賈 莉, 馬鍇果, 趙 浩, 耿金靈, 朱志偉

(北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，化學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，北京 100871)

0 引 言

熒光分析技術(shù)在基礎(chǔ)研究和應(yīng)用領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用，其教學(xué)實(shí)驗(yàn)涉及內(nèi)容廣泛。眾多高校對(duì)熒光分析法實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)和實(shí)驗(yàn)內(nèi)容更新，結(jié)合新技術(shù)、新材料，以體現(xiàn)近期的科研進(jìn)展和研究熱點(diǎn)，開拓學(xué)生視野，培養(yǎng)和提高學(xué)生的綜合能力[1-2]。但此類實(shí)驗(yàn)面向低年級(jí)學(xué)生開設(shè)，由于學(xué)生理論知識(shí)欠缺，高度集成化的熒光光度計(jì)其重要部件被封閉在黑盒子里，學(xué)生在理解熒光光譜法基本概念、光度計(jì)結(jié)構(gòu)及工作原理方面存在很多困惑，實(shí)驗(yàn)過(guò)程基本停留在溶液配制、電腦程序操作和數(shù)據(jù)記錄水平上，實(shí)驗(yàn)積極性不高，教學(xué)效果不理想。這促使中心不得不重新考慮實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的設(shè)計(jì)。經(jīng)典實(shí)驗(yàn)在培養(yǎng)學(xué)生掌握基礎(chǔ)知識(shí)、基本操作技能、實(shí)驗(yàn)方法以及學(xué)生的科學(xué)思維和科學(xué)態(tài)度方面具有舉足輕重的地位，而且也符合學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律[3-4]。因此，在傳承經(jīng)典實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的基礎(chǔ)上，對(duì)傳統(tǒng)的熒光分析法實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式進(jìn)行創(chuàng)新，使其更好地面向低年級(jí)學(xué)生開設(shè)具有十分重要的意義[5-6]。

近年來(lái)，學(xué)生自己動(dòng)手組裝實(shí)驗(yàn)儀器并進(jìn)行儀器應(yīng)用拓展的教學(xué)模式，在提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)興趣、培養(yǎng)創(chuàng)新能力方面發(fā)揮了極其重要的作用[7-10]。目前，這種教學(xué)模式在國(guó)內(nèi)的熒光分析法實(shí)驗(yàn)教學(xué)中還未見相關(guān)報(bào)道。為此，實(shí)驗(yàn)通過(guò)利用發(fā)光二極管(LED)及樂高積木搭建簡(jiǎn)易熒光光度計(jì)，并應(yīng)用于硫酸奎寧的定量測(cè)定。通過(guò)有效的實(shí)驗(yàn)教學(xué)組織形式，將此實(shí)驗(yàn)?zāi)K引入到常規(guī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)，與經(jīng)典的熒光分析法實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“飲料中硫酸奎寧的定量測(cè)定”內(nèi)容相結(jié)合，利用其趣味性來(lái)拓展常規(guī)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)內(nèi)容。這種教學(xué)模式增加了學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣，促進(jìn)了學(xué)生理論與實(shí)踐的融會(huì)貫通。

1 儀器與試劑

儀器。樂高積木、萬(wàn)用表(UT61B)、面包板(SYB-130)、發(fā)光二極管(LED，355 nm)、Si-PIN光電二極管(400～1 100 nm，LSSPD-1.2，LSSPD-2.5，LSSPD-3.2，LSSPD-4.2)、電源模塊(2.8～5.5 V轉(zhuǎn) ±12 V)、運(yùn)算放大器(OP07CP)、面包板連接線、容量瓶(25 mL)、分度吸量管。

試劑?？鼘巸?chǔ)備液(100.0 μg/mL)，避光保存。使用時(shí)，以0.05 mol/L H2SO4溶液稀釋成10.0 μg/mL的工作液。

2 自制熒光光度計(jì)的設(shè)計(jì)和搭建

2.1 儀器設(shè)計(jì)思路

利用LED及樂高積木搭建的光度計(jì)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)，非常適合引入常規(guī)實(shí)驗(yàn)教學(xué)[11-15]?，F(xiàn)已報(bào)道的自制LED熒光光度計(jì)采用LED為檢測(cè)器，對(duì)光路的準(zhǔn)值性要求很高；以內(nèi)阻較大的伏特表為信號(hào)采集工具，實(shí)驗(yàn)成本高；簡(jiǎn)易的電路連接方式，測(cè)得的光電壓值較低，學(xué)生不易獲得測(cè)試數(shù)據(jù)[13]。這些缺點(diǎn)限制其在實(shí)際實(shí)驗(yàn)教學(xué)中應(yīng)用。因此，根據(jù)實(shí)際教學(xué)需求，對(duì)搭建熒光光度計(jì)所需部件及電路連接方式進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化，使學(xué)生能夠及時(shí)準(zhǔn)確地獲得測(cè)量數(shù)據(jù)，儀器的精密度和重復(fù)性滿足儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求的原則，將其引入熒光分析法實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

硫酸奎寧的最大激發(fā)波長(zhǎng)為350 nm，選擇355 nm的LED燈珠作為單色光源，取代商用熒光光度計(jì)中的光柵。檢測(cè)器的選擇是光度計(jì)性能優(yōu)劣關(guān)鍵。基于硅光電二極管在測(cè)量光信號(hào)時(shí)具有響應(yīng)快、線性好、靈敏度高、噪音小、性能穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)[16]，故搭建儀器時(shí)以硅光電二極管作為檢測(cè)器。根據(jù)硫酸奎寧的最大發(fā)射為450 nm，可選擇400～1 100 nm的Si-PIN光電二極管來(lái)實(shí)現(xiàn)光電檢測(cè)功能。萬(wàn)用表作為信號(hào)采集工具，其在精密度、可靠性方面具有良好性能，且降低了實(shí)驗(yàn)成本。在電路連接方面，采用放大電路可有效克服因光電壓值較低而不易獲得測(cè)試數(shù)據(jù)缺點(diǎn)[15]。

2.2 儀器搭建

儀器搭建時(shí)，將LED燈珠和Si-PIN光電二極管分別塞入已打好孔的樂高，并在背面用醫(yī)用膠帶固定，使兩者高度一致且處于垂直位置，再將四面透光的石英比色皿的底部用醫(yī)用膠帶固定在下層樂高上。自制熒光光度計(jì)實(shí)物連接圖(見圖1)，詳細(xì)電路連接方式見文獻(xiàn)[15]，其中Si-PIN光電二極管可以選擇不同的光敏面直徑。測(cè)定時(shí)，檢測(cè)器所測(cè)得的熒光強(qiáng)度與光電壓成正比。為避免外界光對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響，應(yīng)將比色皿四周用樂高進(jìn)行避光。

圖1 自制熒光光度計(jì)實(shí)物圖

3 自制熒光光度計(jì)用于硫酸奎寧定量測(cè)定的性能探究

3.1 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

(1) 線性范圍的確定。向一系列25 mL容量瓶中加入不同體積的奎寧儲(chǔ)備液或工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，配制一系列濃度為0.10～100.0 μg/mL的奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液。利用自制熒光光度計(jì)分別測(cè)試系列奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的光電壓值。以測(cè)量得到的光電壓V(mV)為熒光強(qiáng)度對(duì)奎寧的濃度c(μg/mL)進(jìn)行線性回歸，確定硫酸奎寧在什么濃度范圍內(nèi)與熒光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。向25 mL容量瓶中分別準(zhǔn)確加入0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL的10.0 μg/mL奎寧工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，分別利用自制熒光光度計(jì)依次測(cè)量溶液熒光產(chǎn)生的光電壓，擬合線性回歸方程，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。

(3) 檢測(cè)限的測(cè)定與計(jì)算。以0.05 mol/L H2SO4溶液為空白樣品分別測(cè)定10次，所產(chǎn)生的光電壓值按照式①計(jì)算自制熒光光度計(jì)的檢測(cè)限[17]。

Ck=3s/k

(1)

式中：Ck為方法檢測(cè)限；s為空白標(biāo)準(zhǔn)偏差；k為校準(zhǔn)曲線斜率。

(4) 重復(fù)性和準(zhǔn)確度測(cè)定。向25 mL容量瓶中用吸量管準(zhǔn)確移取0.75 mL的10.0 μg/mL奎寧工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，搖勻，作為待測(cè)溶液。利用自制熒光光度計(jì)對(duì)未知液連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)誤差。

3.2 數(shù)據(jù)與分析

(1) 線性范圍的確定。不同濃度硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定結(jié)果如圖2所示，從測(cè)試結(jié)果可以看出熒光強(qiáng)度隨硫酸奎寧濃度的增大而增加，當(dāng)硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度在0～10.0 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)與熒光強(qiáng)度呈線性關(guān)系。隨硫酸奎寧溶液濃度的增大，由于自淬滅使熒光強(qiáng)度與濃度偏離線性關(guān)系。

圖2 不同型號(hào)檢測(cè)器測(cè)定硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的光電壓-濃度線性關(guān)系

(2) 線性回歸分析及檢測(cè)限。利用自制熒光光度計(jì)分別測(cè)定不同濃度的硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光電壓，并繪制光電壓標(biāo)準(zhǔn)曲線。以奎寧濃度c為橫坐標(biāo)，測(cè)定的光電壓V為縱坐標(biāo)作圖，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別如圖3所示。從測(cè)定結(jié)果可以看出，在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，所測(cè)得的光電壓與奎寧濃度都有著良好的線性關(guān)系，表明自制熒光光度計(jì)可用來(lái)定量測(cè)定硫酸奎寧濃度。

(a) LSSPD-1.2型檢測(cè)器>

按照式(1)的方法計(jì)算可得到4種熒光光度計(jì)的檢測(cè)限，見表1。結(jié)果顯示，相較于光敏面直徑為1.2 mm的LSSPD-1.2 型Si-PIN光電二極管，其他3種光敏面積更大的檢測(cè)器所搭建的熒光光度計(jì)的檢測(cè)限更低且數(shù)值相當(dāng)。

表1 標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和檢測(cè)限(LOD)

(3) 重復(fù)性和準(zhǔn)確度。未知液中硫酸奎寧的實(shí)際濃度為0.30 μg/mL，利用不同型號(hào)檢測(cè)器測(cè)定未知液的6次測(cè)定結(jié)果見表2。根據(jù)測(cè)定未知液濃度的標(biāo)準(zhǔn)偏差可知，測(cè)試結(jié)果的重復(fù)性可以滿足教學(xué)需求，并且自制熒光光度計(jì)測(cè)試結(jié)果的相對(duì)誤差均在5%以內(nèi)，說(shuō)明測(cè)定結(jié)果是準(zhǔn)確、可靠，滿足儀器分析實(shí)驗(yàn)的基本要求。

表2 方法重復(fù)性和準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果(單位mg/L)

3.3 性能分析

通過(guò)對(duì)LED樂高型簡(jiǎn)易熒光光度計(jì)進(jìn)行改進(jìn)和完善，將其運(yùn)用于硫酸奎寧的定量測(cè)定，評(píng)價(jià)使用不同Si-PIN檢測(cè)器的測(cè)定效果，考察了方法的線性范圍和儀器的檢測(cè)限、重復(fù)性及準(zhǔn)確度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：熒光光度計(jì)的搭建過(guò)程簡(jiǎn)單，學(xué)生更易及時(shí)準(zhǔn)確地獲得測(cè)試結(jié)果。且4種不同型號(hào)檢測(cè)器所搭建的儀器性能均能滿足儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)需求，可較好地實(shí)現(xiàn)硫酸奎寧的定量測(cè)定，適合引入到實(shí)際教學(xué)。

4 教學(xué)模式

將熒光光度計(jì)搭建及定量測(cè)定硫酸奎寧性能探究的實(shí)驗(yàn)?zāi)K與常規(guī)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目“飲料中硫酸奎寧含量的測(cè)定”實(shí)驗(yàn)內(nèi)容相結(jié)合。實(shí)驗(yàn)為8學(xué)時(shí)，學(xué)生2人1組，合作完成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，注重教師的引導(dǎo)作用，開展不同層次的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

4.1 注重教師引導(dǎo)，逐步培養(yǎng)學(xué)生的探究實(shí)踐能力

在實(shí)際教學(xué)過(guò)程中，學(xué)生在完成常規(guī)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的基礎(chǔ)上，從儀器的搭建到應(yīng)用，全過(guò)程參與此實(shí)驗(yàn)?zāi)K。通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的訓(xùn)練，學(xué)生掌握了如何利用熒光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定，儀器的哪些性能會(huì)影響測(cè)試結(jié)果，儀器的使用需要注意哪些問(wèn)題等。學(xué)生掌握了相關(guān)的基本實(shí)驗(yàn)技能之后，再利用基本的電器元件搭建簡(jiǎn)易熒光光度計(jì)，加深學(xué)生對(duì)儀器結(jié)構(gòu)及工作原理的認(rèn)識(shí)。以探究型實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式開展自制儀器進(jìn)行硫酸奎寧定量測(cè)定的性能評(píng)價(jià)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，指導(dǎo)教師通過(guò)和學(xué)生一起對(duì)得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，討論這些數(shù)據(jù)能夠說(shuō)明哪些問(wèn)題，可以得到什么樣的結(jié)論，要得到這樣的結(jié)論還需要什么樣的實(shí)驗(yàn)來(lái)支持和驗(yàn)證等。在這個(gè)過(guò)程中，逐步培養(yǎng)學(xué)生分析判斷、邏輯推理、根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出實(shí)驗(yàn)結(jié)論的能力。

4.2 以學(xué)生為主，為學(xué)生提供充分發(fā)揮創(chuàng)造力和想象力的空間

基于自制熒光光度計(jì)具有很強(qiáng)的靈活性和直觀性，在課時(shí)允許的條件下，對(duì)那些學(xué)有余力，且熱情參與探究性實(shí)驗(yàn)的同學(xué)，可通過(guò)以下四個(gè)方面來(lái)豐富和拓展該自制儀器的應(yīng)用[13]。

(1) 自制熒光光度計(jì)有很強(qiáng)的開放性，通過(guò)改變LED光源和檢測(cè)器數(shù)量，如圖4所示，測(cè)定相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，探索熒光強(qiáng)度對(duì)儀器靈敏度的影響。

(2) 溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響較為靈敏，通過(guò)分別測(cè)定室溫及冰水浴冷卻后的奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，探索溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。

(3) 熒光淬滅的形式有很多，利用自制熒光光度計(jì)可以很直觀地觀察到不同形式的熒光淬滅現(xiàn)象，如：觀察低、中、高濃度奎寧溶液熒光的自淬滅現(xiàn)象，向奎寧溶液中加入不同濃度的NaCl溶液可以觀察到由于發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移反應(yīng)而產(chǎn)生的熒光淬滅現(xiàn)象等。

(4) 在光源照射下，向盛有硫酸奎寧的比色皿中加入液氮，可觀察到明顯的磷光現(xiàn)象。

(a)

5 教學(xué)效果

自制熒光光度計(jì)是教師針對(duì)教學(xué)的重點(diǎn)和需求，對(duì)已報(bào)道的儀器進(jìn)行改進(jìn)和完善的成果。學(xué)生設(shè)計(jì)的自制熒光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)具有可設(shè)計(jì)性、內(nèi)容靈活性和多樣性，非常適合應(yīng)用于熒光分析法實(shí)驗(yàn)教學(xué)。經(jīng)過(guò)1年的教學(xué)實(shí)踐，學(xué)生普遍反映通過(guò)搭建儀器，有助于更深刻地理解熒光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及工作原理；通過(guò)儀器性能探究，有助于將理論與實(shí)踐融會(huì)貫通，激發(fā)學(xué)習(xí)興趣，培養(yǎng)開發(fā)探索能力；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)的開展形式給予了學(xué)生極大的自由度和空間，有助于自主且創(chuàng)造性地完成實(shí)驗(yàn)并加以拓展。將自制儀器及應(yīng)用拓展與常規(guī)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的教學(xué)模式，是對(duì)知識(shí)的學(xué)習(xí)、運(yùn)用和鞏固，也是對(duì)傳統(tǒng)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式的突破和創(chuàng)新，使之更加適應(yīng)新的實(shí)驗(yàn)教學(xué)發(fā)展趨勢(shì)，更加豐富其內(nèi)涵。同時(shí)教師在設(shè)計(jì)和制作過(guò)程中也提高了自身專業(yè)水平，進(jìn)而促進(jìn)了教學(xué)質(zhì)量的提升。