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        山竹殼多糖提取工藝優(yōu)化及其生物活性研究

        2022-08-05 11:35:42姚欣孫寧云陳鑫范麗霞楊安平朱峰劉輝
        食品研究與開發(fā) 2022年15期

        姚欣,孫寧云,陳鑫,范麗霞,楊安平,朱峰,劉輝,*

        (1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528225;2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院,廣東 佛山 528000;3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院,廣東 佛山 528000)

        山竹(Garcinia mangostana L.)是藤黃科(Guttiferae)藤黃屬熱帶常綠喬木,又名山竹子、倒捻子等,原產(chǎn)于馬來西亞,現(xiàn)主要分布于泰國、越南等東南亞國家,我國廣西、海南等地也有引種[1]。山竹果實(shí)中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì),有“水果皇后”之稱[2]。

        山竹的果皮作為藥材治療疾病已有幾百年歷史。山竹果皮曬干后被磨成粉末,能作為抗菌藥和抗寄生蟲藥來治療創(chuàng)傷、痢疾和慢性潰瘍[3-4]。山竹殼中主要含有氧雜蒽酮類、黃酮類、多酚類和多糖等成分[5]。其中氧雜蒽酮類是山竹殼的特征性成分,并且該類化合物具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、細(xì)胞毒作用[6]。此外,山竹殼富含的黃酮類、多酚類化合物在抗氧化、抗菌等方面具有較好的作用[7],而對(duì)其多糖的提取及生物活性研究涉及較少。

        近年來,多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血脂等方面顯示出較好的作用,多糖也成為研究的熱點(diǎn)。Li等[8]研究了海金沙草多糖的抗菌效果,結(jié)果表明其具有廣譜抗菌作用,尤其對(duì)酵母菌有著較高的抑制作用。宮海全[9]的研究結(jié)果表明蜜環(huán)菌多糖能提高糖尿病小鼠肝臟的自噬水平,減少脂肪堆積,提高胰島素敏感性且能保護(hù)糖尿病小鼠的胰島,改善受損的功能,達(dá)到降血糖的功效。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,800 mg/L的枸杞多糖可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期來發(fā)揮抗腫瘤活性,可以抑制人膀胱癌細(xì)胞系BIU87的生長,誘導(dǎo)BIU87細(xì)胞凋亡[10]。

        山竹多糖的研究多集中在果肉中,李娥等[11]測(cè)定了山竹提取物有效成分,并分析了多糖組成,結(jié)果表明,山竹果肉中富含多糖,主要有葡萄糖、葡萄糖醛酸、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖。對(duì)果殼多糖的研究較少,Gan等[12]采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化山竹殼果膠多糖的提取工藝條件,從而獲得具有高糖醛酸含量和抗氧化活性的高抗氧化果膠多糖。為了更好地利用山竹果殼,提高山竹殼的開發(fā)利用價(jià)值,本文采用正交試驗(yàn),對(duì)超聲輔助提取山竹殼多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其抗氧化活性、抗菌活性以及抗腫瘤活性進(jìn)行研究,為山竹殼在食品等方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        山竹殼:市售;菌種(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌):廣東省微生物菌種保藏中心;人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人結(jié)腸癌細(xì)胞(DLD-1)、人黑色素瘤細(xì)胞(A375)、小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16):中國科學(xué)院上海細(xì)胞中心。葡萄糖、苯酚、DPPH、ABTS、二甲基亞砜(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;過硫酸鉀(分析純):福晨(天津)化學(xué)試劑有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8):亞科因(武漢)生物技術(shù)有限公司;LB培養(yǎng)基:青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS):美國 Gibco 公司;青霉素、鏈霉素:上海撫生有限公司。

        1.1.2 試驗(yàn)儀器

        超聲波清洗器(060ST):深圳市華策科技有限公司;臺(tái)式高速離心機(jī)(TG16-WS):湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-2000A):鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司;紫外分光光度計(jì)(UV-2700):島津企業(yè)管理(中國)有限公司;全波長酶標(biāo)儀(EPOCH):美國BioTek公司;智能生化培養(yǎng)箱(LRH-150):鄭州生元儀器有限公司;二氧化碳培養(yǎng)箱(BB 5060)、立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(GR60DA):致微(廈門)儀器有限公司;倒置熒光顯微鏡(IMC-900TFL):廣州科適特科學(xué)儀器有限公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        1.2.1 材料處理

        取山竹殼于60℃烘箱中干燥至恒重,然后用粉碎機(jī)粉碎,過60目篩獲取山竹殼樣品備用[13]。

        1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

        首先準(zhǔn)確稱量10 mg已充分干燥至恒重的葡萄糖粉末,在燒杯中加入適量去離子水?dāng)嚢枋蛊咸烟峭耆芙?,然后將其定容?00 mL容量瓶中,即得到0.100 0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        分別準(zhǔn)確移取上述葡萄糖溶液 0、0.20、0.40、0.60、0.80 mL,然后用去離子水補(bǔ)至1 mL,配制濃度分別為0、20.00、40.00、60.00、80.00 μg/mL 葡萄糖待測(cè)液。分別移取1.00 mL上述各個(gè)濃度葡萄糖待測(cè)液到試管中,接著依次加入5.0%苯酚溶液1.0 mL,充分混勻,然后立即加入98%濃硫酸5 mL,混勻后靜置5 min,于37℃水浴加熱20 min,待其溫度降到室溫25℃后于488 nm波長下測(cè)定吸光度[14-15]。以吸光度Y對(duì)濃度X進(jìn)行線性回歸,得回歸方程:Y=0.009 4X+0.092 8,R2=0.993,線性范圍為 0~80 μg/mL。

        1.2.3 山竹殼多糖的提取及提取率測(cè)定

        準(zhǔn)確稱取1.000 g的山竹殼粉末,與一定體積的去離子水依次加入到錐形瓶中。然后將錐形瓶放置于超聲機(jī)內(nèi),設(shè)定超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度等參數(shù),共提取3次,合并濾液,濃縮至25 mL,采用Sevag法[16]脫蛋白,即得多糖提取液[17-18]。按照1.2.2中的方法測(cè)定多糖提取液的吸光度,通過回歸方程計(jì)算多糖濃度,并按照公式計(jì)算多糖提取率。

        式中:C為提取液多糖濃度,μg/mL;V為提取液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為山竹殼粉末質(zhì)量,g。

        1.2.4 單因素試驗(yàn)

        以1.000g山竹殼粉末為基準(zhǔn),固定超聲功率216W、超聲時(shí)間30 min和提取溫度45℃,考察料液比[1∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60(g/mL)]對(duì)山竹殼多糖提取率的影響;固定料液比1∶40(g/mL)、超聲時(shí)間30 min和超聲功率216 W,考察提取溫度(35、45、55、65、75℃)對(duì)山竹殼多糖提取率的影響;固定料液比1∶40(g/mL)、超聲功率216 W和提取溫度45℃,考察超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)對(duì)山竹殼多糖提取率的影響;固定料液比1∶40(g/mL)、超聲時(shí)間30 min和提取溫度45℃,考察超聲功率(200、240、280、320、360 W)對(duì)山竹殼多糖提取率的影響[19]。

        1.2.5 正交試驗(yàn)

        在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)之上,以相關(guān)因素為自變量、多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),設(shè)計(jì)L9(33)正交試驗(yàn)優(yōu)化山竹殼多糖的提取工藝,水平及因素見表1。

        表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

        1.2.6 多糖體外抗氧化活性測(cè)定

        1.2.6.1 對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

        首先用蒸餾水將山竹殼多糖配制成1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 7 個(gè)濃度,分別取50 μL不同濃度的山竹殼多糖溶液于96孔板中,分別加入0.1 mmoL/L的DPPH溶液150 μL,室溫25℃下避光靜置30 min后,在酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定吸光度Ai,VC做陽性對(duì)照;對(duì)照組用無水乙醇代替DPPH,測(cè)定吸光度Aj;空白組以蒸餾水代替多糖溶液,測(cè)定吸光度A0。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值[20-21]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

        1.2.6.2 對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定

        在 96 孔板中加入 50 μL 不同濃度(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL)的山竹殼多糖溶液、50 μL 9 mmol/L 的 FeSO4和 50 μL 9 mmol/L 的水楊酸-乙醇,振蕩10 min后加入50 μL 8.8 mmol/L的H2O2,VC做陽性對(duì)照,以蒸餾水代替水楊酸作為陰性對(duì)照,以蒸餾水代替多糖溶液作為空白對(duì)照,室溫25℃下避光靜置反應(yīng)30 min后,在酶標(biāo)儀510 nm處測(cè)定吸光度,試驗(yàn)重復(fù)3次[22]。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。

        式中:Ai為樣品溶液吸光度;Aj為不含水楊酸-乙醇溶液吸光度;A0為不含樣品溶液吸光度。

        1.2.6.3 對(duì)ABTS+自由基清除效果的測(cè)定

        稱取0.038 14 g ABTS粉末,定容至10 mL,配制成7 mmol/L的溶液;稱取0.013 4 g過硫酸鉀K2S2O8,定容至10 mL,配制成4.95 mmol/L溶液。將兩溶液等體積混勻,接著將其放于陰暗處靜置12 h,形成ABTS+儲(chǔ)備液,然后按體積比 1 ∶20 用 PBS(0.01 mol/L、pH 7.4)稀釋儲(chǔ)備液,使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。

        取 50 μL 不同濃度(1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL)的山竹殼多糖溶液于96孔板中,分別加入150 μL ABTS+溶液,室溫25℃下避光靜置反應(yīng)30 min后,在酶標(biāo)儀734 nm處測(cè)定吸光度Ai,VC做陽性對(duì)照;陰性對(duì)照組用蒸餾水代替ABTS+溶液,測(cè)定吸光度Aj;空白組以蒸餾水代替多糖溶液,測(cè)定吸光度A0。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值[23]。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

        1.2.7 多糖抗菌活性的測(cè)定

        采用微量肉湯稀釋法測(cè)定山竹殼多糖對(duì)供試菌的最小抑菌濃度(minimuminhibitory concentration,MIC)。首先配制50 mg/mL的山竹殼多糖溶液,用倍半法稀釋多糖溶液,形成 50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.193、0.096 6 mg/mL 10個(gè)濃度梯度。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌均接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中,在37℃條件下培養(yǎng)24 h,得到105cfu/mL的菌懸液。在96孔板中進(jìn)行樣品接種,1~11每孔均加入100 μL的營養(yǎng)肉湯,第12孔加入200 μL的營養(yǎng)肉湯;取100 μL不同濃度(50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.193、0.096 6 mg/mL)的山竹殼多糖溶液依次加入1~10孔,1~11孔均加入菌液100 μL;37℃條件下孵育16 h~18 h。在酶標(biāo)儀600 nm處測(cè)吸光度,并確定MIC[24]。

        1.2.8 多糖抗腫瘤活性的測(cè)定

        首先用DMEM培養(yǎng)基將山竹殼多糖配制成0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 7 個(gè)濃度。在 37 ℃飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng) MCF-7、DLD-1、A375和B16細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,分裝到96孔板中,調(diào)整細(xì)胞濃度使每孔約5 000個(gè)細(xì)胞,在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。取不同濃度(0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL)的多糖溶液,從低濃度到高濃度依次加入到96孔板中,每孔100 μL,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液,然后向每孔內(nèi)加入100 μL含10%CCK-8試劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h~2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度[25]。

        式中:A0為具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔吸光度;A1為具有細(xì)胞、CCK-8溶液和多糖樣品溶液的孔吸光度;A2為具有細(xì)胞、CCK-8溶液而不含多糖樣品溶液的孔吸光度。

        1.3 數(shù)據(jù)處理

        本試驗(yàn)使用GraphPad Prism 8.0.2和SPSS 23.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析,每個(gè)試驗(yàn)平行測(cè)定3次,取平均值。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 山竹殼多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

        2.1.1 料液比對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

        料液比對(duì)山竹殼多糖提取率的影響見圖1。

        圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

        由圖1可以看出,當(dāng)料液比從1∶20(g/mL)變化到1∶60(g/mL)時(shí),山竹殼多糖提取率先升高后下降,當(dāng)料液比為1∶40(g/mL)時(shí),山竹殼多糖提取率最高,為8.75%,由此可推測(cè)在一定范圍內(nèi),水用量的增加促進(jìn)了多糖從山竹殼中浸出擴(kuò)散到溶液中,而溶劑添加量過高時(shí),會(huì)影響浸提體系的傳熱和傳質(zhì),不利于多糖的提取[26]。因此,山竹殼多糖提取的最佳料液比為 1 ∶40(g/mL)。

        2.1.2 提取溫度對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

        提取溫度對(duì)山竹殼多糖提取率的影響見圖2。

        圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

        由圖2可知,隨著溫度的升高,山竹殼多糖提取率逐漸增大。當(dāng)溫度從35℃升至45℃時(shí),多糖提取率上升較快。當(dāng)溫度超過45℃,提取率增長緩慢。這可能是溫度適當(dāng)升高,使分子運(yùn)動(dòng)速率加快,多糖溶出率上升[27],但溫度過高,多糖的分子結(jié)構(gòu)在高溫環(huán)境中易被破壞,因考慮到實(shí)際意義,節(jié)約能源,選擇山竹殼多糖提取的最佳提取溫度為45℃。

        2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

        超聲時(shí)間對(duì)山竹殼多糖提取率的影響見圖3。

        圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

        由圖3可知,當(dāng)超聲時(shí)間從10 min延長到50 min時(shí),山竹殼多糖提取率整體呈先升高后下降趨勢(shì),當(dāng)超聲時(shí)間為30min時(shí),山竹殼多糖提取率最高,為9.61%,可推測(cè)隨著超聲時(shí)間的延長,細(xì)胞壁被充分破碎,多糖分子被充分溶出,提取率隨之上升,但隨著超聲時(shí)間的延長,多糖提取率下降,這可能是由于此時(shí)多糖已充分溶出,延長的超聲時(shí)間不會(huì)增加多糖的溶出而會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞,從而降低了提取率。因此,山竹殼多糖提取的最佳超聲時(shí)間為30 min。

        2.1.4 超聲功率對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

        超聲功率對(duì)山竹殼多糖提取率的影響如圖4。

        圖4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

        由圖4可知,超聲功率為240 W時(shí),山竹殼多糖提取率最高,為9.54%。超聲功率小于240 W時(shí),多糖提取率隨著超聲功率增大而上升;當(dāng)超聲功率大于240 W時(shí),多糖提取率隨著功率增大而緩慢減小。其原因可能是由于功率適當(dāng)增大,有助于破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu),但功率過大時(shí),多糖結(jié)構(gòu)受到破壞,多糖提取率些許下降,但從整體可以看出,超聲功率對(duì)山竹殼多糖的提取率影響不顯著。綜上所述,山竹殼多糖提取的最佳超聲功率為240 W。

        2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

        分析山竹殼多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知,超聲功率變動(dòng)對(duì)多糖提取率的影響不顯著,為考察因素中的次要因素。因此,固定超聲功率為240 W,研究料液比、提取溫度和超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)山竹殼多糖提取的影響,以山竹殼多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行L9(33)正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

        表2 提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

        表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experimental results

        通過表2中多糖提取率的極差分析結(jié)果可知,影響提取率的各因素主次順序?yàn)樘崛囟龋˙)>超聲時(shí)間(C)>料液比(A);通過 k 值比較可知,kA2>kA3>kA1,kB3>kB2>kB1,kC3>kC2>kC1,即山竹殼多糖提取的最優(yōu)組合為A2B3C3。由表3方差分析結(jié)果可知,料液比、提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)山竹殼多糖提取率有極顯著影響(P<0.01),故山竹殼多糖提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶40(g/mL)、提取溫度 55℃、超聲時(shí)間 40 min。按照此工藝參數(shù)提取3次,多糖提取率分別為13.56%、12.69%、12.73%,平均值為12.99%,高于正交試驗(yàn)每組的結(jié)果,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)為3.70%,說明工藝穩(wěn)定可靠。

        2.3 山竹殼多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

        2.3.1 山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

        山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果見圖5。

        圖5 多糖對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定Fig.5 The scavenging effect of polysaccharides on DPPH radical

        由圖5可知,在15.625 μg/mL~250 μg/mL濃度范圍內(nèi),DPPH自由基清除率隨著多糖濃度的增加而升高。當(dāng)多糖濃度大于250 μg/mL時(shí),山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基清除率基本保持不變,當(dāng)多糖濃度為250 μg/mL時(shí),其對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)95.3%,與同濃度VC清除DPPH自由基能力相當(dāng),山竹殼多糖清除DPPH自由基的IC50為69.25 μg/mL。因此,山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

        2.3.2 山竹殼多糖對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定

        山竹殼多糖對(duì)羥基自由基的清除效果見圖6。

        圖6 多糖對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定Fig.6 The scavenging effect of polysaccharides on OH radical

        由圖6可知,在所研究的多糖濃度范圍內(nèi),羥基自由基清除率隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為1 000 μg/mL時(shí),山竹殼多糖的羥基自由基清除率達(dá)55.21%,高于同濃度VC對(duì)羥基自由基清除率的一半,山竹殼多糖清除羥基自由基的IC50為462.50 μg/mL。因此,山竹殼多糖對(duì)羥基自由基具有較好的清除效果。

        2.3.3 山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基清除效果的測(cè)定

        山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基的清除效果見圖7。

        圖7 多糖對(duì)ABTS+自由基清除效果的測(cè)定Fig.7 The scavenging effect of polysaccharides on ABTS+radical

        由圖7可知,在 15.625 μg/mL~125 μg/mL 范圍內(nèi),ABTS+自由基清除率隨著多糖濃度的增加而提高。當(dāng)多糖濃度大于125 μg/mL時(shí),山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基清除率基本保持不變,當(dāng)多糖濃度為125 μg/mL時(shí),其對(duì)ABTS+自由基清除率可達(dá)99.16%,與同濃度VC清除ABTS+自由基的能力相當(dāng),山竹殼多糖清除ABTS+自由基的IC50為18.39 μg/mL。因此,山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基具有很強(qiáng)的清除能力。

        2.4 山竹殼多糖抗菌活性的測(cè)定

        不同濃度山竹殼多糖對(duì)5種供試菌的抑菌效果結(jié)果如表4。

        表4 多糖對(duì)供試菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of polysaccharides on test bacteria

        由表4可知,山竹殼多糖對(duì)5種菌種的MIC順序?yàn)轷U曼不動(dòng)桿菌>銅綠假單胞菌>大腸桿菌=肺炎克雷伯菌>金黃色葡萄球菌,山竹殼多糖對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC相對(duì)較高,為25 mg/mL,對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為6.25 mg/mL,對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的MIC相同,均為3.125 mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.391 mg/mL。由此可見,山竹殼多糖對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng),對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的抑制效果次之,對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果最差。

        2.5 山竹殼多糖抗腫瘤活性的測(cè)定

        山竹殼多糖抗腫瘤活性的測(cè)定結(jié)果見圖8。

        圖8 多糖對(duì)4種不同腫瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effects of polysaccharides on cell viability of tumor cells

        由圖8可知,B16和MCF-7細(xì)胞對(duì)山竹殼多糖不敏感,隨著多糖濃度的增加,其細(xì)胞活力基本保持不變;在 3.125 μg/mL~100 μg/mL 的濃度范圍內(nèi),A375和DLD-1細(xì)胞對(duì)山竹殼多糖較為敏感,隨著多糖濃度的增加,A375和人DLD-1細(xì)胞的細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。濃度為12.5 μg/mL時(shí),A375細(xì)胞增殖抑制作用與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(P<0.05),而DLD-1細(xì)胞增殖抑制作用與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01),且多糖作用于DLD-1和A375細(xì)胞的IC50分別為76.66 μg/mL和127.70 μg/mL。綜上所述,山竹殼多糖對(duì)A375和DLD-1細(xì)胞具有一定的抑制效果,對(duì)B16和MCF-7細(xì)胞無抑制作用。

        3 結(jié)論

        將單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合得出山竹殼多糖最優(yōu)提取工藝為料液比1∶40(g/mL),提取溫度55℃,超聲時(shí)間40 min,超聲功率固定為240 W,此時(shí)山竹殼多糖提取率為12.99%。山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和ABTS+自由基均具有較好的清除效果,其清除DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS+自由基的IC50值分別為69.25、462.50 μg/mL 和 18.39μg/mL,表明山竹殼多糖具有良好的抗氧化性。山竹殼多糖具有一定的抑菌效果。其中,山竹殼多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)(MIC為0.391 mg/mL),對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌抑制效果次之(MIC分別為 3.125、3.125、6.25 mg/mL),對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果最差(MIC為25 mg/mL)。山竹殼多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)和小鼠黑色素瘤細(xì)胞(B16)的無增殖抑制作用,對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞(DLD-1)和人黑色素瘤細(xì)胞(A375)的具有一定的增殖抑制效果,其作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞(DLD-1)和人黑色素瘤細(xì)胞(A375)的IC50分別為 76.66 μg/mL 和 127.70 μg/mL。本研究為山竹殼多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和天然抗氧化劑、抑菌劑、抗腫瘤活性成分的開發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù),然而抗氧化、抗菌和抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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