毒素殘留量小于方法檢出限，檢測結(jié)果為未檢出。試驗(yàn)表明，六堡茶樣品中真菌以曲霉屬、青霉屬為主，暫未發(fā)現(xiàn)以上16種有害真菌代謝毒素殘留。