姚欣，孫寧云，陳鑫，范麗霞，楊安平，朱峰，劉輝，*

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 佛山 528225；2.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 佛山 528000；3.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 佛山 528000）

山竹（Garcinia mangostana L.）是藤黃科（Guttiferae）藤黃屬熱帶常綠喬木，又名山竹子、倒捻子等，原產(chǎn)于馬來西亞，現(xiàn)主要分布于泰國、越南等東南亞國家，我國廣西、海南等地也有引種[1]。山竹果實(shí)中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)，有“水果皇后”之稱[2]。

山竹的果皮作為藥材治療疾病已有幾百年歷史。山竹果皮曬干后被磨成粉末，能作為抗菌藥和抗寄生蟲藥來治療創(chuàng)傷、痢疾和慢性潰瘍[3-4]。山竹殼中主要含有氧雜蒽酮類、黃酮類、多酚類和多糖等成分[5]。其中氧雜蒽酮類是山竹殼的特征性成分，并且該類化合物具有顯著的抗氧化、抗菌、抗炎、細(xì)胞毒作用[6]。此外，山竹殼富含的黃酮類、多酚類化合物在抗氧化、抗菌等方面具有較好的作用[7]，而對(duì)其多糖的提取及生物活性研究涉及較少。

近年來，多糖在免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血脂等方面顯示出較好的作用，多糖也成為研究的熱點(diǎn)。Li等[8]研究了海金沙草多糖的抗菌效果，結(jié)果表明其具有廣譜抗菌作用，尤其對(duì)酵母菌有著較高的抑制作用。宮海全[9]的研究結(jié)果表明蜜環(huán)菌多糖能提高糖尿病小鼠肝臟的自噬水平，減少脂肪堆積，提高胰島素敏感性且能保護(hù)糖尿病小鼠的胰島，改善受損的功能，達(dá)到降血糖的功效。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，800 mg/L的枸杞多糖可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期來發(fā)揮抗腫瘤活性，可以抑制人膀胱癌細(xì)胞系BIU87的生長，誘導(dǎo)BIU87細(xì)胞凋亡[10]。

山竹多糖的研究多集中在果肉中，李娥等[11]測(cè)定了山竹提取物有效成分，并分析了多糖組成，結(jié)果表明，山竹果肉中富含多糖，主要有葡萄糖、葡萄糖醛酸、果糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖。對(duì)果殼多糖的研究較少，Gan等[12]采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化山竹殼果膠多糖的提取工藝條件，從而獲得具有高糖醛酸含量和抗氧化活性的高抗氧化果膠多糖。為了更好地利用山竹果殼，提高山竹殼的開發(fā)利用價(jià)值，本文采用正交試驗(yàn)，對(duì)超聲輔助提取山竹殼多糖的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其抗氧化活性、抗菌活性以及抗腫瘤活性進(jìn)行研究，為山竹殼在食品等方面的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

山竹殼：市售；菌種（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌）：廣東省微生物菌種保藏中心；人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人結(jié)腸癌細(xì)胞（DLD-1）、人黑色素瘤細(xì)胞（A375）、小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）：中國科學(xué)院上海細(xì)胞中心。葡萄糖、苯酚、DPPH、ABTS、二甲基亞砜（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司；過硫酸鉀（分析純）：福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）：亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；LB培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）：美國 Gibco 公司；青霉素、鏈霉素：上海撫生有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

超聲波清洗器（060ST）：深圳市華策科技有限公司；臺(tái)式高速離心機(jī)（TG16-WS）：湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-2000A）：鄭州特爾儀器設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)（UV-2700）：島津企業(yè)管理（中國）有限公司；全波長酶標(biāo)儀（EPOCH）：美國BioTek公司；智能生化培養(yǎng)箱（LRH-150）：鄭州生元儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱（BB 5060）、立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器（GR60DA）：致微（廈門）儀器有限公司；倒置熒光顯微鏡（IMC-900TFL）：廣州科適特科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理

取山竹殼于60℃烘箱中干燥至恒重，然后用粉碎機(jī)粉碎，過60目篩獲取山竹殼樣品備用[13]。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

首先準(zhǔn)確稱量10 mg已充分干燥至恒重的葡萄糖粉末，在燒杯中加入適量去離子水?dāng)嚢枋蛊咸烟峭耆芙?，然后將其定容?00 mL容量瓶中，即得到0.100 0 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別準(zhǔn)確移取上述葡萄糖溶液 0、0.20、0.40、0.60、0.80 mL，然后用去離子水補(bǔ)至1 mL，配制濃度分別為0、20.00、40.00、60.00、80.00 μg/mL 葡萄糖待測(cè)液。分別移取1.00 mL上述各個(gè)濃度葡萄糖待測(cè)液到試管中，接著依次加入5.0%苯酚溶液1.0 mL，充分混勻，然后立即加入98%濃硫酸5 mL，混勻后靜置5 min，于37℃水浴加熱20 min，待其溫度降到室溫25℃后于488 nm波長下測(cè)定吸光度[14-15]。以吸光度Y對(duì)濃度X進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=0.009 4X+0.092 8，R2=0.993，線性范圍為 0～80 μg/mL。

1.2.3 山竹殼多糖的提取及提取率測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.000 g的山竹殼粉末，與一定體積的去離子水依次加入到錐形瓶中。然后將錐形瓶放置于超聲機(jī)內(nèi)，設(shè)定超聲功率、超聲時(shí)間、提取溫度等參數(shù)，共提取3次，合并濾液，濃縮至25 mL，采用Sevag法[16]脫蛋白，即得多糖提取液[17-18]。按照1.2.2中的方法測(cè)定多糖提取液的吸光度，通過回歸方程計(jì)算多糖濃度，并按照公式計(jì)算多糖提取率。

式中：C為提取液多糖濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為山竹殼粉末質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn)

以1.000g山竹殼粉末為基準(zhǔn)，固定超聲功率216W、超聲時(shí)間30 min和提取溫度45℃，考察料液比[1∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60（g/mL）]對(duì)山竹殼多糖提取率的影響；固定料液比1∶40（g/mL）、超聲時(shí)間30 min和超聲功率216 W，考察提取溫度（35、45、55、65、75℃）對(duì)山竹殼多糖提取率的影響；固定料液比1∶40（g/mL）、超聲功率216 W和提取溫度45℃，考察超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)山竹殼多糖提取率的影響；固定料液比1∶40（g/mL）、超聲時(shí)間30 min和提取溫度45℃，考察超聲功率（200、240、280、320、360 W）對(duì)山竹殼多糖提取率的影響[19]。

1.2.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)之上，以相關(guān)因素為自變量、多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9（33）正交試驗(yàn)優(yōu)化山竹殼多糖的提取工藝，水平及因素見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

1.2.6 多糖體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.6.1 對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

首先用蒸餾水將山竹殼多糖配制成1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/mL 7 個(gè)濃度，分別取50 μL不同濃度的山竹殼多糖溶液于96孔板中，分別加入0.1 mmoL/L的DPPH溶液150 μL，室溫25℃下避光靜置30 min后，在酶標(biāo)儀517 nm處測(cè)定吸光度Ai，VC做陽性對(duì)照；對(duì)照組用無水乙醇代替DPPH，測(cè)定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測(cè)定吸光度A0。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值[20-21]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.2.6.2 對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定

在 96 孔板中加入 50 μL 不同濃度（1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL）的山竹殼多糖溶液、50 μL 9 mmol/L 的 FeSO4和 50 μL 9 mmol/L 的水楊酸-乙醇，振蕩10 min后加入50 μL 8.8 mmol/L的H2O2，VC做陽性對(duì)照，以蒸餾水代替水楊酸作為陰性對(duì)照，以蒸餾水代替多糖溶液作為空白對(duì)照，室溫25℃下避光靜置反應(yīng)30 min后，在酶標(biāo)儀510 nm處測(cè)定吸光度，試驗(yàn)重復(fù)3次[22]。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下。

式中：Ai為樣品溶液吸光度；Aj為不含水楊酸-乙醇溶液吸光度；A0為不含樣品溶液吸光度。

1.2.6.3 對(duì)ABTS+自由基清除效果的測(cè)定

稱取0.038 14 g ABTS粉末，定容至10 mL，配制成7 mmol/L的溶液；稱取0.013 4 g過硫酸鉀K2S2O8，定容至10 mL，配制成4.95 mmol/L溶液。將兩溶液等體積混勻，接著將其放于陰暗處靜置12 h，形成ABTS+儲(chǔ)備液，然后按體積比 1 ∶20 用 PBS（0.01 mol/L、pH 7.4）稀釋儲(chǔ)備液，使其在734 nm波長下的吸光度為0.70±0.02。

取 50 μL 不同濃度（1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL）的山竹殼多糖溶液于96孔板中，分別加入150 μL ABTS+溶液，室溫25℃下避光靜置反應(yīng)30 min后，在酶標(biāo)儀734 nm處測(cè)定吸光度Ai，VC做陽性對(duì)照；陰性對(duì)照組用蒸餾水代替ABTS+溶液，測(cè)定吸光度Aj；空白組以蒸餾水代替多糖溶液，測(cè)定吸光度A0。試驗(yàn)重復(fù)3次取平均值[23]。ABTS+自由基清除率計(jì)算公式如下。

1.2.7 多糖抗菌活性的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定山竹殼多糖對(duì)供試菌的最小抑菌濃度（minimuminhibitory concentration，MIC）。首先配制50 mg/mL的山竹殼多糖溶液，用倍半法稀釋多糖溶液，形成 50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.193、0.096 6 mg/mL 10個(gè)濃度梯度。將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌均接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)24 h，得到105cfu/mL的菌懸液。在96孔板中進(jìn)行樣品接種，1～11每孔均加入100 μL的營養(yǎng)肉湯，第12孔加入200 μL的營養(yǎng)肉湯；取100 μL不同濃度（50、25、12.5、6.25、3.125、1.563、0.781、0.391、0.193、0.096 6 mg/mL）的山竹殼多糖溶液依次加入1～10孔，1～11孔均加入菌液100 μL；37℃條件下孵育16 h～18 h。在酶標(biāo)儀600 nm處測(cè)吸光度，并確定MIC[24]。

1.2.8 多糖抗腫瘤活性的測(cè)定

首先用DMEM培養(yǎng)基將山竹殼多糖配制成0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 7 個(gè)濃度。在 37 ℃飽和濕度、5% CO2條件下培養(yǎng) MCF-7、DLD-1、A375和B16細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，分裝到96孔板中，調(diào)整細(xì)胞濃度使每孔約5 000個(gè)細(xì)胞，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。取不同濃度（0、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的多糖溶液，從低濃度到高濃度依次加入到96孔板中，每孔100 μL，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，然后向每孔內(nèi)加入100 μL含10%CCK-8試劑的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h～2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光度[25]。

式中：A0為具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔吸光度；A1為具有細(xì)胞、CCK-8溶液和多糖樣品溶液的孔吸光度；A2為具有細(xì)胞、CCK-8溶液而不含多糖樣品溶液的孔吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)使用GraphPad Prism 8.0.2和SPSS 23.0等軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)試驗(yàn)平行測(cè)定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 山竹殼多糖單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 料液比對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

料液比對(duì)山竹殼多糖提取率的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由圖1可以看出，當(dāng)料液比從1∶20（g/mL）變化到1∶60（g/mL）時(shí)，山竹殼多糖提取率先升高后下降，當(dāng)料液比為1∶40（g/mL）時(shí)，山竹殼多糖提取率最高，為8.75%，由此可推測(cè)在一定范圍內(nèi)，水用量的增加促進(jìn)了多糖從山竹殼中浸出擴(kuò)散到溶液中，而溶劑添加量過高時(shí)，會(huì)影響浸提體系的傳熱和傳質(zhì)，不利于多糖的提取[26]。因此，山竹殼多糖提取的最佳料液比為 1 ∶40（g/mL）。

2.1.2 提取溫度對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

提取溫度對(duì)山竹殼多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，隨著溫度的升高，山竹殼多糖提取率逐漸增大。當(dāng)溫度從35℃升至45℃時(shí)，多糖提取率上升較快。當(dāng)溫度超過45℃，提取率增長緩慢。這可能是溫度適當(dāng)升高，使分子運(yùn)動(dòng)速率加快，多糖溶出率上升[27]，但溫度過高，多糖的分子結(jié)構(gòu)在高溫環(huán)境中易被破壞，因考慮到實(shí)際意義，節(jié)約能源，選擇山竹殼多糖提取的最佳提取溫度為45℃。

2.1.3 超聲時(shí)間對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)山竹殼多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of polysaccharides

由圖3可知，當(dāng)超聲時(shí)間從10 min延長到50 min時(shí)，山竹殼多糖提取率整體呈先升高后下降趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為30min時(shí)，山竹殼多糖提取率最高，為9.61%，可推測(cè)隨著超聲時(shí)間的延長，細(xì)胞壁被充分破碎，多糖分子被充分溶出，提取率隨之上升，但隨著超聲時(shí)間的延長，多糖提取率下降，這可能是由于此時(shí)多糖已充分溶出，延長的超聲時(shí)間不會(huì)增加多糖的溶出而會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)的破壞，從而降低了提取率。因此，山竹殼多糖提取的最佳超聲時(shí)間為30 min。

2.1.4 超聲功率對(duì)山竹殼多糖提取率的影響

超聲功率對(duì)山竹殼多糖提取率的影響如圖4。

圖4 超聲功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，超聲功率為240 W時(shí)，山竹殼多糖提取率最高，為9.54%。超聲功率小于240 W時(shí)，多糖提取率隨著超聲功率增大而上升；當(dāng)超聲功率大于240 W時(shí)，多糖提取率隨著功率增大而緩慢減小。其原因可能是由于功率適當(dāng)增大，有助于破碎細(xì)胞結(jié)構(gòu)，但功率過大時(shí)，多糖結(jié)構(gòu)受到破壞，多糖提取率些許下降，但從整體可以看出，超聲功率對(duì)山竹殼多糖的提取率影響不顯著。綜上所述，山竹殼多糖提取的最佳超聲功率為240 W。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

分析山竹殼多糖提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，超聲功率變動(dòng)對(duì)多糖提取率的影響不顯著，為考察因素中的次要因素。因此，固定超聲功率為240 W，研究料液比、提取溫度和超聲時(shí)間3個(gè)因素對(duì)山竹殼多糖提取的影響，以山竹殼多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行L9（33）正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 提取工藝條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction conditions optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experimental results

通過表2中多糖提取率的極差分析結(jié)果可知，影響提取率的各因素主次順序?yàn)樘崛囟龋˙）＞超聲時(shí)間（C）＞料液比（A）；通過 k 值比較可知，kA2＞kA3＞kA1，kB3＞kB2＞kB1，kC3＞kC2＞kC1，即山竹殼多糖提取的最優(yōu)組合為A2B3C3。由表3方差分析結(jié)果可知，料液比、提取溫度和超聲時(shí)間對(duì)山竹殼多糖提取率有極顯著影響（P＜0.01），故山竹殼多糖提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶40（g/mL）、提取溫度 55℃、超聲時(shí)間 40 min。按照此工藝參數(shù)提取3次，多糖提取率分別為13.56%、12.69%、12.73%，平均值為12.99%，高于正交試驗(yàn)每組的結(jié)果，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為3.70%，說明工藝穩(wěn)定可靠。

2.3 山竹殼多糖體外抗氧化活性的測(cè)定

2.3.1 山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定

山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果見圖5。

圖5 多糖對(duì)DPPH自由基清除效果的測(cè)定Fig.5 The scavenging effect of polysaccharides on DPPH radical

由圖5可知，在15.625 μg/mL～250 μg/mL濃度范圍內(nèi)，DPPH自由基清除率隨著多糖濃度的增加而升高。當(dāng)多糖濃度大于250 μg/mL時(shí)，山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基清除率基本保持不變，當(dāng)多糖濃度為250 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除率可達(dá)95.3%，與同濃度VC清除DPPH自由基能力相當(dāng)，山竹殼多糖清除DPPH自由基的IC50為69.25 μg/mL。因此，山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

2.3.2 山竹殼多糖對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定

山竹殼多糖對(duì)羥基自由基的清除效果見圖6。

圖6 多糖對(duì)羥基自由基清除效果的測(cè)定Fig.6 The scavenging effect of polysaccharides on OH radical

由圖6可知，在所研究的多糖濃度范圍內(nèi)，羥基自由基清除率隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為1 000 μg/mL時(shí)，山竹殼多糖的羥基自由基清除率達(dá)55.21%，高于同濃度VC對(duì)羥基自由基清除率的一半，山竹殼多糖清除羥基自由基的IC50為462.50 μg/mL。因此，山竹殼多糖對(duì)羥基自由基具有較好的清除效果。

2.3.3 山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基清除效果的測(cè)定

山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基的清除效果見圖7。

圖7 多糖對(duì)ABTS+自由基清除效果的測(cè)定Fig.7 The scavenging effect of polysaccharides on ABTS+radical

由圖7可知，在 15.625 μg/mL～125 μg/mL 范圍內(nèi)，ABTS+自由基清除率隨著多糖濃度的增加而提高。當(dāng)多糖濃度大于125 μg/mL時(shí)，山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基清除率基本保持不變，當(dāng)多糖濃度為125 μg/mL時(shí)，其對(duì)ABTS+自由基清除率可達(dá)99.16%，與同濃度VC清除ABTS+自由基的能力相當(dāng)，山竹殼多糖清除ABTS+自由基的IC50為18.39 μg/mL。因此，山竹殼多糖對(duì)ABTS+自由基具有很強(qiáng)的清除能力。

2.4 山竹殼多糖抗菌活性的測(cè)定

不同濃度山竹殼多糖對(duì)5種供試菌的抑菌效果結(jié)果如表4。

表4 多糖對(duì)供試菌的抑菌效果Table 4 Antibacterial effect of polysaccharides on test bacteria

由表4可知，山竹殼多糖對(duì)5種菌種的MIC順序?yàn)轷U曼不動(dòng)桿菌＞銅綠假單胞菌＞大腸桿菌=肺炎克雷伯菌＞金黃色葡萄球菌，山竹殼多糖對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的MIC相對(duì)較高，為25 mg/mL，對(duì)銅綠假單胞菌的MIC為6.25 mg/mL，對(duì)大腸桿菌和肺炎克雷伯菌的MIC相同，均為3.125 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.391 mg/mL。由此可見，山竹殼多糖對(duì)金黃色葡萄球菌抑制作用最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌的抑制效果次之，對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果最差。

2.5 山竹殼多糖抗腫瘤活性的測(cè)定

山竹殼多糖抗腫瘤活性的測(cè)定結(jié)果見圖8。

圖8 多糖對(duì)4種不同腫瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響Fig.8 Effects of polysaccharides on cell viability of tumor cells

由圖8可知，B16和MCF-7細(xì)胞對(duì)山竹殼多糖不敏感，隨著多糖濃度的增加，其細(xì)胞活力基本保持不變；在 3.125 μg/mL～100 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，A375和DLD-1細(xì)胞對(duì)山竹殼多糖較為敏感，隨著多糖濃度的增加，A375和人DLD-1細(xì)胞的細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。濃度為12.5 μg/mL時(shí)，A375細(xì)胞增殖抑制作用與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異（P＜0.05），而DLD-1細(xì)胞增殖抑制作用與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），且多糖作用于DLD-1和A375細(xì)胞的IC50分別為76.66 μg/mL和127.70 μg/mL。綜上所述，山竹殼多糖對(duì)A375和DLD-1細(xì)胞具有一定的抑制效果，對(duì)B16和MCF-7細(xì)胞無抑制作用。

3 結(jié)論

將單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合得出山竹殼多糖最優(yōu)提取工藝為料液比1∶40（g/mL），提取溫度55℃，超聲時(shí)間40 min，超聲功率固定為240 W，此時(shí)山竹殼多糖提取率為12.99%。山竹殼多糖對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和ABTS+自由基均具有較好的清除效果，其清除DPPH自由基、羥基自由基以及ABTS+自由基的IC50值分別為69.25、462.50 μg/mL 和 18.39μg/mL，表明山竹殼多糖具有良好的抗氧化性。山竹殼多糖具有一定的抑菌效果。其中，山竹殼多糖對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)（MIC為0.391 mg/mL），對(duì)大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和銅綠假單胞菌抑制效果次之（MIC分別為 3.125、3.125、6.25 mg/mL），對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的抑制效果最差（MIC為25 mg/mL）。山竹殼多糖對(duì)人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）和小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16）的無增殖抑制作用，對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞（DLD-1）和人黑色素瘤細(xì)胞（A375）的具有一定的增殖抑制效果，其作用于人結(jié)腸癌細(xì)胞（DLD-1）和人黑色素瘤細(xì)胞（A375）的IC50分別為 76.66 μg/mL 和 127.70 μg/mL。本研究為山竹殼多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和天然抗氧化劑、抑菌劑、抗腫瘤活性成分的開發(fā)提供了試驗(yàn)依據(jù)，然而抗氧化、抗菌和抗腫瘤機(jī)制有待進(jìn)一步研究。