馮勇 ,任政偉

(1.重慶商務職業(yè)學院 馮勇中式烹調技能大師工作室,重慶 401331；2.四川旅游學院 烹飪與食品實驗管理中心,成都 610100)

草果屬于姜科豆蔻屬多年生草本植物，主要分布于東南亞熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。在我國，大約有30多個該屬物種，該屬的大部分物種都可以作為食物或藥物被使用[3]，特別是在云南地區(qū)，草果作為當地重要的經濟作物被栽培[4-5]。2020年，草果入選了云南省十大名藥材，此外，草果也是重要的藥食同源植物，被稱為五大香料之一，還被應用在治療消化系統(tǒng)疾病的藥物中[6]。

近代研究結果表明，草果中具有多種生物活性物質，這些物質具有抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤、降血糖、降血脂等多種生物活性功能[7]。

微生物多樣性與草果的品質關系密切，了解草果儲藏過程中微生物多樣性和微生物的群落結構[8]，是保障草果品質的關鍵措施。在草果儲藏過程中，國內外對于倉庫中的微生物多樣性變化相關的研究報道較少[9]。

草果采摘主要在山區(qū)，交通不便，故大部分干品草果被保存在當地[10]。由于在不同的倉庫中，引起草果品質變化的因素眾多，因此草果的品質存在著較大差異。本研究基于此，采用抽樣調查的方式，利用宏基因組對樣本中的微生物多樣性進行研究，同時對不同儲藏時間草果中的生物活性酶進行測定，旨在為草果的倉庫儲藏提供一些理論依據，同時也為草果產業(yè)的發(fā)展奠定一些基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

1.1.1 草果儲藏倉庫的選擇

草果儲藏的3個倉庫：1號倉庫位于云南昆明；2號倉庫位于云南貢山彝族自治州；3號倉庫位于云南西雙版納。

1.1.2 草果樣品

在2018年12月-2021年12月期間，分別從3個倉庫中取樣13次。采用高通量測序技術對所有的草果樣品進行測序分析。

1.1.3 試驗試劑

牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、氯化鈉、可溶性淀粉、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、硫酸鎂、蛋白胨、葡萄糖、馬鈴薯、Ezup柱式真菌基因組DNA提取試劑盒和Ezup柱式細菌基因組DNA提取試劑盒。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物菌落的統(tǒng)計和分析

將每一個平板中的微生物多樣性和數量進行統(tǒng)計，計算出所有采樣地點中的菌落種類和平均菌落數，結果以每個立方中菌落的種類或者每個立方中菌落的數量進行統(tǒng)計，最后根據標本采集時間，分析生物豐富度與微生物多樣性隨著儲藏時間的延長產生的動態(tài)變化[11-12]。

1.2.2 微生物的群落結構分析

利用分子生物學方法，對草果儲藏倉庫中的優(yōu)勢微生物種類進行鑒定和分析，初步對倉庫中的微生物群落結構組成進行研究[13]。分別按照純化菌落，進行DNA提取、PCR擴增、序列比對和物種的鑒定，最后對數據進行分析和鑒定[14]。

1.2.3 草果中生物活性酶的測定

1.2.3.1 中性蛋白酶活性

根據商業(yè)標準SB/T 10317—1999對草果中的中性蛋白酶活性進行測定，稱取1 g草果樣品，在40 ℃和pH為7.5的條件下制作待測酶液。待測溶液中含有酚基的氨基酸與福林試劑接觸，產生藍色反應，顏色的深淺與溶液中的氨基酸含量成正比。在波長680 nm處測定其吸光值，從而計算中性蛋白酶的活性[15]。

1.2.3.2 淀粉酶活性

根據國家標準GB/T 24401—2009中的方法，稱取1 g草果樣品，制作待測酶液，在70 ℃條件下水浴15 min，添加3,5-二硝基水楊酸，與淀粉溶液進行充分的化學反應，之后在波長540 nm處測定其吸光值，從而計算淀粉酶活性[16-17]。

1.2.3.3 果膠酶活性

根據輕工業(yè)行業(yè)標準標準QB 1502—1992中的方法，稱取1 g草果樣品，制作待測酶液，在50 ℃的條件下與果膠發(fā)生化學反應，并與DNS試劑作用，在波長540 nm處測定其吸光值，并計算果膠酶活力。

1.2.3.4 纖維素酶活性

根據輕工業(yè)行業(yè)標準標準QB 2583—2003中的方法，稱取1 g草果樣品，制作待測酶液，在37 ℃的條件下水浴，與葡萄糖溶液發(fā)生生化反應，之后與DNS試劑作用，并在波長540 nm處測定其吸光值，計算纖維素酶活力[18]。

2 結果與討論

2.1 倉儲環(huán)境空氣中可培養(yǎng)微生物的采集

在2018-2021年期間分別對云南地區(qū)3個儲藏草果的倉庫中的微生物多樣性進行分析，3個草果儲藏倉庫中微生物多樣性見表1。對環(huán)境中的微生物進行13次調查分析，表1中的微生物數量均為13次測量的平均值。

表1 3個草果倉庫中微生物多樣性分析Table 1 Microbial diversity analysis in three warehouses of Amomum tsao-ko

對3個儲藏草果的倉庫中的微生物多樣性進行檢測。由表1可知，3號倉庫的微生物總量明顯多于其他兩個倉庫，3號倉庫中的微生物總量分別約為1號倉庫和2號倉庫的11倍和13.7倍，另外，3號倉庫細菌數量比真菌和放線菌數量相對多些。而1號和2號倉庫真菌數量比細菌和放線菌數量多。3號倉庫細菌數量多，為2781.2 CFU/m3，真菌為2671.2 CFU/m3，放線菌數量為2081.2 CFU/m3。這是由于3號倉庫所處的地理位置潮濕，微生物更加容易繁殖。

2.2 倉儲環(huán)境中可培養(yǎng)微生物多樣性分析

由表1數據對3個倉庫中微生物在Shannon-Wiener多樣性指數和Simpson多樣性指數分析發(fā)現，3號倉庫空氣中微生物的Shannon-Wiener指數和Simpson指數明顯高于其他兩個倉庫，分別達到了1.15，0.98，表明3號倉庫中的物種豐富度更高。其次是1號倉庫，Shannon-Wiener指數是1.10，Simpson指數是0.91。2號倉庫的Shannon-Wiener指數、Simpson指數最低，分別是0.81，0.68。

2.3 倉儲環(huán)境空氣中可培養(yǎng)微生物動態(tài)變化

在2018年12月—2021年12月期間，對3個倉庫中的微生物多樣性進行分析，草果陳化時間越長，3個倉庫中微生物表現得越穩(wěn)定。由于倉庫屬于密封的情況，倉庫中的微生物數量基本不受季節(jié)變化的影響，沒有明顯的演替現象，為草果的保存提供了穩(wěn)定的微生物環(huán)境[19]。

由圖1可知，3個倉庫中微生物的豐富度和數量均存在一定程度的差異。從微生物的數量圖來看，在1號倉庫中，真菌的變化最為明顯，其次是細菌，變化最小的是放線菌的數量。從整體來看，1號倉庫中的真菌物種數量明顯多于細菌和放線菌。1號倉庫中的真菌、細菌和放線菌物種多樣性差異不大。真菌和細菌的物種數量基本一致，但是多于放線菌。在2號倉庫中，細菌和真菌的數量多于放線菌。但在2021年4月，檢測的結果表明，放線菌的數量多于細菌和真菌，這是由于一批草果在4月份從外面進入倉庫，倉庫中的放線菌數量增多，隨著時間的增長逐漸趨于平緩。在2020年12月以前，2號倉庫中的放線菌微生物數量較低，而真菌和細菌的物種數量基本一致，并沒有明顯的變化。3號倉庫中的微生物數量變化較大，不同的采樣時間，微生物的多樣性變化也很明顯。針對3號倉庫而言，不同的采樣時間，微生物數量的差異較為明顯。3號倉庫中的微生物種類隨著時間的變化并無明顯差異，但有兩次采樣微生物中的細菌數量明顯多于真菌和放線菌。

在3個不同的倉庫中，1號倉庫和2號倉庫中的微生物數量或微生物種類差異都不明顯。在3號倉庫中，無論是微生物數量，還是微生物種類，都明顯多于其他兩個倉庫。這是由于3號倉庫位于云南西雙版納，具有高溫高濕的氣候條件，其倉庫中微生物數量明顯多于其他倉庫。

2.4 草果中真菌多樣性及群落結構分析結果

2.4.1 草果樣本中的序列優(yōu)化

采用宏基因組測序后，在18個樣品中一共獲得1437842條ITS的原始序列，每個樣品中獲得的原始序列范圍大致為75012～82913條。經過數據拼接和數據庫比對，每個樣品中的有效序列為70149～80123條。樣品中有效序列的有效利用率范圍為93.18%～98.76%。

表2 3個草果儲藏倉庫中的真菌多樣性分析Table 2 Analysis of fungal diversity in the three Amomum tsao-ko storage warehouses

2.4.2 3個草果倉庫中真菌群落組成及變化

從3個草果倉庫的不同樣品中一共分離出4個門，20個綱，38個科，100個屬和200個種，見表3。

表3 3個草果倉庫真菌群落的組成Table 3 Composition of fungal community in the three Amomum tsao-ko warehouses

續(xù) 表

由表3可知，3個倉庫中的微生物在門、綱、目、科4個級別上差異較小，在種的級別上差異最大。1號和3號倉庫中，不同的樣本之間物種多樣性差異較大。2號倉庫中的物種多樣性差異較小。這可能是由于隨機取樣時，樣品沒有被徹底干燥[20]。

2.5 草果中的優(yōu)勢微生物群落與生物酶活性

由圖2可知，3個倉庫中生物酶活性變量基本一致。蛋白酶活性和果膠酶活性都隨著草果的存放時間增長而逐漸降低，3個倉庫中淀粉酶活性最強的是倉儲18個月，纖維素酶活性最強的是倉儲24個月。4種生物活性酶在3個儲藏倉庫中儲藏相同的時間，活性酶的含量均不相同。從整體的結果來看，3號倉庫中草果的生物活性酶要強于其他兩個倉庫中草果的生物活性酶，說明豐富微生物多樣性對草果中的生物活性酶具有一定的影響。

3 小結

在自然的條件下，草果在倉庫中儲藏，其成分和生物酶活性會發(fā)生改變，而在草果的儲藏過程中，微生物因子對草果本身的品質影響至關重要。一方面，微生物的活動使草果中大分子物質分解，從而容易被吸收和利用；另一方面，長時間儲藏也會造成草果中的生物酶活性降低，從而影響草果中活性物質的生物活性功能。

研究結果表明，不同倉儲草果的倉庫中，微生物的多樣性不同，儲藏地一定程度上會對草果的活性物質產生影響。由于儲藏物都為草果，所以3個草果儲藏倉庫中的微生物種類基本一致。