嚴皓敏，潘崎，余梓桐，程穎（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院器官移植暨肝膽外科，遼寧沈陽，110001）

肝移植是目前治療終末期肝病的唯一有效方法［1-3］。每年都會有許多移植等待名單上的患者由于捐贈資源短缺失去了生命。因此，很有必要充分利用心臟死亡后器官捐獻（donation after circulatory death，DCD）來擴大捐贈來源［4-5］。根據(jù)器官共享聯(lián)合網(wǎng)絡（United Network for Organ Sharing，UNOS）的數(shù)據(jù)，美國DCD 捐贈者在所有移植捐贈者中的比例穩(wěn)步上升，從2008 年的6.29%上升到2018 年的12.14%。肝移植供肝捐贈比例從6.25%上升至8.61%。在英國，2014 年至2015 年度1282 例已故器官捐贈者中有570 例為DCD 捐贈者［6］。與腦死亡后器官捐獻（donation after brainstem death，DBD）相比，DCD 來源的器官從心臟停搏到確認死亡通常會經(jīng)歷一段灌注不良的時期，這會給器官帶來性更多的缺血損傷，從而極大地影響了器官的活性［7］。與其他器官相比，肝臟通常更容易受到缺血的影響，這也解釋了為什么源于DCD 的供肝質(zhì)量不及其他器官［8-10］。盡管如此，仍有研究表明DCD肝移植仍然可以為患者提供了生存優(yōu)勢［11］。Scalea等［12］的一項研究表明，選擇冷缺血時間短的年輕DCD 供者的肝臟可能會產(chǎn)生更好的移植結(jié)果。隨著新的器官保存和復蘇的技術(shù)正在不斷進步［13-17］，包括常溫灌注、低溫充氧灌注、體外再灌注和復蘇，DCD 的移植物質(zhì)量有望得到進一步改善。

大多數(shù)DCD 供肝源于Maastricht 分類Ⅲ類捐贈者，這部分患者往往在重癥監(jiān)護病房或急診室等待生命維持治療的停止（withdrawal of life-sustaining therapy，WLST）。然而，目前對于WLST 過程本身是否會對供體器官質(zhì)量產(chǎn)生影響還沒有確定的結(jié)論。此前有幾項使用大型動物模型來研究誘導心臟驟停的研究中大多采用心臟除顫或使用心臟停搏藥物的方式使得供體模型安樂死［18-21］，然而這在臨床上是不能進行的。還有一種實驗模型是通過夾閉胸主動脈的方式來建立的不可控的DCD 豬模型［15］。這些模型顯然不能用于模擬臨床上肝移植前可控DCD 的狀況。因此，為了更好地研究供體從撤離呼吸機至循環(huán)死亡過程中供體肝臟的變化，在本研究中，我們利用巴馬小型豬建立了一種可控的撤離呼吸機模型。通過這一模型和過程，我們研究了撤除呼吸機階段體循環(huán)的變化以及熱缺血時間（warm ischemia time，WIT）對供體模型肝臟組織活性的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物處理：所有動物實驗均按照“動物管理指南”進行，并經(jīng)中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院動物醫(yī)學倫理委員會批準。選用16 只巴馬小型豬，雌雄各8 只，體重均在45 ～ 55 kg，購自天津市實驗小型豬繁育中心。

這些動物在手術(shù)前禁食24 h，充分補充水分。術(shù)前給實驗動物肌注咪唑安定（0.2 mg/kg）和阿托品（0.2 mg/kg），氣管插管前20 ～ 30 min 用速眠新Ⅱ號（0.1 ml/kg）鎮(zhèn)靜以及使用異氟醚（100%氧氣中1% ～ 2%）麻醉。

應用頸動脈和靜脈插管方式分別監(jiān)測實驗動物動脈壓（arterial blood pressure，ABP）和中心靜脈壓（central venous pressure， CVP）。用血氣分析儀（GEM Premier 3000）進行血氣分析，同時連續(xù)監(jiān)測心電圖。

采用窒息法建立豬DCD 模型。加用異丙酚（500 mg/10 ml）和羅庫溴銨（100 mg/10 ml）使實驗動物維持適當程度的持續(xù)麻醉。通氣維持在15 b/min 的呼吸頻率，最大呼吸壓低于25 cmH2O（1 cmH2O=0.098 kPa）。建立模擬臨床過程的窒息模型，通過拔除氣管導管來切斷通氣并且將該時間點定義為“撤機零點”。心電圖監(jiān)測顯示心臟無電活動或臨界低收縮壓（SBP ＜50 mmHg）為供體心臟死亡的循環(huán)指征，標志著WIT 開始。臨床上大多將器官WIT 定義為自撤除生命支持至原位主動脈冷灌注這段時間，本實驗不涉及后續(xù)冷灌注，因此將WIT 定義為豬模型自心臟死亡開始后的相關(guān)時長，本實驗僅觀察WIT 延長至60 min 的豬模型的相關(guān)變化。

1.2 血流動力學監(jiān)測：在整個手術(shù)過程中監(jiān)測血流動力學和生化參數(shù)。模型存活時間（min）定義為從撤除呼吸機零點到確認動物模型心臟死亡的時間。每隔5 min 記錄心率（heart rate，HR），血氣分析：二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide，PaCO2）、氧分壓（oxygen partial pressure，PaO2）、平均動脈壓（mean artery pressure，MAP）、中心靜脈壓（central venous pressure，CVP）、舒張壓（diastolic blood pressure，DBP）、收縮壓（systolic blood pressure，SBP）和血pH 值。

1.3 肝臟的病理檢查：光鏡下可檢測內(nèi)容包括血栓/出血、肝細胞腫脹、微泡性脂肪變性、細胞凋亡和壞死等形態(tài)學改變。電鏡可觀察亞細胞結(jié)構(gòu)，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、線粒體質(zhì)膜完整性、染色質(zhì)邊集和凝聚等情況。

1.3.1 光學顯微鏡檢測方法：從WIT 開始到WIT后30 min，每5 min 取一次肝組織活檢。組織用磷酸鹽緩沖液洗凈，用10%福爾馬林固定至少24 h，以石蠟包埋，以5 μm 厚度切片。隨后，切片脫蠟，再水化，蘇木精伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色檢查。

1.3.2 電子顯微鏡方法：分別于WIT-0 min、WIT-30 min、WIT-60 min 取體積為1 mm3的肝活檢標本，用Trump’s 固定劑固定，在20℃的溫度下用1%四氧化二釤和碳酸氫鈉緩沖液后固定3 h，用5%醋酸鈾酰水溶液整塊染色。厚片（1 m）用甲苯胺藍染色。用LKB8801 超微切片機（LKB，瑞典斯德哥爾摩）從厚片上切下50 ～70 nm 的薄片，以醋酸鈾酰和檸檬酸鉛染色。所有樣品均用透射電子顯微鏡（飛利浦EM201）檢查和拍照。

2 結(jié) 果

2.1 血流動力學參數(shù)變化：實驗動物的平均存活時間為17.94（11.3 ～24.5）min。在模型撤除呼吸機后的最初5 min 內(nèi)，我們觀察4 個血流動力學參數(shù)值均升高，如圖1 所示，包括MAP、CVP、DBP 和SBP。其中SBP 中尤為突出。除CVP 在10 min 后開始下降外，其他所有指標都開始下降。心率也在撤除呼吸機后的前5 min 內(nèi)升高，之后下降（圖2）。撤 除 呼 吸 機 后5 min 內(nèi)PaO2急 劇 下 降（圖3），10 min 后逐漸降至0 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。PaCO2值與實驗動物的血液pH 值呈負相關(guān)（圖4），這歸因于實驗動物的血液中碳酸含量逐漸增加。

圖1 血流動力學變化趨勢

圖2 HR 隨實驗時間的變化

圖3 血氣分析用來監(jiān)測PaCO2 和PaO2

圖4 pH 值變化

2.2 肝臟熱缺血損傷的組織學評價

2.2.1 光學顯微鏡觀察結(jié)果：如圖5 所示，我們發(fā)現(xiàn)隨著WIT 的延長，組織損傷程度逐漸嚴重。在WIT 的前10 min（圖5B、5C 與5A 相比），實質(zhì)內(nèi)肝細胞僅有輕微腫脹，血管內(nèi)的微血栓很容易被觀察到。WIT-15 min 時（圖5D），中心靜脈周圍可見放射狀中心性水腫。中心靜脈附近也可見炎性細胞。部分肝細胞表現(xiàn)出微泡性脂肪變性。凋亡肝細胞內(nèi)可見嗜酸性小體，肝竇內(nèi)可見5 ～8 個紅細胞壞死。WIT-20 min 時（圖5E），肝細胞和間質(zhì)狀況惡化，細胞腫脹加重，可見出血，并有局灶性或片狀壞死，細胞核出現(xiàn)標志細胞發(fā)生壞死裂解。WIT-25 min（圖5F），細胞腫脹加重，可見肝細胞空泡化，斑片狀壞死明顯。雖然中心靜脈附近出血和脂肪變性加重，但門靜脈區(qū)域結(jié)構(gòu)保持完整。撤除呼吸機后30 min（圖5G），大部分細胞出現(xiàn)膨脹，細胞間隙充滿紅細胞。大部分區(qū)域可見片狀壞死，脂肪變性加重。大量細胞壞死裂解，出現(xiàn)大量細胞核。

圖5 組織學評價

2.2.2 電子顯微鏡：在WIT 剛開始時，肝細胞內(nèi)線粒體呈圓形，內(nèi)膜清晰，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列整齊未見明顯的染色質(zhì)邊集或凝聚（圖6A）。WIT 延長至30 min 時，可見肝細胞呈廣泛的空泡化，線粒體結(jié)構(gòu)改變，內(nèi)膜模糊。大多數(shù)肝細胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹（圖6B）。WIT 延長至60 min 時，電鏡下可見許多肝細胞出現(xiàn)了壞死。在相當數(shù)量的肝細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體甚至整個細胞都呈現(xiàn)嚴重的空泡化。線粒體整體密度降低，同時線粒體內(nèi)可見大量電子致密沉淀物（圖6C）。大多數(shù)肝細胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)邊集和凝集。結(jié)果顯示W(wǎng)IT 控制在30 min 內(nèi)對肝細胞的損傷呈現(xiàn)可逆，而WIT 延長至60 min 后肝細胞會出現(xiàn)不可逆的損傷，表現(xiàn)為廣泛的嚴重空泡化和明顯的染色質(zhì)凝聚（圖6C）。

圖6 電鏡觀察下的亞分子結(jié)構(gòu)

3 討 論

根據(jù)心臟驟停的情況，Maastricht 分類系統(tǒng)將DCD捐贈者分為兩類：可控（Ⅰ和Ⅱ類）和不可控（Ⅲ和Ⅳ類）［22］。目前臨床上大多數(shù)DCD 捐贈者被歸類為Ⅲ類，即循環(huán)系統(tǒng)死亡發(fā)生在WLST 之后。從WLST開始到確認死亡再到最終獲得器官，總會經(jīng)歷一段時間，這會導致不可避免的高血壓和全身性低灌注的狀態(tài)。在這個WIT 內(nèi)，供體器官在沒有血液和氧氣供應的情況下，在體溫下會仍然在經(jīng)歷高代謝狀態(tài)。

與DBD 供體相比，DCD 供體通常會經(jīng)歷較長的WIT，因為確認心臟死亡需要更多的時間，這可能會導致DCD 捐贈者的器官遭受更嚴重的缺血性損傷［23-25］。目前已經(jīng)有許多研究利用人類［23-25］以及動物實驗模型［26-27］發(fā)現(xiàn)了長時間WIT 對器官的不利影響。然而，從停止生命維持治療到宣布循環(huán)死亡的這個過程中，有關(guān)供者循環(huán)系統(tǒng)的全身性變化以及這段WIT 對器官的影響還沒有得到詳細的描述。特別是在豬DCD 窒息模型的研究中，鮮有研究涉及到停用生命支持過程中供體循環(huán)參數(shù)的波動問題。一些研究表明，供體低收縮壓與移植的預后直接相關(guān)，而WIT 時間跨度與移植物活性呈負相關(guān)［20，26-27］。在Ho 等［28］的一項研究中提出，供者SBP 降至50 mmHg 以下的持續(xù)時間對移植物存活至關(guān)重要。在本研究中，我們重點關(guān)注了在這一過程中實驗動物全身血壓、氧氣供應以及肝組織學的變化。

大多數(shù)已建立的大型動物DCD 模型尚不能很好地模擬臨床情況。研究者們開發(fā)了一些方法，例如通過誘導心室顫動［20］或給予高濃度的鉀［18］來誘導心臟驟停。在Banan 等［29］的研究中，通過靜脈注射氯化鉀誘導心臟驟停，并將WIT 定義為腹腔內(nèi)阻斷到開始常溫體外肝臟灌注（normothermic extracorporeal liver perfusion，NELP）之間的時間。事實上，當捐贈者停止生命維持治療時，器官會經(jīng)歷一段緩慢而漸進的缺血損傷時間直到心臟驟停，期間供體氧氣供應隨之減少。在我們的研究中，該模型非常接近臨床上DCD 捐贈者停止生命維持治療后的情景。我們采用了被動的方法，通過切斷通氣來誘導心臟驟停，從而允許對內(nèi)臟的氧氣輸送和灌注可以緩慢而逐漸地減少。我們發(fā)現(xiàn)，從切斷通氣到確認心臟死亡之間的時間間隔并不恒定，這可能會導致WIT 時長的不確定性。因此，傳統(tǒng)的心臟死亡標準確認開始定義的WIT 可能不能準確地反映供體器官真實的遭受熱缺血損傷的時間。供體模型SBP在撤除呼吸機前5 min 升高，之后明顯下降，撤除呼吸機后15 min 降至50 mmHg 以下。同時，撤除呼吸機10 min 后，血氧分壓降至0 mmHg。我們定義的WIT 始于心臟死亡的確認，實際上移植物所經(jīng)歷的WIT 可能會更長。然而，不論WIT 如何定義，移植物的狀況都可能受到額外的不確定WIT 的影響。

組織學研究結(jié)果表明，隨著WIT 的延長，供肝組織遭受的損傷也更嚴重。我們在不同的時間點可以觀察到不同程度的肝竇擴張、肝細胞腫脹和空泡化。這些發(fā)現(xiàn)與之前的一些相關(guān)性研究［30-31］是一致的。值得注意的是，肝細胞同時發(fā)生了細胞和亞細胞水平的改變。這些變化是在再灌注前發(fā)現(xiàn)的，這表明減少WIT 對移植物的保存至關(guān)重要。

目前，已有相關(guān)臨床研究實驗證實WIT 超過30 min 被認為是引起移植物進一步丟失的危險因素［32-35］。一項Sher 等［36］基于UNOS 數(shù)據(jù)對DCD供體的調(diào)查研究中表明美國大多數(shù)器官移植中心可接受的WIT 不超過30 min。國內(nèi)有關(guān)豬肝移植時無心跳供體可耐受WIT 的研究中也認為安全時限為30 min，然而該研究中有關(guān)不同熱缺血時長所致供肝熱缺血損傷病理變化重點是于再灌注1 h 之后觀察的［37］。然而之前Takada 等［38］研究認為豬肝移植可耐受的WIT 長達60 min，其結(jié)論主要基于其研究結(jié)果顯示W(wǎng)IT 長達1 h 供肝的移植術(shù)后生存率可達80%。然而在國內(nèi)相似研究［39］中，心臟死亡確定后60 min 供肝肝移植術(shù)后卻無存活。有關(guān)熱缺血安全時限報道差異較大，可能是由于評判標準，以及手術(shù)方法等差異，還需進一步研究。在我們的實驗研究中，主要是通過對組織學結(jié)果評價可耐受的熱缺血時長，結(jié)果表明WIT 在30 min 內(nèi)供肝組織的損傷尚且可逆，至60 min 則不可逆。目前供肝資源短缺，有關(guān)熱缺血時限的研究有助于進一步擴大DCD 供肝來源，Paterno 等［40］有關(guān)WIT 對受體預后的研究結(jié)果表示W(wǎng)IT 在30 ～40 min，移植存活率無明顯差異。這一研究結(jié)果也提示有關(guān)供肝WIT 的篩選條件可適當放寬，以進一步擴大捐贈來源以及移植機會。

我們建立了一種模擬人類DCD 的心臟驟停的大型動物模型并觀察和記錄了在這個過程中供體血流動力學參數(shù)和供肝組織學的變化。我們的研究表明，從停止生命支持治療到確認心臟死亡的這個緩慢過程可能會使移植物承受額外的缺血性損傷。

我們的研究還存在一些局限性。實驗中使用的動物是健康的豬，而DCD 捐贈者通常有嚴重的腦損傷，盡管不是致命的。這種差異是否會對DCD供者所經(jīng)歷的缺氧過程產(chǎn)生影響，還需進一步研究。此外，雖然實驗動物可以在切斷通氣后立即停止呼吸，但DCD 捐贈者可能在窒息死亡之前能夠自主呼吸一段時間。因此，存在著一個未知的時間段，這段時間內(nèi)盡管供體處在缺氧狀態(tài)中，但循環(huán)仍在發(fā)生，這可能會使所獲得的器官的質(zhì)量評估進一步復雜化。本研究的樣本量不大，可能會限制數(shù)據(jù)的可靠性。今后的研究將致力于使用該DCD 供體模型進一步建立機械灌注干預恢復的全程移植模型，研究移植物的缺血/再灌注損傷，探討不同操作方式與移植結(jié)果的相關(guān)性。

以上，我們建立了一類豬DCD 模型，通過給實驗動物撤除呼吸機可以更好地模擬臨床Maastricht Ⅲ類。我們發(fā)現(xiàn)，在撤除呼吸機之后實驗動物血壓立即升高，但之后會持續(xù)下降。而PaO2迅速下降，PaCO2相應上升并達到平臺期。同時，我們也發(fā)現(xiàn)WIT 對供體肝組織完整性有直接影響。WIT在30 min內(nèi)的組織損傷可能仍是可逆的，而WIT 達到60 min 時的組織損傷則不可逆。