席佳越， 張東旭， 聶慧芳， 劉雪英， 李曉曄

(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué) 藥物化學(xué)與藥物分析學(xué)教研室， 西安 710032)

0 引 言

2018年，時(shí)任教育部部長陳寶生在教育部高等學(xué)校教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)成立會(huì)議上強(qiáng)調(diào)：“要把本科教育放在人才培養(yǎng)的核心地位、教育教學(xué)的基礎(chǔ)地位、新時(shí)代教育發(fā)展的前沿地位。要深入學(xué)習(xí)貫徹全國教育大會(huì)精神，全面振興本科教育”。2020年全國教育工作會(huì)議上，再次強(qiáng)調(diào)，把本科教育抓落實(shí)[1]。

抓好本科教育，就應(yīng)全面改革教學(xué)方法、優(yōu)化課程建設(shè)，理論與實(shí)踐并行，做到與時(shí)俱進(jìn)。但當(dāng)下的本科教育，多出現(xiàn)“重理論、輕實(shí)踐”的現(xiàn)象，因此，實(shí)驗(yàn)教學(xué)成為不可忽視的一環(huán)。為了提高我系實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量，一方面豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，剔除陳舊實(shí)驗(yàn)，增加創(chuàng)新探索實(shí)驗(yàn)，做到學(xué)科交叉；另一方面，將科研常用技術(shù)引入實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，去培養(yǎng)學(xué)生的科研思維和綜合能力。以藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課為例，藥物化學(xué)作為藥學(xué)領(lǐng)域橋梁學(xué)科，是以無機(jī)化學(xué)、有機(jī)化學(xué)為基礎(chǔ)，同時(shí)融合細(xì)胞生物學(xué)等生命學(xué)科的綜合性交叉學(xué)科，而藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)作為理論課的補(bǔ)充與延伸，不光要重視學(xué)生合成能力的培養(yǎng)，更應(yīng)該培養(yǎng)他們樹立藥物設(shè)計(jì)基于靶點(diǎn)的觀念[2-3]。

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(Computer Aided Drug Design，CADD)是隨著分子生物學(xué)、X射線晶體學(xué)的大力發(fā)展，計(jì)算機(jī)科學(xué)的迅速崛起而產(chǎn)生的[4-5]。CADD是以計(jì)算機(jī)化學(xué)為基礎(chǔ)，通過計(jì)算機(jī)模擬、計(jì)算和預(yù)測小分子與生物大分子間的關(guān)系，從而設(shè)計(jì)和優(yōu)化先導(dǎo)化合物的方法[6]。運(yùn)用CADD，美國科研人員開發(fā)的新化合物能更好地維持對耐藥HIV突變株的抵抗性[4,7]；運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，北京中醫(yī)藥大學(xué)探究出射麻口服液治療新型冠狀病毒的作用機(jī)制[8]。運(yùn)用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)，可以大大加速新藥研發(fā)進(jìn)程，提高藥物研發(fā)的成功率、縮短新藥研發(fā)周期和降低成本。如今，隨著這項(xiàng)技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，它已成為藥學(xué)、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、計(jì)算機(jī)學(xué)等科教人員必備的技能之一。分子對接技術(shù)作為藥物設(shè)計(jì)的核心[4]，是一種模擬生物大分子與配體小分子結(jié)合及結(jié)合強(qiáng)度的計(jì)算，通過分子對接的方式，評價(jià)配體小分子與受體的生物活性[9]。鑒于此，本教研室對藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)課進(jìn)行改革，將分子對接技術(shù)引入2018級藥學(xué)四年制本科生實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中去，通過學(xué)習(xí)分子對接軟件，模擬藥物與靶點(diǎn)的相互作用，更進(jìn)一步加強(qiáng)學(xué)生對藥物化學(xué)理論課的學(xué)習(xí)與鞏固，全方面提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)綜合素養(yǎng)。

1 分子對接專題——以環(huán)氧化酶(COX)對接為例

1.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h3>

(1) 熟悉Protein databank數(shù)據(jù)庫的使用；

(2) 掌握CDOCKER對接方法與流程，能分析出蛋白與小分子間的作用力；

(3) 了解COX酶蛋白結(jié)構(gòu)。

1.2 實(shí)驗(yàn)原理

分子對接是藥物設(shè)計(jì)的重要方法之一，其本質(zhì)是兩個(gè)或多個(gè)分子之間的識別過程，涉及分子之間的空間匹配和能量匹配，最終找到最佳的結(jié)合模式。

分子對接最初思想起源于Fisher E.的“鎖和鑰匙模型”，該理論認(rèn)為“鎖”和“鑰匙”相互識別的首要條件是它們在空間形狀上要互相匹配。然而，配體和受體分子之間的識別要比“鎖和鑰匙”模型復(fù)雜得多。首先，配體和受體分子的構(gòu)象是變化的，而不是剛性的。配體和受體在識別過程中會(huì)互相適應(yīng)對方的結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到更完美的匹配。其次，分子對接不但要滿足空間形狀的匹配，還要滿足能量的匹配，這就衍生出目前常用的“誘導(dǎo)契合”理論[10](見圖1)。

(a) 鎖鑰模型

分子對接常用的方法有3種：剛性對接、半柔性對接和柔性對接(見表1)[11]。常用的軟件有：CDOCKER(Discovery Studio)、GOLD、AutoDock、Glide(Maestro)等。而本實(shí)驗(yàn)采用CDOCKER半柔性對接方法完成對接。

非甾體抗炎藥中涉及到一個(gè)重要的靶點(diǎn)就是環(huán)氧化酶(COX酶)，COX酶包含COX-1和COX-2，二者在氨基酸系列上有60%的同源性。在結(jié)構(gòu)上，COX-1與COX-2都在通道一側(cè)的120位存在一個(gè)極性較大、可與藥物分子建立氫鍵結(jié)合的精氨酸(Arg)殘基；在通道另一側(cè)的523位，COX-1是異亮氨酸(Ile)殘基，COX-2則為纈氨酸(Val)殘基。由于纈氨酸的分子小于異亮氨酸，因而在其旁邊留下一點(diǎn)空隙，稱為側(cè)袋，具有某種特殊結(jié)構(gòu)的藥物分子可與之結(jié)合。在通道開口處的513位，COX-1為組氨酸，COX-2是柔性更好的精氨酸[12](見圖2)。

圖2 COX-1、COX-2蛋白結(jié)構(gòu)上的差異

以上了解了COX-1/2蛋白結(jié)構(gòu)的差異，正是由于COX-2蛋白側(cè)袋的出現(xiàn)，為COX-2選擇性抑制劑的發(fā)現(xiàn)提供可能?？梢酝ㄟ^分子對接的手段，模擬抑制劑與蛋白間的作用，分析出它們的最佳結(jié)合模式及關(guān)鍵作用力，發(fā)現(xiàn)療效更好、毒副作用更低的COX酶抑制劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

使用Discovery Studio 2016軟件中的CDOCKER，分別完成氟比洛芬、塞來昔布同COX-1(PDB：3N8Z)[13]、COX-2(PDB：1CX2)[14]的對接任務(wù)，分析其相互作用結(jié)合模式。

(1) 實(shí)驗(yàn)流程。分子對接主要運(yùn)用Discovery Studio軟件中的CDOCKER模塊來完成，包括：蛋白準(zhǔn)備、配體小分子準(zhǔn)備和分子對接，具體操作流程如圖3所示。

(2) 蛋白活性位點(diǎn)定義。蛋白結(jié)合位點(diǎn)的確定對于分子對接結(jié)果準(zhǔn)確性的影響很大，因?yàn)榕潴w分子與受體相互作用過程的模擬主要是參考結(jié)合位點(diǎn)的幾何特征進(jìn)行的。

產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn)的方法：① 以原配體的位置為中心產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn)；② 參考文獻(xiàn)，以活性口袋周圍的關(guān)鍵殘基為中心產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn)；③ 根據(jù)活性口袋特征探測活性位點(diǎn)。

而在本次對接中，使用第①種方法產(chǎn)生結(jié)合位點(diǎn)，以PDB：3 N8Z中氟比洛芬所在區(qū)域定義為活性位點(diǎn)。

(3) 對接結(jié)果分析。完成分子對接后，要從兩方面去分析結(jié)果，① 要看打分函數(shù)(scoring function)，負(fù)責(zé)評估結(jié)合親和性以及配體位置擺放的合理性[15]，-CDOCKER Energy，它的絕對值越大越好，但打分值不是判斷結(jié)合好壞的唯一標(biāo)準(zhǔn)；② 還應(yīng)關(guān)注每個(gè)配體構(gòu)象在蛋白中的空間位置、取向及同蛋白的相互作用力。

圖3 分子對接實(shí)驗(yàn)操作流程

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

COX-1抑制劑氟比洛芬產(chǎn)生的10個(gè)構(gòu)象中，第1個(gè)構(gòu)象打分值最高，并且氟比洛芬中的羧基與Arg120形成鹽橋，與Tyr355形成氫鍵作用力，遠(yuǎn)端的芳環(huán)與Gly526、Ala527形成范德華力，與Tyr385產(chǎn)生Pi-Pi作用力，使分子穩(wěn)定存在蛋白中。而它的第2個(gè)構(gòu)象因?yàn)轸然恢玫母淖儯瑔适Я送珹rg120和Tyr355的作用力，因此第1構(gòu)象是最優(yōu)構(gòu)象，正是在這樣的構(gòu)象下，發(fā)揮活性來抑制COX酶[見圖4(a)]。

COX-2抑制劑塞來昔布的對接結(jié)果[見圖4(b)]。分析可得：塞來昔布中甲苯基位于Phe381、Leu384、Tyr385、Trp387、Phe513和Ser530形成的疏水口袋中；三氟甲基位于Met113、Val116、Val349、Tyr355等形成的口袋中。而塞來昔布具有COX-2選擇性是因?yàn)楸交酋０坊鶊F(tuán)的存在，它好伸入COX-2蛋白的側(cè)袋中，使得磺胺基團(tuán)中的1個(gè)氧原子與Arg513形成氫鍵，另1個(gè)氧原子與His90形成氫鍵，而氮原子與Phe518形成氫鍵作用力。

因此，COX-2蛋白側(cè)袋的存在，是發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑的關(guān)鍵所在。

2 教學(xué)討論

在以往的藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中，均為基礎(chǔ)性合成實(shí)驗(yàn)，從未涉及到計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的內(nèi)容，實(shí)驗(yàn)內(nèi)容較為單一。而首次在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中引入分子對接，一方面豐富了藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，使實(shí)驗(yàn)不單單涉及化合物的合成，還涉及到藥物靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及虛擬驗(yàn)證，學(xué)生能清楚地理解如何通過蛋白結(jié)構(gòu)的不同設(shè)計(jì)出選擇性抑制劑，從而強(qiáng)化靶點(diǎn)在藥物設(shè)計(jì)中的重要性；另一方面，分子對接技術(shù)是對藥物化學(xué)理論課知識體系的延伸，學(xué)生能更好地理解藥物發(fā)現(xiàn)的全過程，是對學(xué)生綜合能力的培養(yǎng)，創(chuàng)新能力的提升。

在本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中，學(xué)生課下查閱文獻(xiàn)了解COX酶及亞型結(jié)構(gòu)特征，觀看教師提前錄制好的對接視頻，對分子對接軟件界面、操作步驟有大體了解，在通過課上操作演示，讓學(xué)生掌握分子對接軟件使用，直觀地理解小分子藥物是如何與受體大分子進(jìn)行識別并發(fā)揮作用。

在實(shí)驗(yàn)實(shí)施過程中，有以下問題：① 課時(shí)受限，學(xué)生對計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)、相關(guān)軟件比較陌生，在剛開始接觸的時(shí)候，學(xué)得比較吃力；② 在進(jìn)行演示操作流程時(shí)，學(xué)生能聽明白，但自行上機(jī)完成對接內(nèi)容時(shí)，卻無從下手，不知該如何進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因此，在以后的實(shí)施中，可提前將計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)內(nèi)容和軟件內(nèi)容介紹錄制成微視頻，發(fā)放到學(xué)習(xí)通上，讓學(xué)生提前預(yù)習(xí)。課上，通過實(shí)時(shí)屏幕共享，學(xué)生緊跟每一步操作。課后，開放智慧教室平臺，學(xué)生通過預(yù)約，進(jìn)入智慧教室自行完成對接任務(wù)，真正做到懂操作、會(huì)操作。

3 結(jié) 語

分子對接技術(shù)的引入作為藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容改革的首次嘗試，是為了讓學(xué)生理解并樹立“結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)，性質(zhì)決定功能” 的觀念，更是為了讓實(shí)驗(yàn)與科研接軌，通過了解熟悉新技術(shù)，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)的熱情，為日后的科研工作打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。教師唯有不斷地學(xué)習(xí)新知識、新技術(shù)，不斷地創(chuàng)新改革，才能真正培養(yǎng)出具有創(chuàng)新意識、團(tuán)隊(duì)意識的高素質(zhì)藥學(xué)人才。