李錦錦，唐善虎，李思寧，李瓊帥，莫然

(西南民族大學 食品科學與技術(shù)學院，四川 成都，610041)

牦牛雖然在肉牛中所占比例不大，但它卻是適應青藏髙原特殊生態(tài)環(huán)境下的優(yōu)勢畜種，與藏文化息息相關(guān)，是當?shù)啬撩褓囈陨婧桶l(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)，是西部牧區(qū)特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點，也是促進藏區(qū)穩(wěn)定和發(fā)展不可忽視的部分，具有不可替代性[1]。且牦牛肉的蛋白含量高于普通黃牛、豬肉、羊肉，屬于高蛋白肉品[1]。但是，由于肉類及其制品在加工貯藏過程中會不可避免受到溫度、氧氣和催化劑等外界因素的干擾[2]，因此牦牛肉在加工貯藏過程中容易發(fā)生蛋白氧化，從而導致肉品質(zhì)量下降。大蒜作為肉制品中常見的調(diào)味輔料，不僅可以起到去除肉腥味、增加肉品蒜香味的作用，而且在人和動物的飲食中，大蒜具有抗過敏和抗氧化等功能[3]。此外，雖然有研究證明了大蒜具有抑制蛋白氧化的能力，但這似乎取決于大蒜加工的方法以及肉類產(chǎn)品的類型[4-5]。大蒜一般以提取物、精油和粉末的形式應用于食品中。大蒜粉穩(wěn)定、易貯存，保留了大蒜中原始的多種成分，具有良好的工業(yè)實用性。但是大蒜粉在食品中應用的研究極少，蒜粉的作用效果受蒜粉生產(chǎn)工藝及肉制品種類的影響[4,6]。近年來，對大蒜成分的研究大部分集中于藥理作用和新鮮大蒜及大蒜制劑中的有機硫化物的定量研究[7]。目前尚未見大蒜粉中清除羥自由基活性成分的研究。

肌原纖維蛋白作為肌肉蛋白的主要組成部分，是影響肉嫩度和保水性的重要結(jié)構(gòu)蛋白，對肉制品的質(zhì)構(gòu)、風味及加工特性起決定性作用。但是一些天然蛋白質(zhì)由于易受加工過程中，微環(huán)境變化的影響，很少表現(xiàn)出能較好地滿足食品工業(yè)需求的理想功能特性[8-9]。在肉類加工和貯藏過程中，能誘發(fā)蛋白氧化的物質(zhì)有活性氧物質(zhì)、活性氮物質(zhì)以及脂肪氧化應激的二級產(chǎn)物等。其中羥自由基是活性氧自由基中氧化能力最強的自由基，羥自由基誘導的蛋白質(zhì)氧化是肉制品加工中最普遍的一種氧化體系[10]。本文通過HPLC-DPPH法測定大蒜粉中清除DPPH自由基的活性成分，對大蒜粉中抗氧化活性成分進行研究。通過測定不同添加量大蒜粉對處于Fenton體系中牦牛肉肌原纖維蛋白理化指標的影響，探討大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白體外氧化的保護作用，為研究大蒜粉作為食品天然抗氧化劑的作用機理，以及大蒜粉在肉制品中的應用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜為四川溫江紫皮獨頭蒜，四川省成都市武侯區(qū)洗面橋巷便民菜市場；牦牛肉為四川省阿壩州紅原縣自然放牧的3歲半健康無病公牦牛的背最長肌。

乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸[ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid，EGTA]、2,4-二硝基苯肼、8-苯胺萘磺-1-酸鹽[ammonium 8-(phenylamino)naphthalene-1-sulfonate xhydrate，ANS]、乙二胺四乙酸-二鈉、抗壞血酸(均為分析純)，成都科隆化學品有限公司；鹽酸胍、Tris(均為分析純)，德國BioFroxx公司；5,5-二硫基-2,2-二硝基苯甲酸、甘氨酸(均為分析純)，上海源葉生物有限公司；甲醇(色譜純)，成都市科隆化學品有限公司；DPPH(色譜純)上海思域化工科技有限公司；大蒜素(98%)、二烯丙基二硫醚(95%)、二烯丙基三硫醚標準品(98%)(均為色譜純)，上海源葉生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5804R冷凍離心機，德國Eppendorf公司；UV1810S紫外分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；T-25高速勻漿機，德國IKA公司；HH-6恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；PL303分析天平，梅特勒-托利多國際股份有限公司；LD510電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；F-4700型熒光分光光度計，日本那珂事務(wù)所；D-37520型真空冷凍干燥機，德國CHRiST公司；Agilent 1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 大蒜粉的制備

參考胡晗艷等[11]的方法，并稍作修改以制備大蒜粉。取去皮大蒜200 g，將大蒜與水按料液比1∶5打漿，漿液打至無肉眼可見顆粒。大蒜漿裝盤厚度為1.5 mm，-18 ℃下預凍12 h后真空冷凍干燥，凍干參數(shù)為-56 ℃，真空度0.8～1.86 hPa，時間20 h。將制得的大蒜粉裝于帶蓋棕色玻璃瓶中，于0～4 ℃環(huán)境貯存。

1.3.2 HPLC法測定大蒜粉的抗氧化成分

1.3.2.1 標準曲線的繪制

精密稱取大蒜素標準品20 mg，用甲醇溶液稀釋并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為800 μg/mL的大蒜素對照品儲備液，分別取1、2、4、6、10 mL的對照品儲備液用甲醇稀釋至10 mL，配制成0、80、160、320、480、800 μg/mL的標準工作液，過0.22 μm的有機濾膜，進行高效液相色譜分析。

二烯丙基二硫醚和三烯丙基二硫醚的標曲繪制方法同大蒜素。

1.3.2.2 HPLC參數(shù)設(shè)置

液相條件參考ESTEVINHO等[12]，并稍作修改。色譜柱：C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。流動相為甲醇-水溶液：0～10 min，甲醇體積分數(shù)為5%～17%；10～20 min，甲醇體積分數(shù)為17%～26%；20～40 min，甲醇體積分數(shù)為26%～58%；40～50 min，甲醇體積分數(shù)為58%～95%；50～60 min，甲醇體積分數(shù)為95%～5%。流速：1.0 mL/min，柱溫：40 ℃，檢測波長：320 nm，進樣量：20 μL。

1.3.2.3 樣品溶液的制備

將大蒜粉用甲醇溶液配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的樣品溶液。

1.3.2.4 HPLC-DPPH實驗

取一定質(zhì)量濃度的樣品甲醇溶液500 μL，加500 μL DPPH甲醇溶液(1.8 mg/mL)，作為實驗組，避光反應30 min；取一定質(zhì)量濃度的樣品甲醇溶液500 μL，加500 μL甲醇，作為空白組。將空白組和實驗組溶液過0.22 μm的有機濾膜后，在1.3.2.2中的液相參數(shù)下進行高效液相色譜分析。對主要的峰面積進行積分，根據(jù)峰面積的消減篩選出可能的抗氧化活性成分，以峰面積的消減率表示清除率，清除率按公式(1)計算：

(1)

式中：S1為空白組對應的吸收峰面積；S2為實驗組對應的吸收峰面積。

1.3.3 牦牛肉肌原纖維蛋白的提取

參考PARK等[13]的方法并略作修改。稱取300 g已剔除筋膜、脂肪的牦牛肉，加入4倍體積提取緩沖液(0.1 mol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EGTA，20 mmoL/L Na2HPO4，pH 7.0)，勻漿離心(4 ℃，2 500 r/min，15 min)，棄上清液，取沉淀重復上述步驟3遍。向最后一次沉淀中加入4倍體積的含0.1 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 6.2)并均質(zhì)處理。離心(4 ℃，2 500 r/min，15 min)移除上清液后，加入4倍體積磷酸鹽緩沖液(20 mmoL/，pH 6.0)并均質(zhì)。將均質(zhì)液用4層紗布過濾以除去結(jié)締組織，離心(4 ℃，2 500 r/min，15 min)后棄上清液，所得的沉淀即為肌原纖維蛋白樣品。提取的肌原纖維蛋白置于4 ℃并在12 h內(nèi)使用。

1.3.4 牦牛肉肌原纖維蛋白的氧化處理

參考李玲等[14]的方法并稍作修改構(gòu)建Fenton體系，反應過程：抗壞血酸+Fe3+→Fe2+；Fe2++H2O2→羥自由基。將提取的肌原纖維蛋白溶于磷酸鹽緩沖溶液(20 mmol/L，pH 7.0)中，以牛血清蛋白為標準，雙縮脲法測定蛋白濃度。在溶解后的蛋白質(zhì)溶液中依次加入FeCl3、抗壞血酸、H2O2溶液用來構(gòu)建氧化體系。整個體系最終含有以下成分：40 mg/mL牦牛肉肌原纖維蛋白、0.01 mmol/L的FeCl3、0.1 mmol/L的抗壞血酸和10 mmol/L H2O2，其中大蒜粉的質(zhì)量分數(shù)分別為0、0.2%、0.5%、1.0%、2.0%(以蛋白計)。在4 ℃恒溫環(huán)境中氧化12 h后，用乙二胺四乙酸-二鈉(1 mmol/L)終止氧化反應，并將終止反應后的肌原纖維蛋白漿4 ℃冷凍離心后備用(4 000 r/min，10 min)，所得沉淀即為氧化后的牦牛肉肌原纖維蛋白，貯藏于0～4 ℃，2 d 內(nèi)用完。以未加大蒜粉和氧化體系的肌原纖維蛋白組為空白對照。

1.3.5 羰基含量的測定

參考MERCIER等[15]的方法，并稍作修改進行測定。用含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)溶解氧化后的肌原纖維蛋白樣品，并用雙縮脲法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度至4 mg/mL。取1 mL 的蛋白溶液，加入1 mL的2,4-二硝基苯肼(10 mmol/L)，室溫下避光反應40 min，每隔5 min 振蕩混勻一次，反應后加入1 mL的200 g/L三氯乙酸溶液于4 ℃、12 000 r/min離心5 min。調(diào)零組加入1 mL 的2 mol/L HCl溶液，其余操作相同。移除上清液后，用1 mL乙醇-乙酸乙酯混合液(1∶1，體積比)洗滌沉淀以除去未反應的2,4-二硝基苯肼，隨后4 ℃、5 000 r/min離心5 min，上述洗滌過程重復3次后，將沉淀溶于3 mL鹽酸胍(6 mol/L)中，37 ℃保溫15 min 后離心(4 ℃，12 000 r/min，5 min)，取上清液于370 nm處測定溶液吸光度。蛋白質(zhì)羰基含量根據(jù)摩爾消光系數(shù)[22 000 L/(mol·cm)]按照公式(2)計算:

(2)

式中：A為樣品吸光值；C為蛋白提取液濃度，mg/mL；D為比色光徑，cm；22 000為摩爾消光系數(shù)；n為稀釋倍數(shù)，n=3。

1.3.6 二聚酪氨酸熒光值測定

參考ZHANG等[16]的方法，并稍作修改進行測定。用含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)將氧化后的肌原纖維蛋白濃度調(diào)至1 mg/mL，將調(diào)好的蛋白溶液離心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)后用熒光分光光度計測定上清液的熒光強度。激發(fā)波長為325 nm，發(fā)射波長為420 nm，狹縫寬度為10 nm，測定結(jié)果用熒光強度除以蛋白濃度，表示為相對熒光值。

1.3.7 總巰基含量的測定

參考YANG等[17]的方法測定。用含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液磷酸鹽緩沖溶液(20 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白稀釋為5 mg/mL，取1 mL稀釋的蛋白質(zhì)溶液和8 mL Tris-甘氨酸溶液(其中包括10.4 g/L Tris，0.9 g/L甘氨酸，1.2 g/L EDTA，8 mol/L尿素，pH 8.0)于離心管中。混勻后，冷凍離心15 min(10 000 r/min，4 ℃)，除去不溶性蛋白。然后準確量取上清液4.5 mL，加入0.5 mL 10 mol/L的5,5-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，混勻，在室溫下放置30 min后，在412 nm 處測定其吸光度。使用分子吸光系數(shù)13 600 L/(mol·cm)按照公式(3)計算蛋白中總巰基的含量:

(3)

式中：A為樣品吸光值；C為蛋白溶液質(zhì)量濃度,mg/mL；13 600為摩爾吸光系數(shù)，L/(mol·cm)；10為稀釋倍數(shù)。

1.3.8 表面疏水性的測定

參考ZHANG等[16]的方法，并稍作修改測定肌原纖維蛋白的表面疏水性的測定。用含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白調(diào)至不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL)。取4 mL 上述蛋白溶液與40 μL的ANS(8 mmol/L)在磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.0)中充分混合。立即使用熒光分光光度計在374 nm的激發(fā)波長和485 nm的發(fā)射波長，狹縫寬度為5 mm下測量ANS-蛋白結(jié)合物的相對熒光強度，同時測定樣品空白和試劑空白的熒光檢測，并從加入ANS的蛋白結(jié)合樣品中減去空白熒光。使用線性回歸分析從相對熒光強度對蛋白質(zhì)濃度的圖的初始斜率計算肌原纖維蛋白質(zhì)表面的疏水性，初始斜率表示為SoANS。

1.3.9 內(nèi)源色氨酸熒光的測定

參考CAO等[18]的方法，并稍作修改。用含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至0.1 mg/mL，用熒光分光計測量內(nèi)源色氨酸熒光。激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為290～400 nm激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均設(shè)為5 nm，數(shù)據(jù)采集速率為1 200 nm/min，記錄熒光發(fā)射光譜。記錄相同條件下的背景光譜，并從大蒜粉處理的肌原纖維蛋白樣品各自的光譜中減去背景光譜。

1.3.10 蛋白質(zhì)溶解性的測定

用含0.6 mol/L NaCl的磷酸鹽緩沖液(20 mmol/L，pH 7.0)將肌原纖維蛋白溶液調(diào)整至5 mg/mL，離心(4 ℃，5 000 r/min，20 min)后用雙縮脲法測定上清液的蛋白濃度，蛋白質(zhì)的溶解度按按照公式(4)計算：

(4)

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有指標平行測定3組，結(jié)果以平均值±標準差表示。用Excel 2016軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計與計算，用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行ANOVA方差分析，用Duncan多重比較對數(shù)據(jù)進行顯著性分析(P<0.05表示差異顯著)，使用Pearson相關(guān)性分析對大蒜粉添加量與肌原纖維蛋白各指標間相關(guān)性進行分析；利用Origin 2018軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜粉DPPH自由基清除活性

HPLC-DPPH法測得的大蒜粉高效液相色譜結(jié)果見圖1，依據(jù)空白組和實驗組的峰面積的變化，計算大蒜粉中活性成分對DPPH自由基的清除率。根據(jù)標準曲線對已知的大蒜中活性成分進行定量分析，大蒜粉中DPPH自由基清除活性結(jié)果見表1。

a-空白組峰面積;b-實驗組峰面積圖1 大蒜粉和DPPH反應前后色譜結(jié)果圖Fig.1 Chromatographic results before and after the reaction between garlic powder and DPPH

由表1可知大蒜粉中含有8種可清除自由基的活性成分。根據(jù)前后峰面積的變化可知，保留時間為48.538、51.358 min的2種物質(zhì)的吸收峰消失，表明1#、4# 2種成分對羥自由基有極強的清除作用。5#、6# 2種成分對羥自由基的清除作用較強，清除率分別為43.19%、67.59%。2#、7#和8# 3種成分對羥自由基的清除作用較弱，清除率在11.00%～19.89%。3#成分的峰面積極高，但對羥自由基的清除率僅為3.11%，說明此成分是大蒜粉中含量較大但抗氧化能力較弱的活性成分。此外，根據(jù)已知大蒜中活性成分標準品可以確定2#、5#、6# 3種成分分別為二烯丙基二硫醚、二烯丙基三硫醚和大蒜素，由標準曲線計算得出3種已知成分的量分別為429.5、10 687.5、93.5 μg/g。

表1 大蒜中清除DPPH自由基的活性成分結(jié)果Table 1 Results of active ingredients in garlic scavenging DPPH free radicals

2.2 大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)骨架側(cè)鏈上帶有的氨基對羥自由基非常敏感，容易轉(zhuǎn)化為羰基基團，一般來說蛋白質(zhì)羰基含量越高，就說明蛋白氧化程度越高。如圖2所示，氧化未添加大蒜粉組的羰基含量顯著高于空白對照(P<0.05)，表明經(jīng)羥自由基體系氧化處理后肌原纖維蛋白氧化程度明顯加深。研究表明，當肌原纖維蛋白暴露在含低濃度H2O2的高濃度FeCl3環(huán)境中時，由于蛋白質(zhì)-Fe2+配合物與H2O2反應時可以還原生成活性氧，活性氧與金屬結(jié)合位點上的氨基酸殘疾側(cè)鏈發(fā)生反應，使一些氨基酸被轉(zhuǎn)化為羰基衍生物[19]。在氧化處理組中，添加大蒜粉組的羰基含量均顯著低于未添加大蒜粉組(P<0.05)，說明氧化環(huán)境下，大蒜粉對肌原纖維蛋白有保護作用?？赡艿脑蛉缦拢?1)大蒜粉中的活性成分對羥自由基的清除作用，減少了Fenton體系中的羥自由基含量；(2)大蒜粉中的酚類物質(zhì)通過與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復合物來抑制蛋白質(zhì)的氧化[20]。此外，大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白的保護作用與其添加量有關(guān)，當大蒜粉的質(zhì)量分數(shù)在0.5%以下時，其保護作用與添加量成正比；當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%～2.0%時，保護作用與添加量成反比。有研究表明[21-22]，大蒜中富含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、含硫有機化合物和皂苷類等多種生物活性成分，其中果聚糖占據(jù)大蒜干重的75%以上，是脫水大蒜的主要成分。因此，當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)較大時(>0.5%)，其保護作用與添加量成反比的原因可能是大蒜粉中的還原糖在高含量下與蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化反應，使羰基含量上升[23]。當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，羰基含量均顯著低于其他各組，說明氧化條件下，大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，其對牦牛肉肌原纖維蛋白的保護作用較強。

2.3 大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白二聚酪氨酸熒光值的影響

二聚酪氨酸是由2個L-酪氨酸分子的C—C氧化偶聯(lián)而成的一種熒光氨基酸，可用作蛋白質(zhì)氧化的有用標記[24]。由圖3可知，氧化未添加大蒜粉組的二聚酪氨酸熒光值顯著高于空白對照(P<0.05)，說明經(jīng)羥自由基氧化后，蛋白質(zhì)通過共價和非共價相互作用形成蛋白聚合物，氨基酸側(cè)鏈受到自由基的攻擊，與其他活性氨基酸殘基發(fā)生共價交聯(lián)，生成聚合物[14]。在氧化處理組中，添加大蒜粉組二聚酪氨酸熒光值均顯著低于未添加大蒜粉組(P<0.05)，表明大蒜粉具有抗氧化作用，抑制了蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸的聚合。當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%、1.0%、2.0%時，二聚酪氨酸的熒光值顯著低于空白對照(P<0.05)。這可能是由于大蒜粉對蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸的保護作用，導致氨基酸被包埋，從而使熒光強度降低[14]。

2.4 大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白總巰基含量的影響

肌原纖維蛋白中富含巰基，這些巰基易受羥自由基的攻擊而轉(zhuǎn)化成分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導致巰基含量降低，影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)[25]。如圖4所示，氧化未添加大蒜粉組巰基含量顯著低于空白對照組(P<0.05)，說明氧化處理后游離巰基被氧化成二硫鍵，導致巰基含量降低。在氧化處理組中，大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.2%和0.5%時，巰基含量顯著高于未添加大蒜粉組(P<0.05)，說明大蒜粉對氧化體系中肌原纖維蛋白側(cè)鏈基團具有保護作用，減少了巰基損失；大蒜質(zhì)量分數(shù)為1.0%和2.0%組和未添加大蒜粉組的巰基含量無顯著差異(P>0.05)，表明大蒜粉對氧化體系中肌原纖維蛋白的保護作用與其添加量有關(guān)，較高濃度大蒜粉對蛋白巰基損失無保護作用。有研究表明，大蒜中含有酚類物質(zhì)[26]，高含量酚類物質(zhì)會導致碎牛肉的巰基含量進一步降低[27]，可能的原因是某些酚類抗氧化物質(zhì)在提供電子和氫原子后，其自身被氧化為相應的半醌或醌類物質(zhì)，這些具有氧化性的物質(zhì)會促進巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵或者其自身作為交聯(lián)劑引起蛋白分子間交聯(lián)[19]。

圖4 肌原纖維蛋白的總巰基含量Fig.4 The total sulfhydryl content of myofibrillar protein

2.5 大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性的影響

蛋白質(zhì)是復雜的兩性物質(zhì)，其表面分布著親水性和疏水性氨基酸殘基，其中疏水性氨基酸殘基通過疏水鍵結(jié)合在蛋白質(zhì)分子中心，在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成疏水區(qū)[28]。因此蛋白質(zhì)的表面疏水性能反映出疏水基團在蛋白質(zhì)內(nèi)部的暴露程度，表明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，疏水基團的暴露程度越大，蛋白質(zhì)的表面疏水性越大。由圖5可知，氧化未加大蒜粉組的表面疏水性顯著高于空白對照組(P<0.05)，說明氧化處理后表面疏水性增加，有更多的疏水性氨基酸暴露在分子表面，導致蛋白構(gòu)象發(fā)生變化[29]。在氧化處理組中，添加大蒜粉組的表面疏水性顯著低于未添加大蒜粉組(P<0.05)，說明大蒜粉對氧化條件下牦牛肉肌原纖維蛋白的構(gòu)象有保護作用。當大蒜粉的質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，牦牛肉肌原纖維蛋白表面疏水性較低(P<0.05)，說明此添加量下大蒜粉對氧化條件下牦牛肉肌原纖維蛋白構(gòu)象的保護作用最強。

圖5 肌原纖維蛋白的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of myofibrillar protein

2.6 大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光的影響

由于蛋白質(zhì)內(nèi)源色氨酸熒光對色氨酸殘基周邊的微環(huán)境特別敏感，因此色氨酸熒光是表征蛋白質(zhì)三級構(gòu)象的一種有效方法。如圖6所示，氧化未添加大蒜粉組的內(nèi)源色氨酸熒光值與空白對照組相比明顯降低。說明氧化誘導了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)部分展開，色氨酸暴露在極性環(huán)境中，使肌原纖維蛋白的熒光強度顯著降低[14]。在氧化處理組中，大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，牦牛肉肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光顯著低于其他4組(P<0.05)。由于2.5中表面疏水性結(jié)果顯示，添加0.2%質(zhì)量分數(shù)的大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白的構(gòu)象具有保護作用。另有研究表明，多酚類物質(zhì)能增強極性環(huán)境并對色氨酸產(chǎn)生屏障作用，從而使色氨酸熒光強度進一步降低[30]。因此，大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，牦牛肉肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光顯著降低的原因可能是：當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.2%時，其中的多酚物質(zhì)占據(jù)主導作用，對色氨酸產(chǎn)生了屏障作用。大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，牦牛肉肌原纖維蛋白內(nèi)源色氨酸熒光與未添加大蒜粉組無顯著差異(P>0.05)；大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為1%和2%時，色氨酸熒光顯著高于未添加大蒜粉組(P<0.05)。色氨酸熒光強度隨大蒜粉添加量的增加而顯著增強的原因可能是：(1)大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白的構(gòu)象具有保護作用；(2)隨大蒜粉添加量增加，大蒜素等其他抗氧化活性成分發(fā)揮主導作用，清除了體系中的羥自由基，減弱了極性環(huán)境，從而使色氨酸的熒光強度增強。

圖6 肌原纖維蛋白的內(nèi)源色氨酸熒光Fig.6 Endogenous tryptophan fluorescence of myofibrillar protein

2.7 大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白溶解性的影響

蛋白質(zhì)的溶解性是蛋白質(zhì)最重要的功能性質(zhì)之一，蛋白質(zhì)的許多功能性質(zhì)都與其溶解性密切相關(guān)，如蛋白質(zhì)的乳化性、起泡性及凝膠性等[31]。由圖7可知，氧化未添加大蒜粉組的蛋白質(zhì)溶解性顯著低于空白對照(P<0.05)，說明羥自由基加速了牦牛肉肌原纖維蛋白的氧化，誘導蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，引起蛋白質(zhì)溶解度降低、交聯(lián)聚集情況加劇。有研究表明，牦牛肉肌原纖維蛋白對羥自由基較為敏感，在該氧化體系下蛋白質(zhì)的氧化性質(zhì)發(fā)生了明顯的變化[32]，與本文研究結(jié)果一致。在氧化處理組中，添加0.2%大蒜粉時，蛋白質(zhì)溶解性與未加大蒜粉組差異不顯著(P>0.05)；添加0.5%大蒜粉時，蛋白質(zhì)的溶解性與未加大蒜粉及添加0.2%大蒜粉組相比顯著增加(P<0.05)；而當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為1.0%和2.0%時，蛋白質(zhì)的溶解性顯著低于空白對照(P<0.05)。有研究表明，蛋白質(zhì)的溶解性與氨基酸組成、pH值、溫度、離子強度、蛋白質(zhì)濃度、表面疏水性等有關(guān)，其中pH值對蛋白質(zhì)溶解度的影響較為明顯[33]。且由表面疏水性結(jié)果可知，添加1.0%和2.0%大蒜粉組牦牛肉肌原纖維蛋白的表面疏水性與添加0.2%大蒜粉組無顯著差異，可排除表面疏水性引起的蛋白質(zhì)溶解度的改變。因此添加1.0%和2.0%的大蒜粉后蛋白質(zhì)的溶解性顯著低于空白對照的原因可能是因為高濃度大蒜粉的加入使蛋白溶液的pH值達到了等電點附近，此時蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷很少，分子間相互聚集使蛋白質(zhì)沉淀，導致蛋白質(zhì)溶解度降低。

圖7 肌原纖維蛋白的蛋白質(zhì)溶解性Fig.7 Protein solubility of myofibrillar protein

2.8 相關(guān)性分析

由表2中相關(guān)性分析結(jié)果可知，大蒜粉質(zhì)量濃度與牦牛肉肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸含量呈極顯著負相關(guān)(r=-0.868)。牦牛肉肌原纖維蛋白的羰基含量與巰基含量(r=-0.610)和表面疏水性(r=-0.800)呈極顯著負相關(guān)；巰基含量與表面疏水性呈極顯著負相關(guān)(r=-0.683)。本研究中，添加大蒜粉能夠顯著降低Fenton體系中牦牛肉肌原纖維蛋白的二聚酪氨酸熒光值，說明大蒜粉對牦牛肉肌原纖維蛋白的側(cè)鏈氨基酸有保護作用，能抑制Fenton體系中蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸的聚合。但是由于大蒜粉對蛋白質(zhì)側(cè)鏈氨基酸的保護作用，導致氨基酸被包埋[14]，從而使大蒜粉的質(zhì)量濃度與二聚酪氨酸熒光值呈極顯著負相關(guān)(r=-0.868)。

表2 相關(guān)性分析結(jié)果Table 2 Correlation analysis results

3 結(jié)論

大蒜粉具有較強的DPPH自由基清除作用，其共含有8種能清除DPPH自由基的活性成分，其中已知的3種成分及含量分別為大蒜素93.5 μg/g、二烯丙基二硫醚429.5 μg/g、二烯丙基三硫醚10 687.5 μg/g，另外5種成分需要進一步的研究確定。

大蒜粉能夠降低Fenton體系中牦牛肉肌原纖維蛋白的羰基含量、二聚酪氨酸熒光值和表面疏水性，增加總巰基含量及內(nèi)源色氨酸熒光值；且在大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，牦牛肉肌原纖維蛋白的羰基含量、二聚酪氨酸熒光值和表面疏水性較低，巰基含量和蛋白質(zhì)的溶解性較高。綜上，大蒜粉對Fenton體系中的牦牛肉肌原纖維蛋白具有保護作用，且當大蒜粉質(zhì)量分數(shù)為0.5%時，保護作用較強。