莫舒詠，張鵬，王彥峰（武漢大學(xué)中南醫(yī)院，武漢大學(xué)肝膽疾病研究院，武漢大學(xué)移植醫(yī)學(xué)中心，移植醫(yī)學(xué)技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071）

器官移植已經(jīng)成為終末期器官衰竭的一線治療，尤其是腎移植已成為一種常規(guī)治療手段，在世界范圍內(nèi)得到大力推廣。為了緩解器官短缺，越來越多的邊緣供體（expanded criteria donors， ECD）器官和心臟死亡供體（donation after cardiac death，DCD）器官應(yīng)用于臨床。然而，與標(biāo)準(zhǔn)供者相比，來自ECD 和DCD 的器官更容易發(fā)生缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury， IRI），導(dǎo)致發(fā)生原發(fā)性移植物無功能 （primary graft nonfunction， PNF）和移植物功能延遲恢復(fù) （delayed graft function， DGF）的風(fēng)險(xiǎn)增高［1］。在過去的幾十年中，靜態(tài)冷保存（static cold storage，SCS）一直是最主要的器官保存方式，隨著ECD 和DCD 器官的大量應(yīng)用，低溫機(jī)械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）被廣泛應(yīng)用，并已證實(shí)HMP 對改善ECD 供腎移植預(yù)后具有一定意義。此外，常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）可在接近生理的條件下維護(hù)器官，成為了器官保存新的研究方向，不僅提供了延長保存時(shí)間的可行性，實(shí)現(xiàn)對器官功能的評估，還為器官體外治療開辟了全新的視角。研究表明NMP 技術(shù)本身便可通過抑制炎癥減少IRI 的發(fā)生［2］，此外，在灌注液中添加藥物或具有治療作用的細(xì)胞可能有助于誘導(dǎo)器官修復(fù)和再生。間充質(zhì)干細(xì)胞/間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal stem/stromal cells， MSCs） 具有廣泛的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，既可以通過旁分泌趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子等物質(zhì)發(fā)揮抗炎作用［3］，還能通過抑制T 和B 細(xì)胞增殖、抑制樹突狀細(xì)胞成熟進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)［4］，MSCs 已成為實(shí)體器官移植的治療性細(xì)胞群。本文綜述了腎移植機(jī)械灌注的現(xiàn)狀，并強(qiáng)調(diào)了這一技術(shù)與MSCs 有機(jī)結(jié)合在器官修復(fù)中的治療潛力。

1 器官保存：從低溫靜態(tài)保存到機(jī)械灌注

SCS 目前仍是移植前器官保存的標(biāo)準(zhǔn)手段［5］。低溫可抑制酶的活性，有助于減緩三磷酸腺 苷（adenosine triphosphate，ATP） 的 消 耗， 并允許器官在缺氧的情況下較長時(shí)間儲存［6］。然而，缺氧環(huán)境也可導(dǎo)致器官損傷［7］。隨著ATP的耗盡，包括腺苷、肌苷和次黃嘌呤等細(xì)胞內(nèi)的有毒物質(zhì)會逐漸積累。無氧代謝將降低細(xì)胞內(nèi)pH 值，導(dǎo)致溶酶體激活，造成細(xì)胞損傷。Na+/K+ATP 酶的失活誘發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣、鈉和水的潴留，導(dǎo)致細(xì)胞水腫。且隨著器官缺口越來越大，來自ECD 和DCD 的器官被大量使用，這些類型的腎臟IRI 更重， DGF 發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，機(jī)器灌注 （machine perfusion，MP） 技術(shù)重新進(jìn)入了人們的眼球。研究發(fā)現(xiàn)HMP 明顯優(yōu)于SCS，尤其是應(yīng)用在ECD 腎臟中。HMP 減少了DGF 的發(fā)生，且更好地恢復(fù)移植物功能，顯著提高了移植物的長期存活率［8-10］。然而，即使用HMP 保存DCD 腎臟，長冷缺血時(shí)間（cold ischemia time，CIT）仍然是DGF 獨(dú)立和相關(guān)的危險(xiǎn)因素之一［11］。而且，在低溫條件下難以客觀評估器官質(zhì)量，修復(fù)器官損傷的手段也難以實(shí)施。NMP 是一種在體外模擬生理?xiàng)l件并保持器官全部代謝功能的灌注系統(tǒng)［12］。對于低溫耐受性差的ECD 器官，NMP 可能是器官體外保存的理想選擇，它不僅可以恢復(fù)有氧代謝，讓腎臟恢復(fù)功能，最大限度地規(guī)避冷缺血性損傷。其次，它可作為一種評估手段，依據(jù)腎臟大體觀、腎血流量和總尿量等指標(biāo)對供腎的功能狀態(tài)進(jìn)行評估［13］。最后，它可以在移植術(shù)前對器官進(jìn)行多手段的靶向性治療，為治療IRI、降低排斥反應(yīng)以及延長移植物存活方面提供了巨大的空間。

2 MSCs 的潛能

“MSCs”在文獻(xiàn)中通常指兩個(gè)不同的詞：間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells）或間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞（mesenchymal stromal cells） 。這兩個(gè)詞有不同的命名和定義。前者是中胚層來源的多潛能基質(zhì)細(xì)胞，具有高度的自我更新和多向分化潛能，具有免疫調(diào)節(jié)和炎癥歸巢能力，以及修復(fù)受損組織器官的能力。后者是指從組織的間質(zhì)-血管部分去除造血細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞后得到的異質(zhì)細(xì)胞混合物［14］，包括多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞、多能成體祖細(xì)胞（multipotent adult progenitor cells，MAPCs）和分化的成熟細(xì)胞。國際細(xì)胞治療學(xué)會（International Society of Cell Therapy，ISCT）制定了鑒定間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)：① 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下可貼壁；② CD105、CD73 和CD90 陽性，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a 或CD19 和HLADR 表 面 分 子 陰性；③ 體外分化為中胚層細(xì)胞：成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞［15］。與間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力［16］。

MSCs 在腎臟器官移植中的作用已有研究。MSCs 的抗炎特性、修復(fù)受損組織能力和免疫調(diào)節(jié)功能使其成為腎臟再生治療的理想干預(yù)手段，這意味著應(yīng)用MSCs 有可能降低IRI［17］和急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率，促進(jìn)免疫抑制甚至建立移植耐受［18］。理論上，MSCs 的修復(fù)能力來自于其向外胚層和內(nèi)胚層細(xì)胞分化的潛能，通過再生分化取代受損和壞死的組織。然而，越來越多的證據(jù)表明，MSCs 的療效主要依賴于其旁分泌效應(yīng)，而不是它們本身的再生作用［19］。據(jù)報(bào)道，損傷組織中趨化因子或其受體的過表達(dá)可促進(jìn)MSCs 的增殖和遷移［20］，MSCs募集后再通過旁分泌生物活性因子，包括趨化因子、細(xì)胞因子和生長因子等，來刺激附近的細(xì)胞進(jìn)行組織修復(fù)，發(fā)揮其抗凋亡、抗炎、抗纖維化和血管生成的作用。有研究表明，應(yīng)用MSCs 后，受損心臟中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factors，F(xiàn)GF）和胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）水平顯著升高，與對照組相比有更好的再生效果［21］。此外，MSCs 的免疫調(diào)節(jié)特性主要與細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、白細(xì)胞介素-10 （interleukin-10，IL-10）和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）有關(guān)，可通過產(chǎn)生細(xì)胞因子如IDO、PGE2、TGF-β、HLA-G5 和NO， 利 用CXCL9 和CXCL10 影響鄰近細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)［22］。MSCs 對免疫系統(tǒng)的激活和成熟都有抑制作用，可以促進(jìn)免疫細(xì)胞分化為調(diào)節(jié)或抑制表型［23］。

目前已有一些臨床試驗(yàn)研究了以腎移植受者為對象的MSCs 療法的安全性和效果。這些研究證明通過靜脈輸注給予MSCs 對移植物或患者存活率沒有不良影響，沒有出現(xiàn)與MSCs 輸注直接相關(guān)的毒性，感染或腫瘤的易感性均無增加［24-26］。研究表明MSCs 在許多腎臟疾病包括急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）、慢性腎病（chronic nephrosis，CKD）、糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）、動脈粥樣硬化性腎血管疾病和腎移植可發(fā)揮有利作用［27］。然而這些試驗(yàn)在研究設(shè)計(jì)上存在巨大的異質(zhì)性，還有許多懸而未決的問題如MSCs 的來源、輸注劑量、最佳給藥時(shí)機(jī)和頻率及輔助的免疫抑制方案仍有待確定。此外，MSCs 在體內(nèi)的定位和存留問題也存在爭議［28］。由于體外培養(yǎng)的MSCs 直徑超過20 μm，遠(yuǎn)大于循環(huán)中的免疫細(xì)胞，也大于肺毛細(xì)血管的管徑，大部分MSCs 在靜脈輸注后滯留于肺部。同時(shí)，通過其他途徑給藥也會導(dǎo)致MSCs 滯留在其他器官中，如通過門靜脈給藥的MSCs 可在肝臟中被發(fā)現(xiàn)，在肌肉、脊柱和脂肪墊等組織內(nèi)給藥的MSCs 可在局部停留長達(dá)數(shù)周的時(shí)間。此外，MSCs 本身壽命較短，尤其是移植后體內(nèi)微環(huán)境惡劣，存活的MSCs數(shù)量較少［29］。由于存在致命性肺栓塞的風(fēng)險(xiǎn)，通過加大注射濃度來提高M(jìn)SCs 存活量并不可行。

近年來，諸多研究表明MSCs 通過其旁分泌產(chǎn)生的外泌體發(fā)揮治療效果。外泌體（exosomes，EVs）是一種由細(xì)胞分泌的納米級脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)顆粒，直徑為50 ～ 200 nm。它可來自于全身各種類型的細(xì)胞，并大量存在于體液中，通過轉(zhuǎn)移生物活性分子（如蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)）參與細(xì)胞間的通訊［30］。與可溶性細(xì)胞因子不同，外泌體的包裹能力賦予了內(nèi)部分子高度的穩(wěn)定性，保護(hù)它們免受酶的降解，并介導(dǎo)它們進(jìn)入受體細(xì)胞發(fā)揮作用［31］。值得注意的是，MSCs 是生產(chǎn)外泌體最高效的細(xì)胞類型之一［32］，因此外泌體作為基于MSCs 的療法很有前景，優(yōu)勢在于外泌體的免疫原性較低，具有跨越組織和細(xì)胞屏障的能力，并對損傷部位具有趨向性。

3 機(jī)械灌注與MSCs 的聯(lián)合療法

機(jī)器灌注提供了一個(gè)獨(dú)特的平臺，可選擇性地將MSCs 或外泌體直接注入供體器官，從而克服歸巢、滯留和安全性問題。為了驗(yàn)證在機(jī)械灌注中應(yīng)用MSCs 是否可行和灌注條件對MSCs 的影響，Parraga 等［33］分別使用灌注液和細(xì)胞培養(yǎng)液對新鮮和凍融的人（h）MSCs 和豬（p）MSCs 進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果證明灌注液對兩種MSCs 的存活、增殖和分泌能力均無明顯影響，而MSCs 的冷凍-解凍過程、懸浮而非貼壁的培養(yǎng)狀態(tài)對其存活和功能的影響更大。懸浮條件下培養(yǎng)的hMSCs 在灌注液中的存活率降低15%，pMSCs 在灌注液和培養(yǎng)液中的存活率均降低40%。凍融過程使hMSCs 存活率降低25%，且可觀察到凍融后的pMSCs 與豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（porcine arotic endothelial cell，PAOEC）和hMSCs 與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）的黏附明顯減少，細(xì)胞內(nèi)ROS 表達(dá)水平增高。這說明凍融過程可能通過ROS 高表達(dá)增加氧化應(yīng)激，進(jìn)而對線粒體造成損害，使MSCs 對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力降低。

Brasile 等［34］應(yīng)用無細(xì)胞的灌注系統(tǒng)——失血代謝支持技術(shù)評估了MSCs 療法對DCD 供腎IRI 修復(fù)的潛力。EMS 系統(tǒng)包括無細(xì)胞培養(yǎng)基、灌注系統(tǒng)、生物傳感器、一次性器官腔以及中心控制模塊［35］。在32℃下5對DCD供腎經(jīng)EMS系統(tǒng)灌注24 h，其中實(shí)驗(yàn)組灌注1×108MSCs。結(jié)果證明在體外24 h熱灌注加入MSCs 干預(yù)有可能實(shí)現(xiàn)缺血損傷的腎組織再生，包括ATP 和生長因子的合成增加，炎癥反應(yīng)減輕，細(xì)胞骨架修復(fù)和有絲分裂增強(qiáng)。

Pool 等［36］評估了在NMP 過程中灌注液內(nèi)MSCs 的定位和去向。豬腎在常溫下機(jī)械灌注7 h，在NMP 1 h 后分別加入0、105、106或107熒光標(biāo)記的人脂肪組織來源的MSCs，灌注結(jié)束后只有在107組的腎小球毛細(xì)血管管腔內(nèi)可檢測到完整的MSCs。這說明NMP 聯(lián)合適量MSCs 治療供體腎臟是可行的。此外，在NMP 期間灌注液中的MSCs 數(shù)量隨著時(shí)間的推移迅速減少，這可能與細(xì)胞遷移到移植物中、非生理的懸浮條件致細(xì)胞死亡以及灌流系統(tǒng)循環(huán)產(chǎn)生的壓力和流體力學(xué)有關(guān)。

隨后，該團(tuán)隊(duì)［37］研究了NMP 聯(lián)合MSCs 是否對腎功能有影響，以及分泌何種細(xì)胞因子。在活體豬腎臟熱缺血20 min 后進(jìn)行HMP 2 ～ 3 h，隨后進(jìn)行總時(shí)長7 h 的NMP，在NMP 1 h 時(shí)分別加入107人脂肪來源（A）-MSCs 和107骨髓來源（BM）-MSCs。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，MSCs 灌注的腎臟乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂鈣蛋白水平降低，而人肝細(xì)胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）、IL-6 和白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）水平升高。這提示MSCs 在NMP 過程中作用于受損腎臟，可降低損傷標(biāo)志物水平，并誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放。但該研究未進(jìn)行移植研究，無法確定這些影響是否與受損腎臟的短期和長期移植物功能以及存活率有關(guān)。

Lohmann 等［38］使用豬自體移植模型評估了NMP 期間使用MSCs 治療腎臟的安全性和可行性，并觀察移植后14 d 內(nèi)MSCs 治療對腎臟的潛在改善作用。該研究證明，熱灌注后MSCs 仍保留在腎小球內(nèi)，而移植后第14 天MSCs 的在腎數(shù)量衰減20 倍。研究者認(rèn)為MSCs 潛在的益處并不一定取決于它們的長期存活率，因?yàn)镸SCs 和宿主細(xì)胞之間的相互作用可能會啟動免疫調(diào)節(jié)和再生過程，這些過程在MSCs 消失后仍在繼續(xù)。然而，研究并未發(fā)現(xiàn)MSCs 誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)的證據(jù)，移植后功能、早期纖維化標(biāo)志物和組織學(xué)均無改善。在NMP 期間加入MSCs 是安全的，并且不會對灌注動力學(xué)或移植物存活率造成明顯的改變。

MAPCs 是一種成人骨髓來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞。它們?nèi)狈χ饕M織相容性復(fù)合體MHC-Ⅱ或共刺激分子（CD80、CD86 和CD40），并且MHC-Ⅰ低表達(dá)，對T 細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子產(chǎn)生具有非免疫原性［39］。MAPCs 細(xì)胞通過釋放抗炎和免疫調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子，限制致病性免疫細(xì)胞的浸潤和增殖。Thompson 等［40］研 究 了MAPCs 細(xì) 胞 在 腎 臟NMP 中的治療潛力。來自同一供體的人腎同時(shí)灌注7 h，NMP 1 h 后治療組腎臟接受50×106MAPCs。經(jīng)MAPC 治療的腎臟表現(xiàn)為尿量增加，損傷生物標(biāo)記物NGAL 表達(dá)減少，微血管灌注改善。免疫熒光顯示NMP 時(shí)腎臟血管周圍間隙有預(yù)標(biāo)記的MAPC 細(xì)胞。這是首次在體外灌注平臺上成功地將細(xì)胞直接輸送到人類供體腎臟，且證明NMP 聯(lián)合MAPC 細(xì)胞治療腎臟可使其功能得到改善，降低損傷和減輕炎癥。

Gregorini 等［41］用 含 有MSCs 或MSCs 分 泌 的EVs 的灌注液低溫（4℃）灌注大鼠腎臟4 h。這兩種治療均顯著減少了腎臟的組織學(xué)病變，整體腎損傷評分總體降低。結(jié)果顯示負(fù)責(zé)分子轉(zhuǎn)運(yùn)、檸檬酸循環(huán)、呼吸鏈電子轉(zhuǎn)運(yùn)和抗氧化活性的基因集和單個(gè)基因顯著上調(diào)。此外，灌注液生化分析提示缺血標(biāo)志物如乳酸和LDH、氧化應(yīng)激標(biāo)志物丙二醛水平顯著下降，丙酮酸增加，葡萄糖降低，表明HMP期間腎臟代謝能力增強(qiáng)。重要的是，與MSCs 灌注的腎臟相比，EVs 組的治療效果更為顯著。這表明在短時(shí)間的體外灌注過程中，直接地輸送游離的EVs 是可行的，甚至效益更高。

4 展 望

目前，體外機(jī)械灌注為器官保存、治療和再生打開了全新的視角，為ECD 和DCD 器官的治療和修復(fù)帶來了希望?；跈C(jī)械灌注這一體外治療平臺和MSCs 的現(xiàn)有研究，將兩者聯(lián)合有助于實(shí)現(xiàn)ECD和DCD 器官的高效使用。然而，目前關(guān)于MSCs 在體外機(jī)械灌注中應(yīng)用的研究報(bào)道較少，主要集中在其可行性和安全性方面，還沒有確鑿的證據(jù)證明其臨床有效性。因此，未來的研究應(yīng)聚焦于MSCs 及EVs 在機(jī)械灌注中的作用效果和機(jī)制，進(jìn)一步優(yōu)化其應(yīng)用條件，從而提高ECD 和DCD 器官移植的成功率。