蔣淑萍 劉昌偉 李斌 徐小琴 羅文基 余柏林 張?jiān)?/p>

目前，診斷肺結(jié)核主要依靠細(xì)菌學(xué)檢測(cè)，方法有多種，如萋-尼抗酸染色法（acid-fast stain，AFS），此方法操作簡單、快捷及經(jīng)濟(jì)，但敏感度較低，容易漏檢；培養(yǎng)法是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的金標(biāo)準(zhǔn)，但耗時(shí)較長，需1～2個(gè)月才能出結(jié)果，且極易受環(huán)境、人為操作等影響，同時(shí)后期還可能需要繼續(xù)進(jìn)行菌種鑒定，影響結(jié)核病的早期診斷；組織病理學(xué)檢查雖有較高的準(zhǔn)確性，但有創(chuàng)傷性；分子生物學(xué)技術(shù)能直接檢測(cè)MTB特有的核酸序列，且操作方便、快速及敏感度和特異度高，是目前結(jié)核病診斷的發(fā)展趨勢(shì)，但其價(jià)格昂貴，不適合基層醫(yī)院普遍開展［1-3］。因此，探索一種更合適的早期診斷方法至關(guān)重要。交叉引物核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（cross-priming amplification，CPA）是一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡單、報(bào)告快速及相對(duì)便宜等特點(diǎn)，具有廣泛應(yīng)用前景［4-5］。以固體培養(yǎng)法為參照對(duì)CPA技術(shù)檢測(cè)效能評(píng)價(jià)已見報(bào)道，但以液體培養(yǎng)法為參照進(jìn)行評(píng)價(jià)罕見報(bào)道。為此，本研究通過以BACTEC MGIT 960（簡稱“MGIT 960”）液體培養(yǎng)法為參照，與AFS 法比較，評(píng)估CPA技術(shù)在MTB檢測(cè)中的效能。

資料和方法

一、研究對(duì)象

1.一般資料：收集2020年1月至2021年5月在深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心就診的初診疑似肺結(jié)核患者2507例，排除99例非結(jié)核分枝桿菌感染者，共納入2408例進(jìn)行分析。其中男1607例，女801例；年齡6～93歲，中位年齡［M（Q1，Q3）］為32（26～45）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）咳嗽、咳痰時(shí)間＞2周，自愿到院接受各項(xiàng)相關(guān)檢查；（2）初診疑似肺結(jié)核；（3）未經(jīng)抗結(jié)核治療；（4）能送檢至少1份合格痰標(biāo)本；（5）患者及家屬知情并簽訂知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）未同時(shí)進(jìn)行3種方法檢測(cè)者；（2）非結(jié)核分枝桿菌感染或定植者；（3）不自愿配合者；（4）檢測(cè)期間，由于技術(shù)原因?qū)е陆Y(jié)果缺失者；（5）任一方法檢測(cè)結(jié)果為無效者。（6）AFS陽性而MPB64抗原陰性者。

2.倫理：本研究經(jīng)深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意（［2020］03號(hào)）。

二、儀器與試劑

4%氧氧化鈉（廣東汕頭西隴化工有限公司）；p H值6.8的磷酸緩沖鹽溶液（無錫傲銳東源生物科技有限公司）；萋-尼抗酸染色試劑（上海皓信生物科技有限公司）；MGIT 960液體培養(yǎng)試劑（美國BD公司）；MTB抗原試劑盒（杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司）；CPA檢測(cè)試劑（杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司）。

三、方法

1.標(biāo)本采集：對(duì)患者進(jìn)行留痰宣教后，患者自行留取就診當(dāng)日及時(shí)痰、夜間痰及就診次日清晨痰共3份，每份2～5 ml，及時(shí)送檢。收到標(biāo)本后將3份標(biāo)本混合成1份，然后同時(shí)采用AFS法、MGIT 960液體培養(yǎng)法及CPA技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。

2.AFS法：參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》［6］抗酸桿菌顯微鏡檢查標(biāo)準(zhǔn)化操作程序進(jìn)行。藍(lán)色背景下抗酸桿菌呈紅色，連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌為陰性；發(fā)現(xiàn)3～9個(gè)/300個(gè)視野或更多為陽性。

3.MGIT 960 液體培養(yǎng)法：嚴(yán)格按照MGIT 960系統(tǒng)操作說明書進(jìn)行操作，培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定為42 d。儀器報(bào)告陽性后，即取培養(yǎng)液進(jìn)行抗酸染色及MPB64抗原檢測(cè)。若抗酸染色和MPB64抗原檢驗(yàn)均陽性者則為培養(yǎng)陽性；若二者全部為陰性或抗酸染色陰性和MPB64抗原陽性者，判為污染菌，需將培養(yǎng)液當(dāng)標(biāo)本消化處理后再培養(yǎng)；若抗酸染色陽性而MPB64抗原陰性者則疑似非結(jié)核分枝桿菌，本研究予以排除。儀器培養(yǎng)42 d后報(bào)陰性者則為培養(yǎng)陰性。

4.MPB64抗原檢測(cè)方法：取待鑒定的液體培養(yǎng)液100μl滴至檢測(cè)板樣本檢測(cè)區(qū)，15～60 min內(nèi)觀察檢測(cè)結(jié)果。檢測(cè)線（T）和質(zhì)控線（C）均出現(xiàn)紫紅色條帶者為陽性，檢測(cè)線（T）沒出現(xiàn)紫紅色條帶而質(zhì)控線（C）出現(xiàn)紫紅色條帶者為陰性，質(zhì)控線（C）沒出現(xiàn)紫紅色條帶者均需重新檢測(cè)。

5.CPA 技術(shù)：采用Easy NAT 恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法試劑盒及核酸提取試劑對(duì)MTB-DNA 進(jìn)行提取，操作均嚴(yán)格按照說明書要求進(jìn)行。若痰液標(biāo)本黏稠度較高，取適量標(biāo)本以4%NaOH 消化（根據(jù)黏稠度加入1～2倍），然后進(jìn)行離心、生理鹽水洗滌、加核酸提取試劑及100℃金屬浴等處理，得到上清DNA模板，然后取DNA模板液于玻璃化反應(yīng)體系管中進(jìn)行核酸恒溫?cái)U(kuò)增，完成后取出反應(yīng)管置入一次性防污染檢測(cè)裝置，扣緊進(jìn)行檢測(cè)，1～2 min讀取結(jié)果。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）陽性：質(zhì)控線（C）和檢測(cè)線（T）同時(shí)顯色，或僅出現(xiàn)T線顯色，這表明樣本中含有MTB，且含菌量已達(dá)到或超出了試劑盒的最低檢出限。（2）陰性：僅C線顯色，這表明樣本中并不含有MTB 或其含菌量未達(dá)到試劑盒最低檢出限。（3）無效：C線和T線均未顯色，這表明操作有誤、試劑盒受損或有擴(kuò)增抑制物，如遇此情況，需要查明導(dǎo)致結(jié)果無效的原因，重新檢測(cè)。

6.相關(guān)指標(biāo)計(jì)算：敏感度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；陽性預(yù)測(cè)值=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%；符合率=（真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù)）/患者總例數(shù)×100%。

7.質(zhì)量控制：痰檢質(zhì)量室間質(zhì)量評(píng)價(jià)由北京結(jié)核病診斷技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟以及深圳市慢性病防治中心組織進(jìn)行，質(zhì)評(píng)結(jié)果全部合格。室內(nèi)質(zhì)控2020年涂陽培陰率為0.25%，液體培養(yǎng)污染率為7.93%，CPA檢測(cè)無效率0。

8.觀察指標(biāo)：不同方法MTB陽性檢出率、敏感度、一致性及培養(yǎng)陽性時(shí)間與敏感度的相關(guān)性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料采用“百分率（%）”描述，差異性比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)性計(jì)量資料以”中位數(shù)（四分位數(shù)）”描述；結(jié)果一致性采用Kappa檢驗(yàn)，Kappa值≥0.75為一致性很好，0.40≤Kappa值＜0.75為一致性較好，Kappa值＜0.40時(shí)為一致性較差；相關(guān)性采用卡方趨勢(shì)性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、三種方法MTB陽性檢出率比較

AFS法、MGIT 960液體培養(yǎng)法及CPA技術(shù)MTB陽性檢出率分別為8.89%（214/2408）、27.99%（674/2408）及15.49%（373/2408），不同方法之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=314.619，P=0.000），其中MGIT 960液體培養(yǎng)法明顯高于CPA技術(shù)和AFS法，而CPA 技術(shù)高于AFS法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=110.572，P=0.000；χ2=292.158，P=0.000；χ2=49.046，P=0.000）。

二、CPA技術(shù)檢測(cè)效能評(píng)估

以MGIT 960 液體培養(yǎng)結(jié)果作為參照標(biāo)準(zhǔn)，CPA檢測(cè)MTB的敏感度、特異度、陽性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值及符合率分別為52.37%、98.85%、94.64%、84.23%及85.84%（2067/2408），而AFS法分別為31.45%、99.88%、99.07%、78.94%及80.73%（1944/2408），其中CPA技術(shù)的敏感度明顯高于AFS 法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=108.290，P=0.000）。以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，CPA技術(shù)與MGIT 960液體培養(yǎng)法一致性較好（Kappa=0.592），而AFS法較差（Kappa=0.395）。同時(shí)AFS法陽培陰率為0.08%（2/2408），培養(yǎng)污染率為5.40%（130/2408），而CPA 檢測(cè)無效例數(shù)為0（表1）。

表1 以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參照評(píng)估CPA技術(shù)檢測(cè)MTB效能

三、CPA檢測(cè)敏感度與培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間相關(guān)性

MGIT 960液體培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間為3～42 d，中位數(shù)（四分位數(shù)）為14（10，19）d，其中68.10%的標(biāo)本報(bào)陽在7～19 d，而CPA 檢測(cè)敏感度隨培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間增加而降低。經(jīng)趨勢(shì)性卡方檢驗(yàn)，CPA 敏感度隨培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間的增加而呈下降趨勢(shì)（Z趨勢(shì)=257.788，P=0.000），兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.988，P=0.000）（表2）。

表2 CPA檢測(cè)敏感度與MGIT 960液體培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間相關(guān)性

討 論

結(jié)核病是由MTB感染，并經(jīng)呼吸道傳播的一種嚴(yán)重慢性傳染性疾病。隨著人們?cè)陲嬍沉?xí)慣和作息時(shí)間的改變及社會(huì)壓力劇增等因素的共同影響下，人體免疫力下降，從而導(dǎo)致近年來結(jié)核病發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且年輕化。MTB感染潛伏期長達(dá)4～8周，早期無任何臨床癥狀或癥狀輕微，易被疏忽，確診時(shí)病情已發(fā)展到活動(dòng)階段，錯(cuò)過了最佳的治療時(shí)機(jī)，嚴(yán)重影響患者及時(shí)診斷、治療及傳播防控［7-9］。因此，加強(qiáng)結(jié)核病早期診斷對(duì)控制病情發(fā)展及傳播至關(guān)重要。

CPA是我國自主研發(fā)的第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，主要包括玻璃引物、交叉引物、探針及具有鏈置換功能的DNA 聚合酶，針對(duì)MTB特異性基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，然后利用免疫層析乳膠標(biāo)記的試紙條進(jìn)行檢測(cè)，能排除非結(jié)核分枝桿菌的影響，而AFS法則不能，從而提高CPA 技術(shù)檢測(cè)效能［10-12］。本研究結(jié)果顯示，以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參照，CPA 技術(shù)MTB 陽性檢出率（15.49%）明顯高于AFS法（8.89%），但CPA 技術(shù)的MTB陽性檢出率明顯低于MGIT 960液體培養(yǎng)法（27.99%），而特異度高，這可能與CPA技術(shù)最低檢測(cè)下限和檢測(cè)原理有關(guān)。同時(shí)CPA 技術(shù)檢測(cè)MTB的敏感度（52.37%）明顯高于AFS法（31.45%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與劉蘭瑞等［2］的研究結(jié)果基本一致，且CPA技術(shù)與MGIT 960液體培養(yǎng)法檢查結(jié)果一致性（Kappa=0.592）明顯好于AFS法（Kappa=0.395），這表明CPA 技術(shù)在初診疑似肺結(jié)核診斷中與AFS法比較有較高的敏感度和一致性，可提高M(jìn)TB陽性檢出率。另外結(jié)果顯示，AFS法陽培陰率為0.08%及MGIT 960液體培養(yǎng)法培養(yǎng)污染率為5.40%，但未發(fā)現(xiàn)CPA 技術(shù)檢測(cè)無效案例，且CPA技術(shù)檢測(cè)全過程只需要2 h，可與AFS法相媲美。

有研究表明，以固體培養(yǎng)法結(jié)果為參照，CPA技術(shù)檢測(cè)MTB的敏感度約為84.1%～100%。本研究結(jié)果顯示，以MGIT 960液體培養(yǎng)結(jié)果為參照，CPA技術(shù)檢測(cè)MTB的敏感度僅有52.37%，明顯低于以固體培養(yǎng)法結(jié)果為參照的CPA 技術(shù)的敏感度，這可能與MGIT 960液體培養(yǎng)法的培養(yǎng)敏感度比固體培養(yǎng)法檢出能力更高，能將MTB含菌量更低的標(biāo)本培養(yǎng)出陽性等有關(guān)［13-16］。另外，有研究表明，液體培養(yǎng)檢出陽性結(jié)果時(shí)間與痰中分枝桿菌的數(shù)量有關(guān)，標(biāo)本含菌量越低，報(bào)陽時(shí)間越長［17］。本研究結(jié)果顯示，MGIT 960液體培養(yǎng)中位報(bào)陽天數(shù)為14 d，68.10%的標(biāo)本在7～19 d內(nèi)報(bào)陽，與其他報(bào)道存在一定差異［18-21］，這可能與不同地區(qū)標(biāo)本中MTB含量不同有關(guān)。同時(shí)CPA敏感度隨培養(yǎng)報(bào)陽時(shí)間的增加而呈下降趨勢(shì)（Z趨勢(shì)=257.788，P=0.000），且兩者呈負(fù)相關(guān)（r=-0.988，P=0.000），這表明CPA技術(shù)檢測(cè)MTB的敏感度與標(biāo)本中的MTB含菌量有關(guān)。此外，本研究收集了49 份MGIT 960液體培養(yǎng)陽性而CPA 陰性標(biāo)本，逐級(jí)增加標(biāo)本量進(jìn)行檢測(cè)，其中14份標(biāo)本由陰性轉(zhuǎn)變?yōu)殛栃裕行┥踔撂盗吭黾拥? ml才出現(xiàn)陽性，從而可以推測(cè)對(duì)于CPA技術(shù)結(jié)果陰性而又高度懷疑結(jié)核病患者，可通過增大檢測(cè)標(biāo)本量，并對(duì)其進(jìn)行消化和梯隊(duì)濃縮的方案在一定程度上能提高CPA 技術(shù)檢出效能。

綜上所述，CPA 作為一種新型分子檢測(cè)方法，在初診疑似肺結(jié)核診斷中與AFS法比較有較高的陽性檢出率、敏感度、特異度和一致性。同時(shí)CPA技術(shù)不需價(jià)格高昂的特殊設(shè)備，檢測(cè)過程中不會(huì)產(chǎn)生有害物質(zhì)造成二次污染，且操作簡單方便、快速及經(jīng)濟(jì)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，但其試劑盒檢測(cè)下限有待提高。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)蔣淑萍：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析、起草文章及審閱、獲取研究經(jīng)費(fèi)、技術(shù)支持；劉昌偉：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析/解釋數(shù)據(jù)、審閱、統(tǒng)計(jì)分析、行政及技術(shù)支持與指導(dǎo)；李斌：實(shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、審閱、行政及材料支持；徐小琴、羅文基、余柏林及張?jiān)拢簩?shí)施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)及審閱