沈彬，王懿椿，張瑜，尚逢實(shí)，杜曉梅，王曉丹，王華麗，王浩*

（1.中科蘭丁（天津）自然醫(yī)學(xué)研究院，天津 300308；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.國(guó)家風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 100022）

衰老是一種不可避免的生理現(xiàn)象，它會(huì)導(dǎo)致人類器官功能逐漸下降?！八ダ系淖杂苫碚摗钡玫搅嗽S多研究的支持[1]。據(jù)報(bào)道，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是導(dǎo)致衰老的主要因素之一[2]。在生物體中，維持適當(dāng)水平的ROS 是維持氧化還原穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。在一個(gè)健康的狀態(tài)下，自由基被用來清除衰老的細(xì)胞，清理或控制突變的細(xì)胞，從而使身體處于一個(gè)和諧有序的狀態(tài)[3]。然而，過量的過氧化物和自由基引起的氧化應(yīng)激可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，導(dǎo)致許多疾病發(fā)生，從而加速衰老。隨著年齡的增長(zhǎng)，內(nèi)源性抗氧化酶活性降低，導(dǎo)致抗氧化防御系統(tǒng)的功能降低，自由基損傷增加，進(jìn)而衰老[4]。

迷迭香是唇形科迷迭香屬植物，產(chǎn)地在地中海沿岸，具有長(zhǎng)遠(yuǎn)的發(fā)展歷史[5]。迷迭香提取物（rosemary extract，RE）具有良好的抗氧化、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫功能和改善脂質(zhì)代謝等多種生物學(xué)功能，是替代抗生素的潛在產(chǎn)品[6]。許多報(bào)道顯示RE 中有鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸等多種活性物質(zhì)[7]。前期試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)1.5 mg/mL RE 對(duì)雌雄果蠅都有一定的抗氧化作用，并且可以有效延緩高脂導(dǎo)致的氧化損傷從而進(jìn)一步延緩衰老[8-10]。黑腹果蠅作為一種經(jīng)典的模式生物，其衰老基因與代謝途徑與人類非常相似[11]。研究發(fā)現(xiàn)雌性果蠅的雌激素含量高，而且腸道發(fā)育的敏感性要比雄性果蠅強(qiáng)[12]，所以選擇雌性果蠅作為模型研究腸道。

在分子水平上，人體的衰老與胰島素通路密切相關(guān)，胰島素途徑是一個(gè)高度保守的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，調(diào)控生命周期[13]。Akt 作為胰島素通路和雷帕霉素通路之間的樞紐，被胰島素生長(zhǎng)因子激活，抑制mTOR 負(fù)調(diào)控因子TSC2 的活性和TSC1 的活性，從而減少自噬調(diào)控，加速衰老[14]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)自噬可以調(diào)節(jié)腸道干細(xì)胞（intestinal stem cells，ISCs）的增殖以及腸道屏障功能障礙，以維持腸道穩(wěn)態(tài)，減少由腸道失衡引起的疾病[15]。

近年來，RE 的抗氧化活性已被廣泛報(bào)道，但其在mTOR 和自噬通路中調(diào)控壽命的機(jī)制研究較少。因此，本論文研究了RE 對(duì)雌性果蠅的抗氧化作用，及其對(duì)雌性果蠅衰老過程腸道功能的調(diào)節(jié)作用和潛在的分子機(jī)制，為RE 產(chǎn)品的開發(fā)和進(jìn)一步探索提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RE：天津尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司；野生型果蠅W1118：天津科技大學(xué)食品添加劑與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控研究室提供；Esg-Gal4 UAS-GFP 轉(zhuǎn)基因型果蠅（該品系果蠅特異性的攜帶標(biāo)記果蠅腸道前體細(xì)胞綠色熒光蛋白）：東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供；過氧化氫、非消化染料（FD&C blue NO.1）、Trizol 試劑、SYBR Green染料、Lyso-Tracker Red 熒光探針：美國(guó)Sigma 公司。

cDNA（complementary DNA）反轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國(guó)Sigma 公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、銅鋅超氧化物歧化酶（Cu/Zn-superoxide dismutase，Cu/Zn-SOD）、錳超氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，Mn-SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒：南京建成試劑公司。乳酸桿菌瓊脂、胰蛋白胨、酵母浸粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂、甘露醇、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（均為分析純）：北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司。所需基因引物由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司設(shè)計(jì)。

1.2 儀器與設(shè)備

OLYMPUSU-RFLT50 型熒光顯微鏡：日本Olympus公司；G：box 凝膠圖像采集分析系統(tǒng)：英國(guó)Syngene 公司；BIO-RAD 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：北京元業(yè)伯樂科技發(fā)展有限公司；Thermo Finnigan Surveyor 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）：美國(guó)Thermo Finnigan公司；SMZ-140 酶標(biāo)儀：麥克奧迪（廈門）電氣股份有限公司；玻璃勻漿器：安徽韋斯實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 RE 的成分分析

采用Thermo Finnigan Surveyor LC-MS 系統(tǒng)，配備光電二極管陣列檢測(cè)器和Venusil XBP C18柱（2.1 mm×150 mm）對(duì)迷迭香提取物中的成分進(jìn)行測(cè)定。流速0.2 mL/min、檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm、烘箱溫度30 ℃。流動(dòng)相為0.1%A 相（甲酸）和B 相（乙腈）。梯度洗脫程序：10%B 0～5 min；20%B 40 min～45 min；90%B：45 min～55 min；最后用10%B 浸泡55.1 min～60.0 min。采用電噴霧電離源（electron spray ionization，ESI）進(jìn)行正電離模式下的質(zhì)譜分析。ESI 噴霧電壓為4.5 kV，毛細(xì)管電壓為-10 V，毛細(xì)管溫度為275 ℃，氮?dú)猓∟2）流量為30 arb，輔助氣流量為5 arb。全掃描模式下分子量范圍為100～500 m/z。

1.4 果蠅培養(yǎng)基的配制

果蠅基礎(chǔ)培養(yǎng)基（750 mL）：蒸餾水（750 mL）、玉米粉（72 g）、無(wú)水葡萄糖（72 g）、酵母粉（10 g）、瓊脂粉（6 g）、防腐劑（40 mL）（1%對(duì)羥基苯甲酸乙酯）[16]。果蠅實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加RE（0.2、0.5、1.5 mg/mL）配制而成。

1.5 壽命實(shí)驗(yàn)

2 d 未交配的野生型果蠅W1118被分為4 組，每組各200 只。一組基礎(chǔ)飲食為對(duì)照組，另3 組分別為0.2、0.5、1.5 mg/mL RE 實(shí)驗(yàn)組。每3 d 更換一次培養(yǎng)基，并記錄存活只數(shù)。最大壽命計(jì)算為10%最長(zhǎng)存活時(shí)間[17]。

1.6 攝食量和體重實(shí)驗(yàn)

收集羽化后2 d 的野生型果蠅W1118，隨機(jī)分成4組，每組200 只，果蠅培養(yǎng)如1.5 果蠅壽命培養(yǎng)方法。攝食量測(cè)定實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)4 d，先轉(zhuǎn)移到含有用蒸餾水浸濕的濾紙條的空管中，饑餓2 h，然后轉(zhuǎn)移到含有0.2%羅丹明B 磺酸鈉鹽的飲食中2 h。采用雙盲法主觀評(píng)分0（無(wú)色腹部）到5（完全紅色腹部）測(cè)量紅色腹部的程度，以紅色程度作為每只果蠅的食物攝入量指標(biāo)[17]。體重實(shí)驗(yàn)：體重變化也被認(rèn)為是食物攝入量的一個(gè)指標(biāo)。在飼養(yǎng)第20 天，用CO2麻醉果蠅，然后稱量并計(jì)算果蠅平均體重[18]。

1.7 攀爬實(shí)驗(yàn)

用RE（0.2、0.5、1.5 mg/mL）或?qū)φ仗幚淼暮诟构壴?、15、30、45 d 轉(zhuǎn)移到空管中，計(jì)時(shí)統(tǒng)計(jì)20 s 內(nèi)爬升超過7 cm 的果蠅的數(shù)量。實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次[18]。

1.8 應(yīng)激損傷實(shí)驗(yàn)

收集羽化后2 d 的野生型果蠅W1118，隨機(jī)分成4 組，每組200 只。RE（0.2、0.5、1.5 mg/mL）或?qū)φ仗幚碇?5 d 時(shí)將果蠅饑餓2 h，然后轉(zhuǎn)移到新的小瓶中，其中含浸有1 mL 飽和30%過氧化氫（H2O2）或含20 mmol/L百草枯的6%葡萄糖溶液的濾紙條。每2 h 計(jì)數(shù)一次存活只數(shù)，直到果蠅全部死亡，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次[9]。

1.9 “藍(lán)精靈”實(shí)驗(yàn)

收集羽化后2 d 的野生型果蠅W1118，隨機(jī)分成4組，每組200 只，果蠅培養(yǎng)如1.5 果蠅壽命培養(yǎng)方法。第20 天和第50 天，對(duì)照組果蠅在不添加RE 且含有2.5%藍(lán)色染料的培養(yǎng)基中喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組果蠅在添加不同濃度RE 且含有2.5%藍(lán)色染料的培養(yǎng)基中喂養(yǎng)。饑餓2 h 后，喂食藍(lán)色染料9 h，之后用CO2迷暈，并在顯微鏡下觀察其腹部狀態(tài)，統(tǒng)計(jì)“藍(lán)精靈”的數(shù)量[17]。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.10 腸道菌落總數(shù)測(cè)定

乳酸桿菌（Lactobacilli，LMRS）選擇性培養(yǎng)基：70 g/L 乳酸桿菌瓊脂；腸桿菌（Enterobacteria，ENT）選擇性培養(yǎng)基：10 g/L 胰蛋白胨、1.5 g/L 酵母浸粉、10 g/L葡萄糖、5 g/L 氯化鈉、12 g/L 瓊脂；醋酸桿菌（Acetobacteria，ACE）選擇性培養(yǎng)基：25 g/L 甘露醇、5 g/L 酵母浸粉、3 g/L 胰蛋白胨、15 g/L 瓊脂；營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（nutrient rich medium，NR）：23 g/L 營(yíng)養(yǎng)瓊脂。

收集羽化后2 d 的野生型果蠅W1118，隨機(jī)分成4組，每組200 只，果蠅培養(yǎng)如1.5 果蠅壽命培養(yǎng)方法。飼養(yǎng)到20、50 d 時(shí)，禁食2 h，用CO2麻醉后，在顯微鏡下用解剖針取出中腸（n=10），置于1 mL 磷酸鹽緩沖液（pH6）中，然后用玻璃勻漿器研磨并稀釋，取0.1 mL稀釋液，分別涂布在腸桿菌（ENT）、乳酸菌（LMRS）、醋酸桿菌（ACE）的選擇培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（NR），采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算腸道菌落總數(shù)[16]。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.11 熒光染色和熒光顯微鏡觀察

Esg-Gal UAS-GFP 果蠅以RE（0.2、0.5、1.5 mg/mL）或?qū)φ诊暳吓囵B(yǎng)20 d 或50 d 后，解剖出中腸，在倒置熒光顯微鏡下觀察熒光點(diǎn)。在熒光染色實(shí)驗(yàn)中，RE 或普通飼料喂養(yǎng)果蠅20 d 后，在磷酸鹽緩沖液中解剖取腸道，用1μmol/L Lyso-Tracker Red 熒光染色液染色3min；用磷酸鹽緩沖液（pH6）清洗，4%甲醛溶液固定30 min，之后用70%甘油封片。使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行觀察[19]。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.12 抗氧化酶活性和脂質(zhì)過氧化物含量測(cè)定

收集羽化后2 d 的野生型果蠅W111（8n=200），按照1.5 中的果蠅壽命培養(yǎng)方法培養(yǎng)。將果蠅連續(xù)培養(yǎng)45 d，饑餓2 h，稱重，按體重與生理鹽水1 ∶9（mg/mL）勻漿并稀釋，取上清液，按照SOD、CAT、MDA 試劑盒方法測(cè)定SOD、CAT 的酶活性和MDA 的含量[20]。

1.13 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)

用RE（0.2、0.5、1.5 mg/mL）或?qū)φ诊嬍澄故彻?5 d，在液氮中研磨。總RNA 采用TRizol 提取，采用cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒構(gòu)建cDNA。根據(jù)循環(huán)閾值（cycle threshold，CT）值計(jì)算基因表達(dá)量。每個(gè)基因擴(kuò)增的引物信息見表1（以RP49 為內(nèi)參基因）。

表1 引物檢測(cè)果蠅基因PCR 引物Table 1 PCR primers used for the measurement of genes mRNA expression in Drosophila melanogaster

1.14 統(tǒng)計(jì)分析

使用Origin 2021 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。生存實(shí)驗(yàn)采用SPSS 17.0 軟件的Kaplan-Meier 分析，采用log-rank 檢驗(yàn)分析組間顯著差異。采用單因素方差分析法評(píng)估均數(shù)間差異的顯著性。采用ImageJ 軟件分析熒光水平。P＜0.05 表示差異顯著，而P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 RE 的組成

采用LC-MS 分析鑒定RE 中的活性成分，結(jié)果見表2。

表2 RE 中的主要活性成分Table 2 Main active ingredients in RE

通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀共分離鑒定出5 種不同的化合物，如表2 所示，分別為鼠尾草酚、鼠尾草酸、迷迭香酚、迷迭香酸、鼠尾草酸甲酯。

2.2 RE 對(duì)果蠅壽命的影響

RE 對(duì)雌性果蠅壽命的影響見表3。

表3 RE 對(duì)雌性果蠅平均壽命和最大壽命的影響（±s）Table 3 Effects of RE on average lifespan and maximum lifespan of female drosophila（±s）

表3 RE 對(duì)雌性果蠅平均壽命和最大壽命的影響（±s）Table 3 Effects of RE on average lifespan and maximum lifespan of female drosophila（±s）

注：*表示和對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

組別 RE/（mg/mL） 平均壽命/d 最大壽命/d對(duì)照組 0 60.46±1.32 84.56±1.40實(shí)驗(yàn)組 0.2 62.42±1.27 87.18±2.46 0.5 65.84±1.57 91.64±1.51*1.5 70.14±1.45* 95.84±3.10*

隨著身體的自我調(diào)節(jié)能力和功能的降低[21]，衰老過程中往往伴隨著機(jī)體對(duì)外部壓力適應(yīng)性或抵抗力的降低[3]。如表3 所示，與對(duì)照組相比，1.5 mg/mL RE 組平均壽命從60 d 延長(zhǎng)到70 d，延長(zhǎng)了16.67%（P＜0.05）；1.5 mg/mL RE 組最大壽命從84 d 延長(zhǎng)到95 d，延長(zhǎng)了13.10%（P＜0.05）。RE 對(duì)雌性果蠅的壽命延長(zhǎng)有劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。因此，認(rèn)為RE 具有延緩衰老的效果。

2.3 RE 對(duì)果蠅進(jìn)食量和體重的影響

RE 對(duì)雌性果蠅攝食量和體重的影響見圖1 和表4。

圖1 RE 對(duì)雌性果蠅攝食量的影響Fig.1 Effect of RE on food intake of female drosophila

表4 RE 對(duì)雌性果蠅體重的影響（±s）Table 4 Effects of RE on body weight of female drosophila（±s）

表4 RE 對(duì)雌性果蠅體重的影響（±s）Table 4 Effects of RE on body weight of female drosophila（±s）

組別 RE/（mg/mL） 體重/μg對(duì)照組 0 1 124.83±11.19實(shí)驗(yàn)組 0.2 1 119.47±25.21 0.5 1 123.45±23.25 1.5 1 117.01±25.35

飲食限制在之前的報(bào)道中被認(rèn)為有延長(zhǎng)壽命的效果[22]，本研究為了排除飲食限制對(duì)壽命的影響，根據(jù)1.6 描述的方法測(cè)量了果蠅的體重和攝食量。由表4 可知，雌性果蠅喂食RE 之后，平均體重與對(duì)照組相比，無(wú)明顯差異；通過測(cè)量攝食量發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組雌性果蠅的攝食量無(wú)明顯差異（圖1）。

2.4 RE 對(duì)果蠅爬行能力的影響

隨著機(jī)體的衰老，生理功能和自我調(diào)節(jié)能力逐漸減弱，爬行能力間接反映了機(jī)體的健康狀況和衰老程度[19]。RE 對(duì)雌性果蠅爬行能力的影響見圖2。

圖2 RE 對(duì)雌性果蠅爬行能力的影響Fig.2 Effects of RE on the crawling ability of female drosophila

由圖2 可知，添加RE 的果蠅爬行能力以劑量依賴的方式增加，1.5 mg/mL RE 處理組的平均爬行百分比比對(duì)照組顯著增加了18.25%（P＜0.05）。在給予RE之后，果蠅的爬行能力明顯被改善，在第30 天和第45 天時(shí)，1.5 mg/mL RE 組的平均爬行百分比分別提高了33%和28%。以上結(jié)果顯示，RE 可以改善果蠅的爬行能力、增強(qiáng)機(jī)體調(diào)節(jié)能力。

2.5 RE 對(duì)果蠅抵抗氧化應(yīng)激能力的影響

RE 對(duì)雌性果蠅百草枯和過氧化氫應(yīng)激的影響見圖3。

圖3 RE 對(duì)雌性果蠅百草枯和過氧化氫應(yīng)激的影響Fig.3 Effects of RE on paraquat and H2O2 stress in female drosophila

在不同的生物模型中，壽命與壓力耐受性的增加密切相關(guān)[23]。正常代謝或環(huán)境應(yīng)激下的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生ROS，打破細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，加速衰老。細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性抗氧化酶如SOD 和CAT，可以維持ROS的平衡。由圖3 A 可知，0.5、1.5 mg/mL RE 可延長(zhǎng)果蠅的最大壽命。與對(duì)照組相比，1.5 mg/mL RE 平均壽命顯著增加了26.32%（P＜0.05）。由圖3 B 可知，與對(duì)照組相比，0.5 mg/mL 和1.5 mg/mL RE 處理組分別延長(zhǎng)最大壽命20.01%和50.20%（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，RE 對(duì)H2O2和百草枯誘導(dǎo)的氧化損傷具有保護(hù)作用。

2.6 RE 對(duì)腸道微生物的影響

RE 對(duì)雌性果蠅腸道微生物的影響見圖4。

圖4 RE 對(duì)雌性果蠅腸道微生物的影響Fig.4 Effects of RE on intestinal microbiota of female Drosophila melanogaster

隨著機(jī)體年齡的增長(zhǎng)，調(diào)節(jié)能力減弱，腸道微生物群結(jié)構(gòu)不平衡，發(fā)生腸道屏障功能障礙，自由基積累[24]。近年來，腸道穩(wěn)態(tài)被證明在決定果蠅的壽命方面起著重要作用[25]。由圖4 可知，飼喂RE 20 d 后，與對(duì)照組相比，RE 組的LMRS、ENT、ACE、NR 均無(wú)明顯差異。給予RE 50 d 后，與對(duì)照組相比，腸道內(nèi)微生物數(shù)量顯著減少（P＜0.05）。其中雌性果蠅干預(yù)RE 的濃度為1.5 mg/mL 時(shí)，與對(duì)照組比較，LMRS、ENT、ACE、NR 分別下調(diào)了15.56%、14.62%、28.31%和13.27%（P＜0.05）。結(jié)果表明，RE 能夠維持年老雌性果蠅腸道微生物平衡，抑制衰老導(dǎo)致的腸道微生物異常增殖。

RE 對(duì)果蠅腸道屏障功能的影響見圖5。

圖5 RE 對(duì)果蠅腸道屏障功能的影響Fig.5 Effects of RE on intestinal barrier function in Drosophila melanogaster

在衰老過程中，生理調(diào)節(jié)功能的下降會(huì)導(dǎo)致屏障功能的降低、腸道完整性的降低和通透性的增加。腸道穩(wěn)態(tài)是決定果蠅壽命的因素之一。用一種非消化染料（FD&C blue NO.1）喂養(yǎng)果蠅，以觀察腸道組織的老化情況。如圖5 A 所示，20 d 齡的果蠅喂食藍(lán)色染料后，染料僅存在于前列腺和消化道。然而，50 d 齡的果蠅中藍(lán)色染料在全身清晰可見。這種全身藍(lán)色的果蠅即為“藍(lán)精靈”，通過計(jì)數(shù)“藍(lán)精靈”在整體樣本中所占的比例來反映果蠅的腸道老化程度，進(jìn)一步反映其衰老程度。在圖5 B 中，隨著年齡的增長(zhǎng)，對(duì)照組的“藍(lán)精靈”百分比增加，然而在50 d，與對(duì)照組相比，RE 處理的實(shí)驗(yàn)組中藍(lán)精靈數(shù)量在減少，1.5 mg/mL RE 組減少了22.86%（P＜0.05）。因此，RE 可通過改善果蠅的腸道通透性而保護(hù)腸道完整性。

2.7 RE 對(duì)ISCs 增殖的影響

RE 對(duì)雌性果蠅腸道干細(xì)胞增殖的影響見圖6 和圖7。

圖6 RE 對(duì)雌性果蠅20 d 和50 d 時(shí)腸道干細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effect of RE on intestinal stem cell proliferation of female drosophila at day 20 and 50

圖7 果蠅腸道干細(xì)胞熒光強(qiáng)度定量圖Fig.7 Quantitative fluorescence intensity of intestinal stem cells in drosophila

逐漸衰老果蠅的腸道屏障功能的喪失已被發(fā)現(xiàn)與果蠅的基因型和環(huán)境條件相關(guān)。在果蠅中腸組織穩(wěn)態(tài)由沿著基底膜分布的多能ISCs 維持[26]。隨著果蠅的衰老，果蠅中腸上皮細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)再生機(jī)制，加速干細(xì)胞增殖，來維持受損細(xì)胞，但也會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致干細(xì)胞異常增殖[27]。GFP 陽(yáng)性細(xì)胞可以顯示ISCs 的增殖率，因?yàn)閑sg 在ISCs 和腸細(xì)胞中特異性表達(dá)[28]。因此，本文檢測(cè)了果蠅中腸中esg 的表達(dá)情況。圖7 顯示20d 時(shí)對(duì)照組和RE 組的增殖均保持正常，無(wú)顯著性差異（P ＞0.05）。隨著年齡的增長(zhǎng)，ISCs 的增殖顯著增加。由圖7 可知，在老年果蠅（50 d）中，與對(duì)照組相比，1.5 mg/mL RE 處理組的esg 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量顯著減少了35.89%（P ＜0.05）。

2.8 RE 對(duì)果蠅抗氧化參數(shù)的影響

RE 對(duì)總SOD、Cu-Zn-SOD、CAT 活力和MDA 含量的影響見表5。RE 對(duì)果蠅抗氧化基因表達(dá)量的影響見圖8。

表5 RE 對(duì)總SOD、Cu-Zn-SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響（±s）Table 5 Effects of RE on total SOD，Cu-Zn-SOD，CAT activity and MDA content（±s）

表5 RE 對(duì)總SOD、Cu-Zn-SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響（±s）Table 5 Effects of RE on total SOD，Cu-Zn-SOD，CAT activity and MDA content（±s）

注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。

MDA/（nmol/mg pro）對(duì)照組 0 205.53±12.35 92.50±9.48 41.24±3.54 1.17±0.05實(shí)驗(yàn)組 0.2 213.99±12.20 96.14±9.68 42.57±4.02 0.87±0.07 0.5 234.35±11.25 103.21±8.52 48.25±3.93* 0.65±0.02*1.5 241.94±15.24* 106.98±8.81* 53.29±4.25* 0.58±0.07*組別 RE/（mg/mL）Cu-Zn-SOD/（U/mg pro）Mn-SOD/（U/mg pro）CAT/（U/mg pro）

圖8 RE 對(duì)果蠅抗氧化基因表達(dá)量的影響Fig.8 Effects of RE on the expression of antioxidant genes in Drosophila melanogaster

由 表5 可 知，0.5 mg/mL RE 組Cu-Zn-SOD 和Mn-SOD 活性分別提高了14.02%和11.57%（P＜0.05），1.5 mg/mL RE 組Cu-Zn-SOD 和Mn-SOD 活性分別提高了和17.71%和15.65%（P＜0.05）。同樣，與對(duì)照組相比，RE 組的CAT 活性分別增加了3.22%、16.99%和29.22%。此外，0.5、1.5 mg/mL RE 組果蠅的MDA 含量分別顯著降低44.44%和50.42%（P＜0.05）。如圖8 所示，RE 組的Cu-Zn-SOD（P＜0.05）和Mn-SOD（P＜0.05）的mRNA 表達(dá)水平高于對(duì)照組。與對(duì)照組相比，1.5 mg/mL 組的CAT 基因表達(dá)顯著增加（P＜0.05）。同時(shí)，1.5 mg/mLRE組MTH 基因表達(dá)有所降低。結(jié)果表明，RE 不僅能增加與衰老相關(guān)的抗氧化酶的活性，而且能提高其mRNA的表達(dá)水平。

2.9 分子機(jī)制

RE 對(duì)雌性果蠅溶酶體熒光強(qiáng)度的影響及定量結(jié)果見圖9，RE 對(duì)胰島素通路和自噬基因的影響見圖10。

圖9 RE 對(duì)雌性果蠅溶酶體熒光強(qiáng)度的影響及定量結(jié)果Fig.9 Effect of RE on fluorescence intensity of lysosome and the number of lysosomes in female drosophila

圖10 RE 對(duì)胰島素通路和自噬基因的影響Fig.10 Effects of RE on insulin pathway and autophagy gene

自噬是代謝穩(wěn)態(tài)的強(qiáng)大啟動(dòng)子，通過降解脂質(zhì)過氧化、受損細(xì)胞器和病原體來維持穩(wěn)態(tài)并防止退行性疾病[29]。自噬可調(diào)節(jié)腸道屏障防御、防止腸道菌群失衡，并在維持腸道穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮特定的作用[30]。為了研究RE 延長(zhǎng)果蠅壽命的作用是否與激活自噬有關(guān)，通過溶酶體染色分析了RE 處理是否會(huì)導(dǎo)致自噬體和溶酶體的增加。研究發(fā)現(xiàn)，RE 處理之后腸道中自噬小體以劑量依賴性的方式增加（圖9）。Real-time PCR 結(jié)果顯示，1.5 mg/mL RE 處 理 后，Atg-1、Atg-5、Atg-8a 和Atg-8b 等自噬相關(guān)基因分別增加了67.21%、43.16%、53.23%（P＜0.01）和45.07%（P＜0.05）（圖10）。因此，以上結(jié)果表明RE 激活了自噬途徑。

在線蟲、果蠅和哺乳動(dòng)物中，抑制胰島素途徑中與衰老密切相關(guān)的關(guān)鍵基因或蛋白可以有效延長(zhǎng)壽命[31]。如圖10 所示，用1.5 mg/mL RE 處理果蠅后，PI3k、Akt-1 和mTOR 的mRNA 表達(dá)水平分別降低了16.04%、52.14%和40.07%，表明RE 可能通過胰島素信號(hào)通路調(diào)控壽命。

3 結(jié)論

添加一定劑量的RE 可以顯著延長(zhǎng)雌性果蠅壽命，減緩因衰老導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)能力的下降，增強(qiáng)抗應(yīng)激能力，減少了衰老引起的腸道屏障功能障礙和腸道菌群失衡，抑制腸道前體細(xì)胞的異常增殖，維持腸道穩(wěn)態(tài)。RE 治療延長(zhǎng)生命的可能機(jī)制是通過抑制胰島素通路和激活雷帕霉素通路因子mTOR 來激活自噬通路，改善抗氧化能力和腸道失衡。研究結(jié)果為迷迭香功能產(chǎn)品的后續(xù)開發(fā)和應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，但其確切機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步探索。