周 密，陸 瑤，劉惠霞，陳明惠 ，鄭梅竹

(1.長(zhǎng)春師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130032；2.長(zhǎng)春師范大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130032)

腦卒中(Stroke)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，有較高的發(fā)病率、致殘率和致死率[1-2]。特征是氧氣供應(yīng)不足和血流恢復(fù)受阻，腦內(nèi)神經(jīng)元因缺血再灌注損傷而突然死亡。腦卒中與氧化應(yīng)激、Ca2+超載、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)元興奮毒性和能量代謝失衡等多種病理過程緊密相關(guān)[3-6]。這些情況相互作用和重疊，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的持續(xù)性神經(jīng)功能障礙。中風(fēng)發(fā)生時(shí)，腦內(nèi)的血液供應(yīng)出現(xiàn)阻礙或出血，導(dǎo)致大腦功能迅速喪失，造成腦內(nèi)神經(jīng)元的不可逆轉(zhuǎn)性損傷。

PC12細(xì)胞來源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，具有類似神經(jīng)細(xì)胞的特性，被廣泛應(yīng)用于體外神經(jīng)系統(tǒng)損傷研究[7]。連二亞硫酸鈉是一種氧結(jié)合劑，加入液體培養(yǎng)基中可以短時(shí)間內(nèi)結(jié)合培養(yǎng)基中的氧氣，造成細(xì)胞低張性缺氧，且操作簡(jiǎn)單、起效快，安全穩(wěn)定，能夠準(zhǔn)確反映體內(nèi)細(xì)胞的缺血缺氧損傷情況[8]。到目前為止，腦卒中的治療策略仍是有限的。本文利用PC12細(xì)胞建立細(xì)胞模型，采用化學(xué)性缺氧，在培養(yǎng)基中加入連二亞硫酸鈉(Na2S2O4),旨在探討天然產(chǎn)物射干中鳶尾甲苷B (Iristectorin B)對(duì)氧糖剝奪(OGD)以及復(fù)氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

1.1.1 藥品

PC12細(xì)胞株(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)；鳶尾甲苷B(上海源葉生物科技有限公司)；依達(dá)拉奉(濟(jì)南中科化工有限公司)；胰蛋白酶、噻唑藍(lán)(MTT)(Sigma公司)。

1.1.2 試劑

DMSO(Sigma公司)；DMEM培養(yǎng)基(Invitrogen公司)；胎牛血清(Gibco公司)；LDH檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、Ca2+檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.1.3 主要儀器

NIS-ELEMNT BR型圖像分析系統(tǒng)(日本Nikon)；EXL808型酶標(biāo)儀多功能細(xì)胞讀板器(美國(guó)伯騰)； Olympus BX51光學(xué)顯微鏡(日本Olympus)。

1.2 PC12細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、含1%的青霉素和鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中,5% CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)約3～4 d。待PC12細(xì)胞生長(zhǎng)到貼壁約70%～80%時(shí)用0.25 %的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。將其制成細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×105個(gè)/L的細(xì)胞懸液后，以每孔100 μL為準(zhǔn)接種于96孔板, 繼續(xù)于5% CO2、37℃條件下培養(yǎng)1～2 d ,待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%即可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)離體腦卒中模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

為探究天然異黃酮鳶尾甲苷B對(duì)OGD/R處理損傷后PC12的保護(hù)作用，將上述處理后的PC12細(xì)胞分為：模型組(M)：加入含10 mmol/L Na2S2O4的無糖EBSS溶液100 μL，作用2 h，換為正常培養(yǎng)基復(fù)氧，繼續(xù)培養(yǎng)24 h構(gòu)成誘導(dǎo)OGD/R損傷模型，以模擬缺血性腦損傷。對(duì)照組(C)：不經(jīng)OGD/R損傷處理。藥物組(分別為處理D、Z、G)：在OGD/R的基礎(chǔ)上分別加含鳶尾甲苷B 6.25、12.5、25 μg/mL的正常培養(yǎng)液復(fù)氧 24 h。陽性組(Y)：在OGD/R的基礎(chǔ)上加10 mmol/kg依達(dá)拉奉作為陽性對(duì)照。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)及方法

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察

加入處理因素，繼續(xù)37℃孵育48 h后, 在倒置顯微鏡下觀察上述處理組的PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變情況。

1.4.2 MTT法測(cè)細(xì)胞活性

藥物作用結(jié)束后，在避光條件下，每孔加入10 μL質(zhì)量濃度為5 g/L的MTT于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，5% CO2、37℃條件下繼續(xù)孵育3～4 h后棄去上清，每孔加入100 μL DMSO，低速振蕩10～15 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處各孔的吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.3 PC12細(xì)胞中Ca2+含量檢測(cè)

藥物作用結(jié)束后，用裝載2.5 μmol/L Fluo-3AM熒光探針的培養(yǎng)液與細(xì)胞在5% CO2、37℃條件下繼續(xù)孵育1 h，經(jīng)過適當(dāng)洗滌后，利用熒光顯微鏡觀察鈣離子產(chǎn)生的熒光，并用酶標(biāo)儀檢測(cè)，波長(zhǎng)分別為488 nm和530 nm。同時(shí)，為排除細(xì)胞密度的影響，后續(xù)做MTT使細(xì)胞密度歸一化后，計(jì)算最終PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。

其中，H為Ca2+含量，A為每孔鈣離子檢測(cè)值，O為相應(yīng)孔MTT吸光度，B為每一個(gè)處理組MTT平均值。

1.4.4 PC12細(xì)胞中LDH釋放量檢測(cè)

藥物作用結(jié)束后，根據(jù)LDH測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行PC12細(xì)胞內(nèi)釋放量測(cè)定，依據(jù)LDH釋放率的高低來評(píng)價(jià)PC12細(xì)胞的損傷程度。

其中，D為L(zhǎng)DH釋放率(%)，M為樣品上清液LDH活性，C為細(xì)胞最大LDH活性。

1.4.5 PC12細(xì)胞中ROS水平檢測(cè)

藥物作用結(jié)束后，用裝載10 μmol/L DCFH-DA探針的無血清培養(yǎng)液與細(xì)胞在5% CO2、37℃條件下繼續(xù)孵育20 min，經(jīng)過無血清培養(yǎng)液適當(dāng)洗滌后,借助酶標(biāo)儀對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算方式與上述Ca2+含量的計(jì)算方式相同。

1.4.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

藥物作用結(jié)束后，利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(其中Annexin V-FITC為異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白，PI為碘化丙啶)并通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞的凋亡情況。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用t檢驗(yàn)確定顯著性水平，若P<0.05，則具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

PC12細(xì)胞經(jīng)Na2S2O4處理2 h后，于倒置顯微鏡下可見模型組的細(xì)胞損傷，與對(duì)照組相比細(xì)胞突觸減少，形態(tài)固縮成圓形，細(xì)胞數(shù)量顯著降低(圖1 a,b)。當(dāng)鳶尾甲苷B或者依達(dá)拉奉存在時(shí), 細(xì)胞恢復(fù)原有形態(tài),細(xì)胞損傷有所改善，活細(xì)胞數(shù)目增多(圖1 c,d,e,f)。

(a)處理C (b)處理M (c)處理Y

(d)處理D (e)處理Z (f)處理G圖1 各組PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

2.2 鳶尾甲苷B對(duì)細(xì)胞存活率影響

如圖2所示，模型組PC12細(xì)胞存活率明顯低于正常細(xì)胞組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 12.5 μg/mL、25 μg/mL劑量組細(xì)胞存活率有明顯提高(P<0.01)。圖中,**表示與正常組細(xì)胞比較，P<0.01;#表示與模型組比較，P<0.05;##表示與模型組比較，P<0.01。下同。

2.3 鳶尾甲苷B對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量影響

如圖3所示，模型組PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量明顯高于正常細(xì)胞組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 25 μg/mL 劑量組Ca2+含量有所降低(P<0.01)。

圖2 鳶尾甲苷B對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響 圖3 鳶尾甲苷B對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 含量的影響

2.4 鳶尾甲苷B對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量影響

如圖4結(jié)果顯示，模型組LDH釋放量明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL劑量組LDH釋放量明顯降低(P<0.05，P<0.05，P<0.01)。

2.5 鳶尾甲苷B對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響

如圖5結(jié)果顯示，模型組ROS水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)；與模型組比較，鳶尾甲苷B 12.5 μg/mL、25 μg/mL劑量組ROS水平明顯降低(P<0.01)。

圖4 鳶尾甲苷B對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)LDH釋放 圖5 鳶尾甲苷B對(duì)PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

2.6 鳶尾甲苷B對(duì)細(xì)胞凋亡影響

如圖6流式細(xì)胞凋亡圖和圖7結(jié)果顯示，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為3.6%，模型組的細(xì)胞凋亡率為 22.17%，經(jīng)過OGD/R后，PC12細(xì)胞凋亡比例明顯高于對(duì)照組。鳶尾甲苷B 6.25 μg/mL處理組細(xì)胞凋亡率為14.89%，12.5 μg/mL處理組細(xì)胞凋亡率為9.5%，25 μg/mL處理組細(xì)胞凋亡率為7.77%，依達(dá)拉奉陽性處理組細(xì)胞凋亡率為6.35%，藥物組和陽性組與上述兩組相比細(xì)胞凋亡率有顯著降低。

(a)處理C (b)處理M (c)處理Y

(d)處理D (e)處理Z (f)處理G圖6 不同濃度鳶尾甲苷B作用后的流式細(xì)胞凋亡圖

圖7 不同濃度鳶尾甲苷B對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

腦卒中是一種嚴(yán)重危害人體健康的腦血管疾病，特征是發(fā)病率高、發(fā)病快、容易復(fù)發(fā)、高度致殘、嚴(yán)重時(shí)致死，是全球范圍內(nèi)重要的致死性疾病之一[9]。腦卒中發(fā)生時(shí)，腦部血管會(huì)突然破裂造成出血或者血管內(nèi)形成血栓阻塞血液流動(dòng)，從而引起腦內(nèi)神經(jīng)元損傷，隨后的缺血/再灌注(I/R)還將引發(fā)一系列的病理事件[10]，最終導(dǎo)致對(duì)腦組織和其他器官的不可逆轉(zhuǎn)損傷。卒中屬于難治愈性的腦部疾病，患者一般需要長(zhǎng)期服用藥物來控制病情，然而目前常用的腦保護(hù)藥物主要為合成藥物，如鈣拮抗劑、自由基清除劑等[11]，然而長(zhǎng)期服用合成類藥物可能對(duì)患者的代謝產(chǎn)生影響。天然藥物中有效成分的藥性相對(duì)平和，可能產(chǎn)生的副作用沒有很明顯，更適合患者長(zhǎng)期服用。因此，迫切需要開發(fā)對(duì)腦卒中有神經(jīng)保護(hù)作用的天然藥物。

天然藥物射干[12]中主要有效成分為異黃酮類，其在預(yù)防及治療心腦血管疾病方面具有一定重要作用[13]。其中鳶尾甲苷B(Iristectorin B)是射干中的主要活性成分之一，被認(rèn)為具有許多生物活性。已有研究表明，鳶尾甲苷B具有降低血脂、血糖，抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、提高免疫功能，增強(qiáng)抗感染能力等作用[14]，其在抗腦卒中具有潛在的研究?jī)r(jià)值，鳶尾甲苷B對(duì)腦卒中保護(hù)作用有待進(jìn)一步研究。

在研究腦卒中離體實(shí)驗(yàn)中，多用PC12細(xì)胞建立細(xì)胞模型。PC12細(xì)胞來源于大鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，由于與中腦多巴胺神經(jīng)元的共同特征，具有類似神經(jīng)細(xì)胞的特性，被廣泛應(yīng)用于體外神經(jīng)系統(tǒng)損傷研究[15]。腦卒中發(fā)生會(huì)引起大量神經(jīng)元凋亡，Ca2+超載，LDH、ROS釋放量增加等情況都與細(xì)胞凋亡[16]過程息息相關(guān)，造成腦細(xì)胞功能障礙及形態(tài)學(xué)破壞。研究結(jié)果表明，鳶尾甲苷B能顯著提高細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞凋亡數(shù)目，降低細(xì)胞中Ca2+、LDH、ROS的表達(dá)水平。目前有關(guān)鳶尾甲苷B抗腦卒中及其機(jī)制的研究還未見報(bào)道，本研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究天然藥物黃酮類化合物的抗腦卒中機(jī)制以及發(fā)生發(fā)展提供了新的參考價(jià)值。