梁麗紅，高娉娉,2，張馨文,2，康文軍,2，李敏,2，王婧,2*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州，730070)

香氣和感官特性是影響消費者葡萄酒偏好的重要因素之一。在釀酒過程中，酵母菌株的選擇對芳香化合物的形成至關(guān)重要，進而決定葡萄酒的感官特性。目前，利用非釀酒酵母的混合發(fā)酵以定向改善葡萄酒某些釀酒參數(shù)和風(fēng)味特征的研究已得到廣泛關(guān)注[1]。許多非釀酒酵母菌株存在于酒精發(fā)酵(alcoholic fermentation, AF)階段，通過產(chǎn)生一系列酶和代謝物影響葡萄酒的理化成分，香氣特性和感官品質(zhì)[2]。但非釀酒酵母通常不能獨立完成AF，需要與發(fā)酵性能較強的菌株進行混合接種以完成AF[3]。

近年來，“微生物風(fēng)土”對葡萄酒風(fēng)格的影響逐漸受到關(guān)注，具有優(yōu)良釀酒特性的本土酵母可促進產(chǎn)區(qū)或地域特色葡萄酒的風(fēng)土表達[4]。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在AF過程中可快速適應(yīng)高滲透壓、低pH值、低氧氣利用率、高乙醇濃度等苛刻的環(huán)境條件[5]，逐漸開發(fā)為商業(yè)活性干粉制劑，盡管使用干粉制劑發(fā)酵具有易于控制和發(fā)酵迅速的優(yōu)點，但會導(dǎo)致葡萄酒缺乏由本土酵母帶來的風(fēng)格的差異性和復(fù)雜性，使葡萄酒風(fēng)味特征出現(xiàn)同質(zhì)化現(xiàn)象[6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，接種優(yōu)選的本土酵母菌的混合發(fā)酵有利于提高葡萄酒的香氣復(fù)雜性[7]。LIN等[8]將篩選自南澳大利亞的多株本土非釀酒酵母與S.cerevisiae混合發(fā)酵，結(jié)果表明，酵母之間的相互作用促進灰比諾葡萄酒中短鏈脂肪酸乙酯的生成，對香氣成分的促進效果顯著，從而增強葡萄酒的地域特征。

耐熱克魯維酵母(Lachanceathermotolerans)在AF期間通過糖代謝產(chǎn)生較高的乳酸[9]，其乳酸的產(chǎn)生量取決于菌株自身的特性和接種策略，在混合發(fā)酵過程中可能會因為菌株之間的拮抗作用產(chǎn)生較低的乳酸[10]。而粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)擁有較強的發(fā)酵能力和蘋果酸降解能力，對葡萄酒生境有較強的耐受性[11]。另外，S.pombe可代謝產(chǎn)生含量較高的吡喃型花色苷和某些特征性香氣物質(zhì)，具有改善顏色參數(shù)、提高香氣復(fù)雜性等優(yōu)勢[12]。

西班牙學(xué)者BENITO等[13]指出L.thermotolerans與S.pombe菌株是一對完美搭檔，用于彌補彼此的缺陷。目前L.thermotolerans和S.pombe的混菌發(fā)酵在干紅葡萄酒中的研究報道較少。本文以分離篩選于甘肅河西走廊的優(yōu)良本土L.thermotolerans和S.pombe酵母作為發(fā)酵劑，以明確本土酵母在混合發(fā)酵中的細胞動態(tài)變化規(guī)律，評估其純發(fā)酵和混合發(fā)酵引起的葡萄酒理化特性和香氣成分的變化，為建立多菌種發(fā)酵工藝模式提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

美樂葡萄：2020年10月采自甘肅省武威市民勤縣夏博覽葡萄酒莊園，葡萄汁含糖量229.5 g/L，葡萄汁含總酸量6.94 g/L(以酒石酸計)。

1.1.2 酵母與培養(yǎng)基

L.thermotolerans(LT)，由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室篩選于甘肅祁連葡萄酒業(yè)有限責(zé)任公司的自然發(fā)酵葡萄醪；S.pombe(SP)，由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點實驗室保藏。以上菌株均在甘油管中于-80 ℃保存。

釀酒酵母活性干粉(Vintage Red, VR)，意大利Enartis公司；商業(yè)酒酒球菌(Oenococcusoeni)：OMEGA，法國Lallemand公司。

YPD固體培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖20.0，蛋白胨20.0，酵母浸粉10.0，瓊脂20.0。

YPD液體培養(yǎng)基：同YPD培養(yǎng)基，不加瓊脂。

WL培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

葡萄汁培養(yǎng)基：葡萄汁與無菌純水(1∶1,體積比)。培養(yǎng)基均現(xiàn)用現(xiàn)配，于121 ℃高壓滅菌20 min后備用。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1 試驗試劑

2-辛醇(色譜級)，美國SIGMA-ALDRICH貿(mào)易有限公司；氯化鈉(分析純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；EX-V果膠酶(分析純)，法國Lallemand公司。

1.2.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；EX-150-II生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；Genesis 10 s紫外-可見分光光度計、Ultimate 3000高效液相色譜儀，美國Thermo VRientific公司；TRACE 1310-ISQ氣相色譜質(zhì)譜儀，美國Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 酵母培養(yǎng)

挑取菌株LT和SP的單菌落分別接入YPD液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h，連續(xù)培養(yǎng)2次后，以2%接種量接種至葡萄汁培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h后接種于葡萄醪(生物量達到108CFU/mL)。

商業(yè)菌株活化：將菌株VR以0.02 g/L添加量加入6%無菌葡萄糖水溶液中，37 ℃活化30 min后，按2%接種量接于葡萄汁培養(yǎng)基中，連續(xù)培養(yǎng)2次后，接種葡萄醪。

1.3.2 小容器發(fā)酵

5 L的發(fā)酵罐中加入約3.5 L的美樂葡萄醪(裝液量為70%)，后加入20 mg/L的果膠酶、50 mg/L的SO2(以偏重亞硫酸鉀的形式)，15 ℃低溫浸漬48 h后，按照接種方案分別接入種子液，25 ℃控溫發(fā)酵，當(dāng)殘?zhí)呛康陀? g/L時，添加60 mg/L的SO2終止發(fā)酵，倒罐除去酒泥后裝入棕色發(fā)酵罐，進行滿罐低溫貯存(15 ℃，4個月)，后續(xù)測定葡萄酒的發(fā)酵參數(shù)。

1.3.3 接種方案

酵母菌株經(jīng)YPD培養(yǎng)基活化擴培，以2%接種量接種于葡萄醪中。對照組是以2%的接種量單獨接種商業(yè)釀酒酵母VR，AF結(jié)束后按0.02 g/L接入商業(yè)酒酒球菌O.oeni啟動蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation, MLF)，記為VR。同時接種：以LT (106)∶SP (103)=103∶1；LT (106)∶SP (102)=104∶1；LT (106)∶SP (10)=105∶1的比例接種，分別記為LS3, LS4, LS5。同時，以2%的接種量單獨接種LT和SP進行純發(fā)酵，記為LT和SP。所有試驗組設(shè)置3個平行。

1.3.4 指標(biāo)測定

1.3.4.1 理化指標(biāo)測定

總糖，酒精度，總酸，揮發(fā)酸等釀酒參數(shù)參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

總花色苷含量采用pH示差法測定，參照岳泰新[14]的方法；色度和色調(diào)參照田秀等[15]的方法。

1.3.4.2 酵母計數(shù)

通過WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板計數(shù)法檢測整個發(fā)酵過程中的細胞濃度。在27 ℃下培養(yǎng)48 h后，根據(jù)非釀酒酵母與釀酒酵母在WL培養(yǎng)基上所呈現(xiàn)的表型特征進行差異計數(shù)。

1.3.4.3 蘋果酸、乳酸測定

參照BUGLASS等[16]的方法，并略作修改，采用高效液相色譜儀進行測定。

1.3.4.4 甘油含量測定

采用專用酶試劑盒進行測定，具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.3.4.5 香氣成分測定

參照宋茹茹等[17]的方法并略作修改。以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法進行定量。

1.3.4.6 感官分析

由擁有葡萄酒品鑒資格證的專業(yè)品鑒員(5名女性和5名男性)組成的品嘗小組對供試葡萄酒進行感官評定。分別從濃郁度，果香味，花香味，余味，生青味，酸味這6個方面對酒樣進行評價，以8分結(jié)構(gòu)數(shù)值量化為標(biāo)準(zhǔn)。感官分析過程中，每一供試酒樣重復(fù)分析3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Office Excel 2010和Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，利用Duncan’s多重比較在置信區(qū)間0.05下對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析和香氣化合物分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種方式對發(fā)酵速率的影響

如圖1所示，各試驗組均完成AF。VR對照組最快完成AF，歷時9 d，LT和SP組分別于第14、15天完成AF。不同比例共接種發(fā)酵(LS3, LS4, LS5)均于第14天左右完成發(fā)酵。發(fā)酵第2天時，各試驗組的發(fā)酵速率與VR對照組無顯著差異。但隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵速率呈現(xiàn)明顯差異。與VR發(fā)酵相比，非釀酒酵母LT和SP混菌發(fā)酵在一定程度上延緩了發(fā)酵進程，可能是由于非釀酒酵母具有較弱的AF能力導(dǎo)致的[18]。

圖1 不同接種方式下的發(fā)酵曲線Fig.1 Fermentation curve under different inoculation methods

2.2 菌株生長動態(tài)分析

圖2為AF過程中的酵母細胞生長動態(tài)，圖2-A表示單獨接種VR、LT和SP菌株的酵母細胞數(shù)量變化，3株酵母的初始菌株生物量均在106～107CFU/mL，生長趨勢較為相似。VR菌株在第2天時細胞數(shù)量達到最高值(7.6 lgCFU/mL)，而非釀酒酵母LT和SP在第4天細胞數(shù)量達到最高值，分別為7.9、7.1 lgCFU/mL。隨后菌體數(shù)量均開始下降，發(fā)酵結(jié)束時，VR和SP菌株細胞數(shù)量均穩(wěn)定在106CFU/mL，而LT菌株細胞數(shù)量均穩(wěn)定在105CFU/mL。

A-單獨接種VR、LT和SP菌株的酵母細胞數(shù)量變化；B-LT和SP菌株以103∶1共接種發(fā)酵過程中酵母細胞數(shù)量變化；C-LT和SP菌株以104∶1共接種發(fā)酵過程中酵母細胞數(shù)量變化；D-LT和SP菌株以105∶1共接種發(fā)酵過程中酵母細胞數(shù)量變化圖2 不同接種發(fā)酵中LT和SP的菌株生物量變化Fig.2 The changes of the number of LT and SP in different inoculation fermentation

圖2-B～圖2-D為LT和SP菌株以不同比例共接種發(fā)酵過程中酵母的生長動態(tài)變化。同時接種發(fā)酵中LT在第4天達到最大生長量后即開始逐漸下降，在發(fā)酵結(jié)束時(14 d左右)即無法檢測到LT活細胞的存在。而SP在達到最大生長量后，隨著發(fā)酵進程其細胞數(shù)量略有下降，直至發(fā)酵結(jié)束，細胞數(shù)量依然維持在106CFU/mL，表明SP在AF過程中具有良好的定殖能力。相關(guān)研究表明，當(dāng)接種S.pombe時，L.thermotolerans細胞在幾天內(nèi)迅速消失[13, 19]?；旌习l(fā)酵中非釀酒酵母生存能力的喪失與主要代謝物(尤其是乙醇)濃度的變化有關(guān)。本試驗中，LT菌株的衰亡與SP菌株的代謝產(chǎn)物或乙醇濃度的抑制作用是否有較強的相關(guān)性，還有待于進一步研究。

2.3 理化指標(biāo)分析

2株本土非釀酒酵母以不同比例混合發(fā)酵對葡萄酒主要發(fā)酵參數(shù)的影響如表1所示。與VR對照組相比，LT和SP酒樣的酒精體積分數(shù)較低，并且殘?zhí)呛枯^高；共同接種組酒樣的酒精體積分數(shù)(11.05%～12.37%)略低于純發(fā)酵組(12.65%～13.64%)。已有研究表明，使用非釀酒酵母可將碳代謝從乙醇途徑轉(zhuǎn)移到甘油等其他代謝產(chǎn)物途徑，從而降低葡萄酒的酒精含量[20]。2株非釀酒酵母參與發(fā)酵的酒樣揮發(fā)酸(以乙酸計)含量均低于VR酒樣，其中SP酒樣的揮發(fā)酸質(zhì)量濃度最低(為0.30 g/L)。相比于VR組，其他試驗組酒樣中總酸含量升高，且隨著LT菌株接種比例的增加，總酸含量逐漸增加。共同接種發(fā)酵酒樣的pH值顯著低于VR組，而SP純發(fā)酵組的pH值顯著高于其他試驗組。

表1 發(fā)酵結(jié)束后酒樣的基本理化指標(biāo)Table 1 Chemical composition of wines at the end of fermentation

葡萄汁中的初始蘋果酸含量為2.15 g/L，乳酸含量為0.31 g/L。對供試酒樣蘋果酸的含量分析表明，各試驗組的蘋果酸降解能力差異顯著，且純發(fā)酵組SP的蘋果酸降解能力達81.86%，顯著高于其他試驗組。LS3、LS4、LS5組蘋果酸降解率分別為75.35%，67.91%，70.71%，表明LT和SP按不同比例接種發(fā)酵，對最終的蘋果酸含量有一定的調(diào)整作用。另外，涉及LT參與發(fā)酵的酒樣中乳酸含量顯著高于其他試驗組。DEL FRESNO研究發(fā)現(xiàn)L.thermotolerans+S.pombe組合的試驗中，最終乳酸含量顯著增加，且大多數(shù)乳酸是在AF的第一階段產(chǎn)生的，此時L.thermotolerans占據(jù)主導(dǎo)地位[13]。上述結(jié)果還表明LT菌株的接種比例會影響乳酸產(chǎn)生量，其可能是由于混合發(fā)酵酒樣中菌株之間的互作作用和競爭作用。

2.4 顏色參數(shù)分析

圖3為供試酒樣的顏色參數(shù)，包括色度、色調(diào)和總花色苷含量。色澤是紅葡萄酒主要發(fā)酵參數(shù)之一。各試驗組的色調(diào)和色度值差異顯著，SP單獨發(fā)酵的色度值最高，為2.01，顯著高于VR和LT純發(fā)酵組。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，與S.cerevisiae相比，涉及S.pombe的混合發(fā)酵通?？墒辜t葡萄酒的顏色強度增加[13]，這與本試驗結(jié)果一致。這種效應(yīng)可能歸因于AF期間產(chǎn)生的乳酸導(dǎo)致pH值降低，而這種低pH條件會增加花青素分子(如黃酮)的顏色強度[21]。LS3酒樣色度值為最低水平0.83，顯著低于LS4，LS5；就色調(diào)而言，共接種試驗組的色調(diào)值均顯著低于純發(fā)酵組，其中共接種試驗組間無顯著差異，表明LT和SP共接種對干紅葡萄酒的色調(diào)值影響較小。SP酒樣中的總花色苷含量最高，達到141.98 mg/L，顯著高于其他試驗組酒樣；且總花色苷含量隨著LT接種比例的增高而逐漸升高(128.95～138.54 mg/L)。MORATA等[22]研究表明，S.pombe能夠代謝產(chǎn)生高濃度的丙酮酸等物質(zhì)以合成Vitis A的前體物質(zhì)，其次，S.pombe具有較高的羥基肉桂酸乙酯脫羧酶活性，從而對紅葡萄酒的顏色產(chǎn)生積極影響[23]。

2.5 甘油含量分析

甘油是葡萄酒中主要化合物之一，高水平的甘油含量通常會增強酒體結(jié)構(gòu)、協(xié)調(diào)性或甜味等感官特性[23]。由圖4可知，涉及非釀酒酵母LT和SP參與發(fā)酵的酒樣中甘油含量顯著增加，顯著高于VR組，共同接種組的甘油含量隨著LT菌株接種比例的增大，其含量不斷升高，甘油含量在5.37～6.18 g/L。表明LT和SP菌株共接種發(fā)酵能夠增加甘油含量。也有研究報道L.thermotolerans[23]和S.pomb[13]等非釀酒酵母可產(chǎn)生比S.cerevisiae更高含量的甘油。

圖3 不同接種發(fā)酵對色度、色調(diào)和總花色苷含量的影響Fig.3 Effect of different inoculation fermentation on chroma, hue and total anthocyanin content注：不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)

圖4 供試酒樣甘油生成量Fig.4 Glycerol production of sample wines注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.6 香氣化合物分析

不同處理組酒樣中共檢測分析出44種香氣物質(zhì)(相應(yīng)結(jié)果見附表，https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1802.TS.20211216.1343.003.html)，包括C6化合物，萜烯類，醛酮類，C13-去甲類異戊二烯，高級醇，乙酸酯，乙醇酯，脂肪酸，芳香醇等幾大類物質(zhì)。各處理間香氣物質(zhì)種類無顯著差異，但物質(zhì)含量存在顯著差異。

2.6.1 揮發(fā)性香氣物質(zhì)熱圖分析

圖5顯示不同接種發(fā)酵過程中揮發(fā)性芳香化合物的含量差異變化。與VR對照組相比，LT純接種發(fā)酵促進3-乙氧基丙醇(45.32 μg/L)，2-壬醇(9.71 μg/L)，癸酸乙酯(304.98 μg/L)和9-癸烯酸(203.43 μg/L)等物質(zhì)的合成。而SP純接種發(fā)酵對中鏈脂肪酸(4-癸烯酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯)，高級醇和香葉醇有較好的促進作用。研究表明，葡萄酒中香氣物質(zhì)的生成在非釀酒酵母的共發(fā)酵體系中存在協(xié)同作用[24]。與純發(fā)酵組相比，共接種組酒樣的香氣物質(zhì)含量顯著增加，且隨著LT菌株接種比例的增大，C6醇、中鏈脂肪酸乙酯、琥珀酸二乙酯和乳酸乙酯等酯類香氣物質(zhì)的含量顯著升高，有利于葡萄酒果香和香氣復(fù)雜性的增強，這可能是混合發(fā)酵過程中酵母之間的互作作用促進酯類的生成。本試驗還檢測出3種乙酸酯類物質(zhì)，包括乙酸異戊酯，乙酸苯乙酯和乙酸乙酯。而C6醇是通過脂肪酸代謝途徑產(chǎn)生，但本試驗酒樣中僅檢測到2種C6醇類物質(zhì)，分別是正己醇和3-己烯-1-醇。本研究還發(fā)現(xiàn)高比例接種LT菌株發(fā)酵的酒樣中苯甲醇和苯乙醇含量顯著提高，其中苯乙基類物質(zhì)可為葡萄酒帶來玫瑰香等愉悅的香氣特征。LS5組酒樣的苯乙醇質(zhì)量濃度最高，為6 905.10 μg/L。也有文獻報道認為非釀酒酵母具有較高的苯乙醇合成能力[25]。

葡萄酒中的脂肪酸能夠抑制對應(yīng)芳香酯的水解，但含量過高(>11 mg/L)時會給葡萄酒帶來刺激、腐敗等不良風(fēng)味[26]。本試驗檢出的丁酸，己酸，辛酸，癸酸，9-癸烯酸等脂肪酸，丁酸和辛酸的含量隨LT菌株接種比例的增大顯著升高。另外，其他揮發(fā)性物質(zhì)中，共接種處理酒樣中的β-大馬酮含量顯著提高，具有果香，甜香和蜂蜜香的香氣特征。

圖5 不同接種方式下?lián)]發(fā)性物質(zhì)的含量變化Fig.5 Changes in the content of volatile substances under different inoculation methods

2.6.2 感官分析

各試驗組酒樣的感官分析雷達圖(圖6)表明，不同接種發(fā)酵方式和菌株的選擇對葡萄酒的酸味，果香味，生青味等香氣特征有顯著的影響。各發(fā)酵酒樣在余味長短方面得分無顯著差異。香氣分析表明，非釀酒酵母的共接種處理的花香和果香味均有較高得分，其中，LS5酒樣的香氣濃郁度更強，整體評分較高。從口感方面分析，共同接種發(fā)酵酒樣顯著改善酒體的酸度，增加協(xié)調(diào)性。綜上，共接種發(fā)酵有利于葡萄酒香氣特征的提升，促進花香味和果香味的提高。

圖6 感官分析雷達圖Fig.6 Sensory analysis radar chart

3 結(jié)論

本土耐熱克魯維酵母(L.thermotolerans)菌株LT和粟酒裂殖酵母(S.pombe)菌株SP分別以不同比例同時接種發(fā)酵，探究其對干紅葡萄酒相關(guān)釀酒參數(shù)、香氣成分和感官特性的影響。通過對各供試酒樣在AF過程中菌體數(shù)量的動態(tài)監(jiān)測，結(jié)果表明，SP菌株在整個AF過程中表現(xiàn)出良好的定殖能力，而LT菌株最終全部消亡。葡萄酒的整體香氣是多種揮發(fā)性物質(zhì)相互作用的最終表現(xiàn)，其種類及含量顯著影響葡萄酒的香氣特征。LT和SP的混合發(fā)酵有利于干紅葡萄酒香氣質(zhì)量的提升，且105∶1的比例同時接種發(fā)酵可顯著提高C6醇、中鏈脂肪酸乙酯、琥珀酸二乙酯和乳酸乙酯等香氣物質(zhì)的含量，對花果香類成分有較好的促進作用。