邱小明

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學院食品工程學院，福建 漳州 363000;2.農(nóng)產(chǎn)品深加工及安全福建省高校應用技術(shù)工程中心，福建 漳州 363000)

海藻(Algae)是海洋中的生產(chǎn)者，主要包括綠藻、紅藻、藍藻和褐藻四大類[1]。隨著人們對海藻的不斷認識，人類對海藻的利用也由簡單的食用到開發(fā)新型藥物?，F(xiàn)今，隨著現(xiàn)代生化分離純化技術(shù)的發(fā)展和各種藥物篩選方法的發(fā)現(xiàn)，人們對海藻的利用取得了更大的成果，從中找到了許多具有抗腫瘤、抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗氧化、抗心血管疾病的重要生物活性物，主要有：多糖類、多酚類、甾醇類、黃酮類、萜類、大環(huán)內(nèi)酯類、環(huán)狀多硫化合物等[2-3]。天然藥物在腫瘤的臨床治療上有副作用小、抗癌譜廣等優(yōu)點，這些優(yōu)點使得海洋藥物研發(fā)具有廣闊的前景[4]。海藻資源是抗癌活性物質(zhì)研究的重要來源之一，利用藻類來開發(fā)研究新的抗腫瘤物質(zhì)一直是研究的熱點，據(jù)美國NCL報告，3.5%的海藻提取物具有抗腫瘤活性或細胞毒性[5]。近年來從藻類中發(fā)現(xiàn)許多的酮類、甾體、萜類及含氮化合物等結(jié)構(gòu)新穎的物質(zhì)，它們都具有顯著的抗腫瘤活性[6]。從海藻中提取的二十二碳六烯酸(DHA)可以抑制前列腺癌、結(jié)腸癌和乳腺癌細胞的生長，研究表明增加DHA的攝取量能預防癌癥的發(fā)生[7-8]。近年來，已上市的海洋抗腫瘤藥物有阿糖苷、曲貝替定和甲磺酸艾日布林等，許多海藻提取物正在實驗和臨床研究中，此外，還有許多的海藻資源待研究開發(fā)。

本研究以福建省四種主要經(jīng)濟海藻(滸苔、紫菜、江蘺和海帶)為原料，采用石油醚、乙酸乙酯和75%的乙醇三種不同溶劑進行提取，得到12種粗提物組分，利用MTT法進行抗腫瘤活性檢測評價各組分抑制腫瘤細胞增殖活性，探討四種海藻提取物與抑制腫瘤細胞活性之間的關(guān)系。

1 材料與設備

1.1 實驗原料

紫菜、江蘺、滸苔、海帶購自福建漳浦，四種海藻粉碎過60目篩。

1.2 實驗儀器

FDU-1200真空冷凍干燥箱，SHB-III循環(huán)水式真空泵，實驗室超純水器，HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，HQ2200型超聲波清洗器，YRE-202A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，-80℃ULT低溫冰箱，電子天平BA124S、2202S 型，高速離心機RX15，2.5-1000 μL移液槍，UV-1800紫外可見分光光度計，96孔板，CO2培養(yǎng)箱，倒置光學顯微鏡，超凈工作臺，DZF-6020型真空干燥箱，立式壓力蒸汽滅菌器，超低溫離心機，細胞培養(yǎng)瓶，SH-1000酶標儀，pH計。

1.3 主要試劑

六水合三氯化鐵，甲醇，乙酸乙酯，乙醇，香草醛，葡萄糖，石油醚，福林試劑，硫酸亞鐵，冰醋酸，丙酮，膽固醇，蘆丁，熊果酸，沒食子酸，硫酸，磷酸，二甲基亞砜，鹽酸，無水三氯化鋁，苯酚，磷酸鹽緩沖液，兩性酶素，MTT，胰蛋白酶。

1.4 試劑配制

(1)磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：分別稱取KH2PO40.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，用超純水溶解攪拌并定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，室溫保存。

(2)培養(yǎng)基：取滅菌后的帶刻度的玻璃瓶，倒入RPMI-1640培養(yǎng)基，然后加入10%的胎牛血清，0.1%的兩性酶素，1%的青霉素和鏈霉素，搖勻存放冰箱待用。

(3)MTT溶液：避光稱取MTT粉末25 mg于10 mL離心管中，加入5 mL無菌PBS溶解，即配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4℃避光保存，一星期內(nèi)用完，使用時用無酚紅無血清的培養(yǎng)基稀釋到0.5 mg/mL。

2 實驗方法

2.1 海藻活性物質(zhì)的提取

分別稱取100 g樣品，每種樣品分別用石油醚、乙酸乙酯、75%乙醇提取四次，提取條件：料液比(W/V)1∶10，水浴50℃，攪拌機攪拌1 h。合并同一種海藻同一種溶劑的提取液，減壓濃縮除去溶劑至少量體積。再轉(zhuǎn)移至已知重量的小培養(yǎng)皿中，減壓真空-40℃干燥或者冷凍干燥至恒重，稱量，從而得到12種海藻粗提物，做好標記，置于-20℃冰箱保存。12種海藻粗提物分別為紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、紫菜75%乙醇提取物、江蘺石油醚提取物、江蘺乙酸乙酯提取物、江蘺75%乙醇提取物、海帶石油醚提取物、海帶乙酸乙酯提取物、海帶75%乙醇提取物、滸苔石油醚提取物、滸苔乙酸乙酯提取物、滸苔75%乙醇提取物。將12種海藻粗提物放入-80℃冰箱冷凍后，取出12種海藻粗提物冷凍干燥24 h后，確保海藻粗提物足夠干燥。將干燥后培養(yǎng)皿的總質(zhì)量扣除干燥前培養(yǎng)皿的質(zhì)量計算得出粗提物的質(zhì)量，并計算出提取率。

其中，η表示提取率，α表示所得到提取物質(zhì)量，β表示原料質(zhì)量。

2.2 細胞的培養(yǎng)

(1)細胞復蘇：從液氮盒中取出所需細胞凍存管，迅速置于37℃水浴解凍，并不斷搖動使管內(nèi)液體盡快溶解。用酒精棉球擦拭凍存管外壁，在超凈工作臺內(nèi)將凍存液轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，2 000 r/min離心 5 min,小心吸棄上清液，向離心管內(nèi)加1 mL的培養(yǎng)基吹打成細胞懸液。取新的細胞培養(yǎng)瓶，加入4 mL的培養(yǎng)基，然后用移液槍吸取細胞懸液，加入到細胞培養(yǎng)瓶，并標注。搖勻，放入37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)箱中適當擰松一點瓶口后，觀察細胞生長狀態(tài)并及時換液[9-10]。

(2)細胞保種：當細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80%～90%面積時即可保種。用PBS洗滌2次，加入含1.5 mL胰蛋白酶消化，觀察細胞形態(tài)，當細胞分散變圓時，吸棄胰酶，加1.5 mL培養(yǎng)基終止消化。用滴管將細胞吹打均勻，取2 mL離心管，2 000 r/min離心5 min,小心吸棄上清液，向兩離心管內(nèi)加1 mL的培養(yǎng)基吹打成細胞懸液。分裝至凍存管(每管1 mL)，再加入DMSO 0.1 mL，-80℃保存過夜，最后放于液氮罐中長期保存，做好記錄。

(3)換液：吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次，加入5 mL新鮮培養(yǎng)基。

(4)傳代：一般當細胞覆蓋培養(yǎng)瓶底80%～90%面積時即可傳代，吸棄舊培養(yǎng)基，加2 mL PBS輕蕩洗滌2次。加入1 mL 含0.05% EDTA-2Na的0.25%胰蛋白酶，于倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓間隙變大，細胞之間不再連接成片時即可吸棄胰酶，加入新鮮培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打至形成單細胞懸液，將細胞液分裝到2～3個細胞瓶中，補加培養(yǎng)基至5 mL，搖勻，放培養(yǎng)箱37℃，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 海藻提取物抑制腫瘤細胞增殖活性評價

2.3.1 海藻提取物母液的制備

取提取的12種海藻粗提物分別稱取0.01 g,加入0.1 mL DMSO中配成質(zhì)量濃度為100 mg/mL的藥物母液，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，保存在冰箱中備用。

2.3.2 MTT法檢測海藻提取物對MCF-7細胞的生長抑制作用

(1)取生長狀態(tài)良好的處對數(shù)生長期的各種細胞，接種于96孔板中，每孔100 μL，5 000～10 000個細胞，培養(yǎng)12 h。

(2)用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基藥物母液分別稀釋成1 000 μg/mL、500 μg/mL、250 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL 5個質(zhì)量濃度。

(3)吸棄舊培養(yǎng)基，加入100 μL不同濃度梯度的含藥培養(yǎng)基作為實驗組，同時設不含藥物的空白對照組、不含藥物與細胞的調(diào)零孔。每實驗組設5個復孔，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。

(4)吸棄藥液，PBS輕洗，吸棄，每孔加入100 μL MTT溶液(溶于無血清無酚紅培養(yǎng)基中，終濃度0.5 mg/mL)，37℃反應4 h。

(5)吸棄含MTT的培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，室溫輕微震蕩10 min，置酶標儀于570 nm測吸光度OD值。

3 結(jié)果與討論

3.1 海藻提取物得率

用3種不同的溶劑分別對4種海藻粉各100 g進行提取，共得到12種海藻提取物，得率詳見表1。

表1 海藻提取物的質(zhì)量和得率

由表1四種海藻得率分析可見，3種溶劑提取物得率依次為海帶、江蘺、滸苔和紫菜。從3種溶劑分析可見，75%乙醇提取物得率是最多的，均在10%以上，其次是石油醚提取物，在1%～2%之間，而乙酸乙酯提取物最少，均低于1%。

3.2 海藻提取物抑制腫瘤細胞增殖活性評價

供實驗用的細胞株為人乳腺癌細胞MCF-7，每孔細胞為4 000到10 000個，利用前文2.3.2的方法，即MTT比色法，測出其吸光值，計算得到其對人乳腺癌細胞MCF-7的生長抑制率。按12種海藻粗提物，5個濃度梯度進行試驗，結(jié)果如表2。

表2 海藻提取物對腫瘤細胞MCF-7的生長抑制率

由表2，12種海藻提取物對人乳腺癌細胞MCF-7均有一定的抑制作用，其中紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、江蘺石油醚提取物、海帶石油醚提取物、滸苔石油醚提取物、滸苔乙酸乙酯提取物在濃度為1 000 μg/mL時，生長抑制率達80%以上。而江蘺乙酸乙酯提取物生長抑制率最高時的濃度為500 μg/mL，從四種海藻的不同溶劑的提取物來看，四種海藻的石油醚提取和乙酸乙酯提取物均有較好地抑制腫瘤細胞生長的作用，而75%乙醇的提取物中，除滸苔75%乙醇提取物外，其余提取物的最高生長抑制率均在40%以下。從12種提取物來看，提取物的濃度升高與生長抑制率升高呈線性，對于抑制人乳腺癌細胞MCF-7效果較好的是紫菜石油醚提取物和滸苔石油醚提取物。

4 結(jié)論

采用石油醚、乙酸乙酯和75%的乙醇分別從四種海藻中提取得到12種粗提物對人乳腺癌細胞MCF-7增殖均有一定的抑制作用，紫菜石油醚提取物、紫菜乙酸乙酯提取物、江蘺石油醚提取物、海帶石油醚提取物、滸苔石油醚提取物效果較明顯，其最高的生長抑制率均在80%以上，紫菜75%乙醇提取物、江蘺75%乙醇提取物和海帶75%乙醇提取物的效果最差，均在40%以下。從四種海藻提取物分析可知，抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖效果由高至低依次是滸苔、紫菜、海帶和江蘺，這四種海藻粗提物濃度為1 000 μg/mL時，三種溶劑提取物的平均生長抑制率為：86.684%、72.904%、61.078 %和 58.323%。從三種不同的溶劑分析可見，其提取物抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖的作用效果依次為石油醚提取物、乙酸乙酯提取物和75%乙醇提取物。

海洋獨特的環(huán)境使得海洋生物具有一些自身特別的物質(zhì)，從分析可知四種海藻提取物抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖效果依次為滸苔、紫菜、海帶和江蘺。后續(xù)有望從以上四種海藻中找到作用效果好、副作用小的天然海洋抗癌藥物。