舒聰涵，孫繼鵬，王家星，廖妙飛，鄭斌，周宇芳*

（1.浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大學(xué)，浙江 舟山 316022）

將動(dòng)物的皮、骨或明膠通過水解降解為小分子肽段，當(dāng)其單條肽鏈的組成在兩個(gè)氨基酸以上且分子量小于10 kDa時(shí)，可以稱為膠原肽[1]，膠原肽由膠原衍生而來，也稱為水解膠原。研究表明，攝入某些膠原水解物具有促進(jìn)健康的作用，其除了擁有膠原所有性質(zhì)外，還具有多種生物活性[2]，如降血壓、抑菌、抗腫瘤等[3-6]。此外，相較于陸生動(dòng)物膠原蛋白，海洋生物蛋白具有低過敏性、低抗原性等優(yōu)勢(shì)[7]。

金槍魚是一種大洋暖水性高度洄游魚類，屬硬骨魚綱鱸形目鯖科[8]。作為一種深海魚類，金槍魚營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮美、無污染，頗受市場(chǎng)歡迎，其加工產(chǎn)業(yè)也因此發(fā)展迅速。但在加工過程中會(huì)伴隨著大量副產(chǎn)物的產(chǎn)生，通常被隨意丟棄或是直接加工成低值飼料，既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。金槍魚魚骨約占副產(chǎn)物20%[9]，其蛋白含量豐富，約為57.2%[10]，將它作為提取膠原肽的原材料，可以提高金槍魚骨的利用價(jià)值。因此本研究以金槍魚骨為原料，采用酶解法制備骨膠原肽，以水解度為指標(biāo)，從5種商用蛋白酶中篩選出最佳蛋白酶，并通過單因素、響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝，以期為金槍魚骨附加值的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃鰭金槍魚骨：浙江融創(chuàng)食品工業(yè)有限公司；胃蛋白酶（2 000 U/g）：華懋雙匯實(shí)業(yè)公司生物化學(xué)制藥廠；食用小蘇打：河南恩苗食品有限公司；動(dòng)物蛋白酶（10萬 U/g）、骨蛋白酶（10萬 U/g）、海產(chǎn)品水解酶（10萬 U/g）：南寧東恒華道生物公司；中性蛋白酶（5萬U/g）：河南仰韶生化工程有限公司；風(fēng)味蛋白酶（1.5萬U/g～1.7萬U/g）：浙江一諾生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：美國(guó)TEDIA公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯（均為色譜純）：美國(guó)Sigma公司；三乙胺、四氫呋喃、結(jié)晶乙酸鈉、三氯乙酸、鹽酸、氫氧化鈉、甲醛（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KDN816凱氏定氮儀：上海纖檢儀器有限公司；710401040冷凍干燥機(jī)：美國(guó)Labconco公司；YSF-20L雙層玻璃反應(yīng)釜：鞏義市予華儀器有限公司；CeraMem-0100卷式膜多功能小試設(shè)備：廈門世達(dá)膜科技有限公司；Agilent 1100高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技公司。

1.3 方法

1.3.1 金槍魚骨粉的制備

從-20℃冰箱中取出魚骨，流水解凍15 min左右，刷子清洗表面后去除多余碎肉，并用剪刀將魚骨剪成2 cm左右小段；稱重后，加入2%胃蛋白酶，調(diào)節(jié)pH值為3.0，在55℃條件下對(duì)無法去除的碎肉酶解3 h；用滅菌鍋120℃蒸煮30 min，去除油脂，瀝干；添加2%食用小蘇打進(jìn)行脫色，2 h后多次用自來水沖洗至中性；55℃烘箱烘干12 h；將魚骨用粉碎機(jī)粉碎后過20目篩，得到成品魚骨粉。

1.3.2 篩選最佳水解用酶

稱取魚骨粉10 g，加入100 mL去離子水，分別添加1.0%的動(dòng)物蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、骨蛋白酶和海產(chǎn)品水解酶，酶解條件見表1。酶解結(jié)束后沸水浴滅酶15 min，離心取上清液測(cè)水解度。通過比較水解度的高低，選擇酶解效果最佳的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

酶解液中的游離氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛滴定法測(cè)定[11]。原料中總氮含量采用GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法測(cè)定，取3次平行測(cè)量的平均值。用下列公式計(jì)算水解度。

1.3.3 酶解條件單因素試驗(yàn)

選擇1.3.2篩選出的水解度最佳的酶對(duì)金槍魚骨進(jìn)行酶解，固定溫度50℃、自然pH值、時(shí)間6 h、料液比 0.10∶1（g/mL），考察不同酶添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）對(duì)水解度的影響；固定酶添加量、溫度50 ℃、自然 pH 值、料液比0.10∶1（g/mL），考察不同酶解時(shí)間（2、4、6、8、10 h）對(duì)水解度的影響；固定酶解時(shí)間、酶添加量、溫度50℃、自然pH值，考察不同料液比[0.04 ∶1、0.06 ∶1、0.08 ∶1、0.10 ∶1、0.12 ∶1（g/mL）]對(duì)水解度的影響；固定料液比、酶解時(shí)間、酶添加量、自然pH 值，考察不同溫度（40、45、50、55、60 ℃）對(duì)水解度的影響；固定酶解溫度、料液比、酶解時(shí)間和酶添加量，考察不同 pH 值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）對(duì)水解度的影響。

1.3.4 酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，考察酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、料液比（C）、溫度（D）、pH值（E）這5個(gè)因素對(duì)水解度的影響，各取3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平見表2。

表2 金槍魚骨酶解工藝的響應(yīng)面因素和水平Table 2 Response surface factors and levels of enzymatic hydrolysis of tuna bone

1.3.5 金槍魚骨膠原肽的游離氨基酸組成測(cè)定

在反應(yīng)釜中對(duì)金槍魚骨進(jìn)行酶解，酶解條件為1.3.4優(yōu)化得到的最優(yōu)工藝，酶解結(jié)束后90℃滅酶0.5 h，離心棄沉淀，上清液即為金槍魚骨膠原肽酶解液。將酶解液過卷式膜多功能小試設(shè)備進(jìn)行分子量分級(jí)，得到不同分子級(jí)的金槍魚骨膠原肽。

用三氯乙酸沉淀不同分子級(jí)的金槍魚骨膠原肽后，分別以鄰苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯作為一級(jí)和二級(jí)氨基酸的衍生反應(yīng)試劑，參考GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的柱前自動(dòng)衍生化反相高效液相色譜法測(cè)定骨膠原肽中的游離氨基酸總量。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，單因素試驗(yàn)利用Excel軟件進(jìn)行分析，利用Origin 8.0軟件進(jìn)行繪圖，響應(yīng)面試驗(yàn)利用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶篩選結(jié)果

5種蛋白酶的水解度比較結(jié)果見圖1。

圖1 5種蛋白酶的水解度比較Fig.1 Comparison of hydrolysis degrees of five proteases

水解度高代表更多的底物被蛋白酶水解，由圖1可知，水解度由高到低依次為動(dòng)物蛋白酶、海產(chǎn)品蛋白酶、骨蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶，最后是中性蛋白酶。與海產(chǎn)品蛋白酶相比，動(dòng)物蛋白酶水解度略高，但無顯著性（p＞0.05），與其他蛋白酶相比差異明顯。蛋白酶根據(jù)作用位點(diǎn)不同，分為內(nèi)肽酶和端肽酶。內(nèi)肽酶能從中間切斷大分子量多肽鏈，形成小分子量多肽；端肽酶能從多肽的游離羧基末端或氨基末端逐個(gè)水解肽鏈生成氨基酸[12]。動(dòng)物蛋白酶本身是一種由內(nèi)肽酶和端肽酶組成的復(fù)合酶，具有多種酶切位點(diǎn)，故其水解度較高。柏昌旺等[13]以水解度、短肽質(zhì)量濃度及得率為指標(biāo)對(duì)牡蠣進(jìn)行水解，從5種蛋白酶中篩選出效果較好的酶是動(dòng)物蛋白酶，與本研究所得結(jié)論相似。因此，本試驗(yàn)選取動(dòng)物蛋白酶進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶添加量對(duì)水解度的影響

酶添加量對(duì)水解度的影響見圖2。

圖2 酶添加量對(duì)水解度的影響Fig.2 The efect of enzyme addition on degree of hydrolysis

如圖2所示，當(dāng)酶添加量從0.5%到2.0%時(shí)，水解度逐漸增加，在2.0%時(shí)水解度達(dá)到最高。當(dāng)酶添加量從2.0%繼續(xù)增加到3.0%時(shí)，水解度則呈現(xiàn)略微下降的趨勢(shì)。酶添加量的多少意味著酶活性的大小，當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r(shí)，隨著酶添加量的增加，水解度與其成正比。但當(dāng)酶添加量過多時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致底物與酶的結(jié)合位點(diǎn)不斷減少，即便再添加酶，水解度也不會(huì)有較大提高，還會(huì)造成浪費(fèi)[14]。故2.0%為最適加酶量。

2.2.2 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響

酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響見圖3。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.3 The effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis

如圖3所示，當(dāng)酶解時(shí)間從2 h到8 h時(shí)，水解度持續(xù)升高；當(dāng)酶解時(shí)間從8 h增加到10 h時(shí)，金槍魚骨膠原肽的水解度變化則不大?？梢钥闯?，酶解時(shí)間越長(zhǎng)酶解越徹底，但隨著時(shí)間的延后，底物不斷發(fā)生反應(yīng)，濃度逐漸降低，酶活也達(dá)到極限，水解度也趨于穩(wěn)定[15]。故本試驗(yàn)選取酶解時(shí)間為8 h。

2.2.3 料液比對(duì)水解度的影響

料液比對(duì)水解度的影響見圖4。

圖4 料液比對(duì)水解度的影響Fig.4 The effect of material liquid ratio on degree of hydrolysis

由圖4可以看出，當(dāng)料液比從 0.04∶1（g/mL）到0.08∶1（g/mL）時(shí)，水解度升高并在料液比為0.08∶1（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)料液比從 0.08∶1（g/mL）到0.12∶1（g/mL）時(shí)，水解度則開始逐漸降低。由此可見，當(dāng)料液比為0.08∶1（g/mL）時(shí)，金槍魚骨膠原肽的水解度最佳。料液比對(duì)酶解速率有重要影響，底物濃度過低時(shí)，酶與底物結(jié)合空間較小，水解程度不高，降低試驗(yàn)效率；底物濃度過高時(shí)，蛋白溶液黏度增大，影響酶與底物的充分接觸，水解度也會(huì)下降[16]。

2.2.4 溫度對(duì)水解度的影響

溫度對(duì)水解度的影響見圖5。

圖5 溫度對(duì)水解度的影響Fig.5 The effect of temperature on degree of hydrolysis

如圖5所示，當(dāng)酶解溫度從40℃升高到55℃時(shí)，水解度逐漸增加，當(dāng)溫度為55℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值。當(dāng)酶解溫度從55℃繼續(xù)升高到60℃時(shí)，水解度則開始下降。酶解溫度影響著酶的活性，溫度的升高有利于提高酶活性，但過高時(shí)會(huì)導(dǎo)致酶活性減弱甚至喪失，從而影響酶解效果[17]。故本試驗(yàn)選取55℃作為酶解溫度。

2.2.5 pH值對(duì)水解度的影響

pH值對(duì)水解度的影響見圖6。

圖6 pH值對(duì)水解度的影響Fig.6 The effect of pH on degree of hydrolysis

如圖6所示，當(dāng)pH值從6.5到7.0時(shí)，水解度逐漸升高并在7.0時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)pH值從7.0繼續(xù)增加到8.5時(shí)，水解度則持續(xù)降低。pH值會(huì)通過影響酶的構(gòu)象和底物的解離狀態(tài)進(jìn)而影響水解度[18]。因此，本試驗(yàn)選取酶解pH值為7.0。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，以酶添加量、酶解時(shí)間、料液比、溫度、pH值這5個(gè)因素作為響應(yīng)變量，水解度作為響應(yīng)值，用Design Expert 8.0軟件Box-Behnken組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，每個(gè)變量均設(shè)3個(gè)水平，方案與結(jié)果如表3所示。

表3 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Response surface design and experimental results

續(xù)表3 響應(yīng)面方案設(shè)計(jì)和試驗(yàn)結(jié)果Continue table 3 Response surface design and experimental results

對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行分析，得到金槍魚骨膠原肽水解度對(duì)酶添加量、酶解時(shí)間、料液比、溫度、pH值5個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型方程，即y=65.55+1.72A+1.29B+1.46C-2.17D+1.00E+0.018AB+0.5AC-1.88AD+0.39AE+0.11BC-0.005 5BD-0.10BE-0.32CD+0.61CE+0.043DE-2.34A2-3.43B2-3.77C2-5.91D2-4.31E2。

方差分析見表4。

表4 回歸方程參數(shù)方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation parameters

續(xù)表4 回歸方程參數(shù)方差分析Continue table 4 Analysis of variance of regression equation parameters

由表4方差分析可知，模型p值＜0.000 1，擬合度較好。失擬項(xiàng)p值為0.095 6＞0.05，不顯著，進(jìn)一步說明模型不失擬，選擇合理。根據(jù)文獻(xiàn)研究表明，R2＞0.75是模型可被接受的范圍[19]，本試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2為0.939 9，相對(duì)可靠，可用來預(yù)測(cè)試驗(yàn)結(jié)果。一次項(xiàng)中，酶添加量（A）、酶解時(shí)間（B）、料液比（C）、溫度（D）、pH 值（E）這5個(gè)因素對(duì)水解度影響的主次順序?yàn)镈＞A＞C＞B＞E，且都極顯著影響水解度（p＜0.01）。在二次項(xiàng)中，各因素均影響極顯著（p＜0.01），但各因素間交叉項(xiàng)對(duì)于水解度的影響較?。╬＞0.05），僅有A和D交互項(xiàng)影響極顯著（p＜0.01）。

根據(jù)金槍魚骨膠原肽水解度的回歸方程，利用Design Expert分析軟件可以得到各因素交互作用的響應(yīng)面圖，其中酶添加量和溫度之間的相互作用如圖7所示。

圖7 酶添加量和溫度對(duì)水解度的交互作用Fig.7 Interaction of enzyme addition and temperature on degree of hydrolysis

響應(yīng)面圖較為直觀地反映兩個(gè)因素對(duì)水解度的影響，當(dāng)響應(yīng)值越敏感時(shí)，其在響應(yīng)曲面圖中的曲線變化趨勢(shì)越大，坡度則越陡，顏色也愈加深。從圖7中可以看出，隨著酶添加量不斷升高，水解度逐漸增加；隨著溫度的升高，水解度則先增加后減小。酶添加量和溫度的交互作用對(duì)水解度的影響較大，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲線走勢(shì)較陡峭，顏色也逐漸由淺變深，說明金槍魚骨膠原肽水解度對(duì)酶添加量和溫度的交互作用較為敏感，與方差分析結(jié)果一致。

2.4 水解度最優(yōu)制備工藝條件的確定與驗(yàn)證

根據(jù)響應(yīng)面分析得到最優(yōu)酶解條件為酶添加量2.52%、酶解時(shí)間 8.38 h、料液比 0.09 ∶1（g/mL）、溫度53.64℃、pH 7.08，此時(shí)理論上金槍魚骨膠原肽水解度最高，為66.68%。為了便于實(shí)際操作，將酶解條件修正為酶添加量 2.5%、酶解時(shí)間 8 h、料液比 0.09∶1（g/mL）、溫度53℃、pH 7.0。在該條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得水解度為65.43%，與理論值接近。這表明該模型適用于金槍魚骨膠原肽酶解工藝的分析和預(yù)測(cè)。

2.5 游離氨基酸組成分析

大多數(shù)游離氨基酸不僅自身具有特殊滋味，還可以通過脫羧、脫氨等作用生成其他揮發(fā)性風(fēng)味前體物質(zhì)[20]，并具有增鮮和提高機(jī)體免疫力等作用[21]。對(duì)最優(yōu)酶解工藝進(jìn)行放大試驗(yàn)，過膜后得到兩個(gè)不同分子級(jí)的骨膠原肽，分別命名為骨膠原肽1（bone collagen peptides 1，BCP1，分子量為 250 Da～1 000 Da）、骨膠原肽 2（bone collagen peptides 2，BCP2，分子量為 1 000 Da～3 500 Da），骨膠原肽中的游離氨基酸組成見表5。

表5 骨膠原肽中的游離氨基酸組成Table 5 Composition of free amino acids in bone collagen peptides

續(xù)表5 骨膠原肽中的游離氨基酸組成Continue table 5 Composition of free amino acids in bone collagen peptides

由表5可知，金槍魚骨膠原肽中的氨基酸種類豐富，兩種不同分子量的骨膠原肽中均能檢測(cè)到17種游離氨基酸，在總含量上BCP1遠(yuǎn)大于BCP2。兩者在組成上也存在一定差異，BCP1中必需氨基酸占游離氨基酸總量的42.02%，含量最高的必需氨基酸是賴氨酸，占游離氨基酸總量的10.27%。而BCP2中必需氨基酸占游離氨基酸總量的31.53%，其中含量最高的必需氨基酸也是賴氨酸（11.33%）。由此可見，金槍魚骨膠原肽可以滿足人體對(duì)必需氨基酸的需求，利用價(jià)值高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以金槍魚骨為原料，從5種蛋白酶中篩選出動(dòng)物蛋白酶為酶解制備骨膠原肽的最佳蛋白酶，并通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)分析，優(yōu)化得到最優(yōu)工藝條件為酶添加量 2.5%、pH7.0、料液比0.09∶1（g/mL）、溫度53℃、酶解時(shí)間8 h，此時(shí)水解度為65.43%。在該條件下，進(jìn)行工藝放大試驗(yàn)和過膜精制，得到兩個(gè)不同分子級(jí)的骨膠原肽（BCP1和BCP2），對(duì)其游離氨基酸組成進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)膠原肽中氨基酸種類豐富，利用價(jià)值高。該研究有望減少金槍魚骨資源的浪費(fèi)，為使用動(dòng)物蛋白酶水解金槍魚骨獲得骨膠原肽提供參考，為進(jìn)一步充分開發(fā)利用金槍魚骨膠原肽提供了理論和試驗(yàn)基礎(chǔ)。