劉子瑄,孔馨逸,陳璐,江大海
(1.西京學院 醫(yī)學院,西安 710123;2.陜西省農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,西安 710016;3.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,陜西 咸陽 712000)
漢麻屬中的火麻仁成熟的果實是著名的藥食同源的保健食品,主要分布于我國廣西西部、云南南部、新疆等地[1-2]。漢麻籽油是能夠溶解于水中的油料,在所有的植物中,其不飽和脂肪酸的含量較高,是目前發(fā)現(xiàn)的較為有效的抗衰老和抗輻射的油脂[3];漢麻籽中含有豐富的蛋白質(zhì)和人體必需的氨基酸,可以用于食品和保健[4]。
漢麻主要用于紡織業(yè)、藥物和食物3個方面,漢麻的皮含有豐富的纖維,是制作衣服或者其他布料加工的材料,漢麻籽含有人體所需的各種氨基酸,常被加工成為漢麻相關(guān)的產(chǎn)品[5]。
漢麻葉中也含有豐富的黃酮類化合物,黃酮類成分具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保護內(nèi)臟等多種生物功效,是食品和功能性調(diào)味品的重要生產(chǎn)材料[6-7]。從漢麻葉中提取黃酮成分不僅可以拓展黃酮的來源,同時也能提升漢麻產(chǎn)品的附加值,有利于漢麻產(chǎn)業(yè)鏈的資源綜合利用[8]。目前,黃酮類化合物提取工藝主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶解法、雙水相萃取法和超臨界流體萃取法[9-10]。本試驗主要利用溶劑提取法對漢麻葉中的黃酮提取工藝進行研究,同時對漢麻葉中黃酮的抗氧化活性進行研究,旨在為漢麻葉中黃酮提取工藝獲取最適提取條件[11]。
漢麻葉、氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸、葡萄糖、氯化鈉、水楊酸、碳酸鈉、鹽酸、維生素C和磷酸氫二鉀。
恒溫水浴鍋、冷凍干燥機、電子天平、分析天平、紫外分光光度計、pH計和粉碎機。
1.3.1 黃酮得率的計算
蘆丁標準曲線的繪制:稱取干燥的蘆丁10 mg,使用濃度為60%的乙醇定容至50 mL。取0,1,2,3,4,5 mL的蘆丁標準液于10 mL的比色管中,依次加入5%的亞硝酸鈉0.3 mL,混勻,放置5 min,之后加入濃度為10%的硝酸鋁,混勻,靜置10 min,以不含蘆丁的比色管的溶液為參數(shù),在吸光度為510 nm的條件下測定吸光度[12-13],計算并得到吸光度的回歸方程:Y(吸光度)=10.345X+0.0156(R2=0.9906;X為蘆丁濃度)。
漢麻葉中黃酮得率(%)=[(Y+0.0124)×V×10]/[10.235×M×1000]×100%。
式中:Y為樣品的吸光值,V為反應的體積,M為漢麻葉粉末的質(zhì)量。
1.3.2 漢麻葉黃酮提取單因素試驗
樣品的預處理:將藥物經(jīng)粉碎機粉碎過80目篩,獲得漢麻葉粉末,稱取漢麻葉粉末100 g,加入200 mL 95%的乙醇進行脫脂,在70 ℃的水浴中攪拌2 h,4000 r/min離心15 min后進行脫脂,過濾并烘干備用。
將精密處理后的漢麻葉粉1 g,乙醇濃度60%、提取時間80 min、提取溫度60 ℃、漢麻葉與溶劑的比例1∶30 (g/mL)作為單因素試驗的基礎(chǔ)條件。當某一個因素改變時,其他因素保持不變。在乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%和90%;提取時間分別為20,40,60,80,100,120,140 min;提取溫度分別為30,40,50,60,70,80,90 ℃;料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30、1∶5、1∶40;提取次數(shù)分別為1,2,3,4,5的條件下,按照上述方法進行單因素試驗。
1.3.3 響應面分析試驗設(shè)計
根據(jù)單因素試驗,以提取時間、料液比、提取次數(shù)和提取溫度作為變量因素,以漢麻葉黃酮的得率作為目標,采用四因素三水平的響應面分析,優(yōu)化漢麻葉黃酮的提取工藝,獲得最佳提取工藝參數(shù)。
響應面因素和水平設(shè)計見表1。
表1 響應面試驗因素和水平設(shè)計Table 1 Design of response surface test factors and levels
由圖1可知,隨著乙醇體積分數(shù)的增大,漢麻葉中的黃酮得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當乙醇體積分數(shù)達到60%時,漢麻葉中的黃酮得率達到最高,為2.0%。當乙醇體積分數(shù)小于60%時,漢麻葉中的黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的升高而升高;當乙醇體積分數(shù)大于60%時,漢麻葉中的黃酮得率隨著乙醇體積分數(shù)的升高而降低。乙醇的極性低于水的極性,當乙醇體積分數(shù)低于60%時,隨著乙醇體積分數(shù)的不斷升高,提取液的極性開始與黃酮的極性相接近,所以,黃酮的提取率越來越高;當乙醇的體積分數(shù)高于60%時,提取液的極性與黃酮的極性相差越來越大,導致溶液中黃酮提取率開始降低。所以,確定乙醇體積分數(shù)為60%作為最佳的提取條件。
圖1 乙醇體積分數(shù)對黃酮提取得率的影響Fig.1 The effect of ethanol volume fraction on the extraction yield of flavonoids
由圖2可知,隨著提取時間的增長,漢麻葉中黃酮提取得率先升高后降低,在80 min時黃酮的得率達到最高,為2.0%。當提取時間小于80 min時,漢麻葉中黃酮的得率隨著提取時間的延長而升高;提取時間大于80 min時,漢麻葉中黃酮的得率隨著時間的延長而降低。這是由于當時間小于80 min時,漢麻葉中的黃酮濃度很低,所以隨著時間的延長,提取液中黃酮的得率隨著時間的增長而升高,當提取時間超過80 min時,提取液中的黃酮濃度已經(jīng)達到飽和,隨著提取時間的增長,漢麻葉中的其他物質(zhì)溶入提取液中,導致黃酮提取量降低。所以,本試驗選取提取時間80 min作為最佳的提取條件。
圖2 提取時間對黃酮提取得率的影響Fig.2 The effect of extraction time on the extraction yield of flavonoids
由圖3可知,當提取溫度為30~60 ℃時,漢麻葉中黃酮的得率隨著提取溫度的升高而升高,當提取溫度達到60 ℃時,黃酮的得率最高,為2.0%。當溫度超過60 ℃時,漢麻葉中黃酮的得率隨著提取溫度的升高而降低。隨著漢麻葉黃酮提取溫度的升高,漢麻葉中黃酮的溶解度、擴散度和傳質(zhì)速度都有所增加。當溫度超過60 ℃時,黃酮中含有大量的羥基,極易被氧化,從而導致漢麻葉中黃酮提取量降低。因此,該試驗選擇60 ℃作為最佳提取溫度。
圖3 提取溫度對黃酮提取得率的影響Fig.3 The effect of extraction temperature on the extraction yield of flavonoids
由圖4可知,隨著料液比的增加,漢麻葉中黃酮得率先升高后降低。當料液比為1∶30時,黃酮得率最高,為2.0%。當料液比小于1∶30時,黃酮得率隨著料液比的增加而升高;當料液比大于1∶30時,漢麻葉中的黃酮得率隨著料液比的增加而降低。這是由于當料液比小于1∶30時,料液比逐漸增大,動態(tài)反應逐漸向產(chǎn)生黃酮的方向移動,造成黃酮的量逐漸增多,隨著料液比的增大,漢麻葉中的其他物質(zhì)也逐漸溶解出來,從而影響漢麻葉中黃酮的獲得。所以,本研究選取料液比1∶30作為最佳的料液比。
圖4 料液比對黃酮提取得率的影響Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of flavonoids
由圖5可知,隨著提取次數(shù)的增加,漢麻葉中黃酮得率也隨之增加。但是經(jīng)過2次提取之后,繼續(xù)增加黃酮的提取次數(shù),黃酮的得率增加卻不明顯,故選擇提取2次作為最佳的提取次數(shù),這樣不僅能夠保證黃酮相對較高的得率,同時也能避免重復試驗造成人力、物力資源的浪費。
圖5 提取次數(shù)對黃酮提取得率的影響Fig.5 The effect of extraction times on the extraction yield of flavonoids
2.6.1 響應面法分析的方案和結(jié)果
在單因素試驗的基礎(chǔ)上,通過BBD原理的設(shè)計,該試驗以A提取時間、B料液比、C提取次數(shù)、D提取溫度為影響因素,將漢麻葉的黃酮得率作為響應值,進行三水平試驗,試驗結(jié)果見表2。
表2 響應面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Response surface test design and results
2.6.2 響應模型的建立及顯著性檢驗
使用軟件Design-Expert 8.0對表3中的試驗數(shù)據(jù)進行多元線性分析和二項式的擬合分析,得到漢麻葉黃酮得率對自變量二項式中的回歸方程:Y=2.88+0.32A+0.22B+0.32C+0.24D+0.054AB-0.12AC+0.086AD-0.16BC+0.054BD+0.21CD-0.12A2-0.16B2-0.22C2-0.14D2。
由表3可知,一次項結(jié)果A、B、C和D與二次項結(jié)果A2、B2、C2和D2對漢麻中黃酮提取的影響極顯著(P<0.01),交叉項AC和BC對漢麻葉中的黃酮影響顯著(P<0.05),由方差分析結(jié)果可知,二次回歸方程的模型小于0.01,失擬項不顯著(P=0.3802),模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9828,這些數(shù)據(jù)表明回歸方程擬合性好,數(shù)學模型穩(wěn)定,試驗結(jié)果能夠被很好地描述。
表3 響應面二次方程的方差及分析結(jié)果Table 3 The variance and analysis results of the quadratic equation of response surface
通過分析,響應面優(yōu)化工藝的最佳提取工藝為料液比1∶28,提取時間95 min、提取溫度62 ℃、提取次數(shù)2次。
由圖6可知,漢麻葉黃酮對羥基自由基的清除率較強,且隨著漢麻葉黃酮濃度的增加,其羥基自由基的清除能力也逐漸增強。當濃度達到1 mg/mL時,漢麻葉黃酮對羥基自由基的清除率最高,為89%。
圖6 黃酮和Vc對羥基自由基的清除率Fig.6 The scavenging rates of flavonoids and Vc on hydroxyl radicals
隨著社會的發(fā)展,漢麻相關(guān)的產(chǎn)品逐漸受到全世界人民的重視,漢麻不僅可以作為工業(yè)原料開發(fā)工業(yè)纖維,而且可以用于提取漢麻葉黃酮,應用于臨床治療癌癥、神經(jīng)類疾病,最大限度完善漢麻產(chǎn)業(yè)鏈。
本試驗通過中心組合設(shè)計響應面法,以料液比、提取時間、提取溫度和提取次數(shù)為影響因素,以提取黃酮的總量為響應值,得到漢麻葉提取的最佳工藝:料液比為1∶28,提取時間為95 min,提取溫度為62 ℃和提取次數(shù)為2次。在此條件下,研究漢麻葉黃酮與維生素C的抗氧化活性,研究結(jié)果表明,漢麻葉黃酮具有明顯的抗氧化活性。