汪步青，陳 洲，王亞森，許向陽(yáng)，高曉冬，藤田盛久，李子杰

(1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122； 2.棗莊市杰諾生物酶有限公司，山東 棗莊 277100)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中的蛋白類酰基甘油水解酶，在自然條件下能夠在油水混合界面催化油脂生成不同鏈長(zhǎng)的游離脂肪酸、酯類和甘油等物質(zhì)，而在非水相體系中參與催化酯交換、酯化、酸解和氨解等多種類型反應(yīng)[1-2]。脂肪酶具有催化效率高、反應(yīng)過(guò)程溫和、對(duì)底物的特異性催化活力等特性，被廣泛應(yīng)用于食品、洗滌劑、造紙、生物能源和生物醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域[3-5]。

杜邦嗜熱菌(Thermomycesdupontii)脂肪酶，即Talaromycesthermophilus脂肪酶(LIP1)，是一種堿性脂肪酶，因其極高的熱穩(wěn)定性而廣受關(guān)注，LIP1的最適催化溫度為60℃，并且經(jīng)70℃水浴處理1 h依舊保持50%以上的催化活性[6]。研究表明，LIP1在許多工業(yè)生產(chǎn)中具有應(yīng)用潛力[6-8]。Romdhane等[6]研究發(fā)現(xiàn)，LIP1在堿性pH和不同的表面活性劑中具有良好的穩(wěn)定性，有助于其作為添加劑在洗滌劑中的應(yīng)用。同時(shí)，LIP1具有優(yōu)異的催化酯交換活性，有助于其在生物柴油生產(chǎn)中的應(yīng)用[7]。此外，隨著對(duì)LIP1研究的開(kāi)展，其顯示出具有制備手性藥物中間體的潛力[8]。然而杜邦嗜熱菌培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜，LIP1發(fā)酵酶活低，生產(chǎn)成本過(guò)高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，實(shí)現(xiàn)LIP1高效表達(dá)尤為重要。

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)異源表達(dá)系統(tǒng)由于其高效表達(dá)水平、強(qiáng)大的分泌能力、完善的誘導(dǎo)表達(dá)方法以及成熟的高密度發(fā)酵能力被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的表達(dá)[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，LIP1在畢赤酵母中的搖瓶分泌酶活為156 U/mL，是其在杜邦嗜熱菌中的2.6倍[9]。因而，采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是一種有效提高LIP1表達(dá)的方法。此外，據(jù)以往的研究可知，優(yōu)化提升畢赤酵母高效表達(dá)效率的手段有很多，但大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的都是單因素或雙因素優(yōu)化，總體的分泌表達(dá)水平提升不明顯；而采用組合優(yōu)化策略包括密碼子偏好性優(yōu)化、外源基因拷貝數(shù)的積累、更換分泌作用更強(qiáng)的信號(hào)肽、分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化用于過(guò)表達(dá)輔助蛋白從而促進(jìn)目的蛋白修飾和分泌、強(qiáng)啟動(dòng)子優(yōu)化以及高密度發(fā)酵進(jìn)一步提高重組表達(dá)效率[11-14]，可獲得高水平分泌表達(dá)LIP1的重組菌株。

綜上，本研究采用組合優(yōu)化策略提高LIP1在畢赤酵母中的表達(dá)水平。首先，將LIP1密碼子偏好性優(yōu)化基因，連接至含醇氧化酶(AOX1)強(qiáng)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體pPIC9K中，電擊轉(zhuǎn)化后成功構(gòu)建篩選出含多拷貝LIP1基因的異源表達(dá)重組酵母菌株；在此基礎(chǔ)上，研究了不同信號(hào)肽優(yōu)化以及分子伴侶共表達(dá)對(duì)LIP1分泌表達(dá)的影響；最后，將優(yōu)化篩選出的重組菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)LIP1在重組酵母中高效表達(dá)和積累?？傊?，在本研究中，借助畢赤酵母表達(dá)體系，利用基因工程技術(shù)提高LIP1的表達(dá)量，對(duì)促進(jìn)其實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α、畢赤酵母GS115，江南大學(xué)糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；表達(dá)載體pPIC9K和pPICZA，美國(guó)Invitrogen公司；DNA聚合酶、連接酶、限制性內(nèi)切酶等工具酶，美國(guó)Thermo Scientific公司；其他常規(guī)試劑，國(guó)藥集團(tuán); 不同鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酚酯(C4、C8、C10、C12、C14和C16)，北京索萊寶科技有限公司；引物，無(wú)錫天霖生物有限公司。

LB、MD、YPD、BMGY、BMMY和BMMY-羅丹明B等培養(yǎng)基參考Invitrogen公司的畢赤酵母表達(dá)手冊(cè)配制。

壓力蒸汽滅菌鍋(立式)；無(wú)菌操作臺(tái)；臺(tái)式水平恒溫?fù)u床；5 L發(fā)酵罐；甲醇檢測(cè)流加監(jiān)控器；SDS-PAGE 凝膠電泳儀、核酸凝膠電泳儀和Western Blot快速轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 載體構(gòu)建和畢赤酵母轉(zhuǎn)化

基因合成：LIP1基因(JF414585.1)由前體肽識(shí)別序列和成熟肽編碼序列構(gòu)成，含HA標(biāo)簽，經(jīng)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化后[15]，由無(wú)錫天霖生物有限公司合成至質(zhì)粒載體PUC57中。

重組質(zhì)粒載體構(gòu)建：將pPIC9K和PUC57用EcoR I和NotI進(jìn)行雙酶切，采用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，并用T4DNA連接酶連接，熱激轉(zhuǎn)入E.coliDH5α中后成功構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-LIP1。

畢赤酵母轉(zhuǎn)化：將表達(dá)載體pPIC9K-LIP1經(jīng)SalI線性化、回收和濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化至畢赤酵母GS115中，涂板于MD平板上。2～3 d后將MD平板中的轉(zhuǎn)化子，依次挑至含不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、2.0、3.0 mg/mL)G418(遺傳霉素)的YPD平板，30℃培養(yǎng)2～3 d后，篩選出含多拷貝基因的重組菌株。并將獲得的重組菌株接種于BMMY-羅丹明B定性篩選平板中，30℃培養(yǎng)3～4 d后篩選出透明圈大(脂肪酶水解油脂產(chǎn)生透明圈)的菌株用于進(jìn)一步的LIP1的表達(dá)和檢測(cè)。

1.2.2 脂肪酶在畢赤酵母中的高效表達(dá)策略

信號(hào)肽優(yōu)化：根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化設(shè)計(jì)信號(hào)肽D1 signal sequence (D1ss)、D2 signal sequence(D2ss)、FLD1 signal sequence(Fss)、MFH4 signal sequence(Mss)、W1 signal sequence(Wss)、Glucoamylase signal sequence(Gss)的基因序列，并根據(jù)上述信號(hào)肽的基因序列為模板設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增出信號(hào)肽，并經(jīng)過(guò)BamH I和EcoR I 雙酶切后用T4DNA連接酶連接至pPIC9K-LIP1，替換質(zhì)粒pPIC9K中的α-factor信號(hào)肽，構(gòu)建出質(zhì)粒pPIC9K-D1ss-LIP1、pPIC9K-D2ss-LIP1、pPIC9K-Fss-LIP1、pPIC9K-Mss-LIP1、pPIC9K-Wss-LIP1和pPIC9K-Gss-LIP1。并參考1.2.1的方法進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化，篩選出酶活高的重組菌株，作為出發(fā)菌株。

分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化：首先，在NCBI網(wǎng)站中獲得分子伴侶BMH2 (XM_002490942.1)、HAC(XP_002490039.1)、KEX2(XM_002491154.1)、SSA4(XM_002493814.1)、PDI(CAC33588.1)和UBC1(XM_002492398.1)的基因序列，并依據(jù)基因序列設(shè)計(jì)引物，以提取的畢赤酵母GS115基因組為模板，擴(kuò)增出相應(yīng)的分子伴侶片段。并經(jīng)過(guò)BamH I和EcoR I 酶切后用T4DNA連接酶連接至pPICZA中，構(gòu)建出質(zhì)粒pPICZA-BMH2、pPICZA-HAC、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4、pPICZA-PDI、pPICZA-UBC1。采用SalI線性化pPICZA-BMH2、pPICZA-KEX2、pPICZA-SSA4和pPICZA-UBC1，SacI線性化pPICZA-HAC和pPICZA-PDI，回收和濃縮后，電擊轉(zhuǎn)化至出發(fā)菌株中，并參考1.2.1的方法進(jìn)行畢赤酵母轉(zhuǎn)化，篩選出酶活高的重組菌株。

1.2.3 畢赤酵母搖瓶發(fā)酵

將篩選出的重組菌株接種于5 mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h,將菌液按4%接種量轉(zhuǎn)接至50 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)至OD600為20左右，離心收集菌體，使用50 mL無(wú)菌水(預(yù)冷)洗兩遍并離心收集，重懸于50 mL的BMMY培養(yǎng)基中，28℃發(fā)酵培養(yǎng)，每24 h加入1%的甲醇誘導(dǎo)，同時(shí)取上清液，采用SDS-PAGE和Western Blot檢測(cè)LIP1的蛋白表達(dá)，并測(cè)定酶活。

1.2.4 5 L發(fā)酵罐高密度發(fā)酵

將采用組合優(yōu)化策略篩選出的重組菌株接種于10 mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h，取菌液按4%接種量轉(zhuǎn)接至200 mL的BMGY培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24 h，作為發(fā)酵種子液。將發(fā)酵種子液接種于含2 L BSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，采用50%磷酸和氨水自動(dòng)流加調(diào)節(jié)pH，保持pH為5.5，溫度為30℃。待BSM無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中甘油消耗完全，溶氧反彈后，保持發(fā)酵pH和溫度不變進(jìn)入流加甘油培養(yǎng)階段，采用DO-Star方式流加甘油，待濕重達(dá)到220 g/L以上時(shí)，停止甘油流加并饑餓處理30 min后，進(jìn)入流加甲醇誘導(dǎo)階段。此時(shí)，調(diào)節(jié)pH至6.0，溫度至27℃，將甲醇緩慢流加至培養(yǎng)液中，通過(guò)甲醇檢測(cè)器檢測(cè)發(fā)酵液中的甲醇含量，每隔24 h取樣檢測(cè)OD600、細(xì)胞干質(zhì)量、脂肪酶的蛋白表達(dá)水平及上清LIP1酶活，甲醇誘導(dǎo)7 d后，停止流加甲醇，發(fā)酵結(jié)束。

1.2.5 重組脂肪酶的活性檢測(cè)

LIP1活性檢測(cè)采用堿滴定法[16]。在50 mL三角瓶中，依次加入5 mL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 10.0)和4 mL高速勻漿機(jī)處理的橄欖油與聚乙烯醇乳化液(橄欖油與聚乙烯醇比例1∶3)，在60℃水浴中預(yù)熱5 min。加入1 mL 60℃預(yù)熱稀釋的發(fā)酵上清液(空白組加入60℃預(yù)熱的1 mL Tris-HCl)，在60℃水浴中反應(yīng)10 min后，立即加入15 mL 95%乙醇溶液終止反應(yīng)。向三角瓶中滴入2滴酚酞指示劑，采用0.05 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，直至液體呈微紅色并保持30 s內(nèi)不褪色，記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。單位LIP1酶活力以每分鐘產(chǎn)生1 μmol游離脂肪酸的所需酶量表示。

1.2.6 重組脂肪酶的底物特異性檢測(cè)

重組脂肪酶LIP1的底物特異性采用比色法[17]測(cè)定。在1.5 mL EP管中加入80 μL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.5)，依次加入10 μL稀釋至200 U/mL的1.2.3發(fā)酵上清液和10 μL不同鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酚酯(C4、C8、C10、C12、C14和C16)，35℃反應(yīng)5 min，最后加入100 μL 1%的SDS溶液終止反應(yīng)，在405 nm下測(cè)定吸光值，以測(cè)定酶活最高時(shí)底物下的酶活為100%，計(jì)算其他底物下的相對(duì)酶活。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)進(jìn)行3次平行，結(jié)果以平均值表示。采用Origin 8.1軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，同時(shí)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體構(gòu)建和畢赤酵母轉(zhuǎn)化

按1.2.1方法進(jìn)行載體的構(gòu)建和畢赤酵母轉(zhuǎn)化,菌落PCR驗(yàn)證和BMMY-羅丹明B平板篩選結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：M.DNA Marker；1.特異性引物PCR驗(yàn)證產(chǎn)物(圖A)；1.畢赤酵母陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌落PCR(圖B)；CK.GS115/pPIC9K(圖C)；1～13.GS115/pPIC9K-LIP1(圖C)

由圖1A可看出，LIP1(含HA標(biāo)簽)全長(zhǎng)為870 bp，與重組質(zhì)粒經(jīng)LIP1上下游特異性引物PCR獲得的條帶大小一致，說(shuō)明重組質(zhì)粒載體pPIC9K-LIP1構(gòu)建成功。由圖1B可看出，經(jīng)G418的YPD平板梯度篩選出的含多拷貝基因重組菌株，采用pPIC9K通用引物進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，結(jié)果與預(yù)期相符。由圖1C可看出，重組菌株經(jīng)BMMY-羅丹明B平板培養(yǎng)，平板上出現(xiàn)大小不一的透明圈，篩選存在最大透明圈的菌株用于LIP1的表達(dá)。

2.2 脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá)

將1.2.1經(jīng)BMMY-羅丹明B平板篩選的透明圈最大的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-LIP1按1.2.3方法發(fā)酵，發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，并以HA為標(biāo)簽，進(jìn)行Western Blot分析，結(jié)果如圖2所示。由圖2A可看出，重組菌株在約32 kDa處出現(xiàn)條帶，與目的蛋白大小相符，通過(guò)堿滴定法測(cè)定LIP1的酶活達(dá)到576 U/mL。由圖2B可看出，在32 kDa位置確實(shí)存在條帶。因此，結(jié)合SDS-PAGE和Western Blot分析結(jié)果表明LIP1在畢赤酵母中成功表達(dá)。

注：M. Marker； 1.發(fā)酵上清液中的LIP1

2.3 信號(hào)肽對(duì)脂肪酶在畢赤酵母中表達(dá)水平的影響

為提高LIP1在畢赤酵母中的分泌效率，本研究?jī)?yōu)化了LIP1的分泌型信號(hào)肽，如表1所示。

表1 本研究所用的信號(hào)肽

由表1可知，選取6種畢赤酵母同源的分泌型信號(hào)肽，成功構(gòu)建出6株不同信號(hào)肽替換優(yōu)化的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-D1ss-LIP1、GS115/pPIC9K-D2ss-LIP1、GS115/pPIC9K-Fss-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-LIP1、GS115/pPIC9K-Wss-LIP1和GS115/pPIC9K-Gss-LIP1。采用BMMY-羅丹明B平板進(jìn)行篩選，挑選透明圈最大的轉(zhuǎn)化子按1.2.3方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵上清液中LIP1的蛋白表達(dá)水平和酶活測(cè)定結(jié)果如圖3所示。

注：M. Marker；CK. GS115/pPIC9K-LIP1；1.GS115/pPIC9K-D1ss-LIP1；2.GS115/pPIC9K-D2ss-LIP1；3.GS115/pPIC9K-Fss-LIP1；4.GS115/pPIC9K-Mss-LIP1；5.GS115/pPIC9K-Wss-LIP1；6.GS115/pPIC9K-Gss-LIP1

由圖3可看出，信號(hào)肽D1ss、D2ss、Fss、Mss優(yōu)化菌株均在32 kDa處有條帶，且信號(hào)肽D1ss、D2ss及Mss均可促進(jìn)LIP1的分泌表達(dá)，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵上清液中LIP1酶活分別達(dá)到674、640、835 U/mL，是出發(fā)菌株GS115/pPIC9K-LIP1(CK)酶活的1.17、1.11 倍及1.45倍，其中信號(hào)肽Mss的分泌效果最強(qiáng)。因此，篩選菌株GS115/pPIC9K-Mss-LIP1進(jìn)行下一步的優(yōu)化試驗(yàn)。

2.4 分子伴侶對(duì)脂肪酶在畢赤酵母中表達(dá)水平的影響

以GS115/pPIC9K-Mss-LIP1作為出發(fā)菌株，按1.2.2分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化方法成功構(gòu)建6株共表達(dá)不同分子伴侶的重組畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-BMH2-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-HAC-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-KEX2-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1、GS115/pPIC9K-Mss-PDI-LIP1和GS115/pPIC9K-Mss-UBC1-LIP1，并采用BMMY-羅丹明B平板進(jìn)行篩選，挑選透明圈最大的轉(zhuǎn)化子按1.2.3方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。以GS115/pPIC9K-Mss-LIP1菌株作為對(duì)照，測(cè)定發(fā)酵上清液中LIP1的蛋白表達(dá)水平及酶活，結(jié)果如圖4所示。

注：M. Marker；CK. GS115/pPIC9K-Mss-LIP1；1.GS115/pPIC9K-Mss-BMH2-LIP1；2.GS115/pPIC9K-Mss-HAC-LIP1；3.GS115/pPIC9K-Mss-KEX2-LIP1；4.GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1；5.GS115/pPIC9K-Mss-PDI-LIP1；6.GS115/pPIC9K-Mss-UBC1-LIP1

由圖4可看出：6種分子伴侶共表達(dá)菌株均在32 kDa處有條帶，其中分子伴侶SSA4、BMH2、HAC以及PDI均可促進(jìn)LIP1的分泌表達(dá)，對(duì)應(yīng)發(fā)酵上清液中LIP1酶活分別達(dá)到1 136、970、885 U/mL和1 030 U/mL，分別為出發(fā)菌株的1.36、1.16、1.05 倍和1.23 倍，分子伴侶SSA4效果最好；而KEX2和UBC1的共表達(dá)抑制了LIP1的分泌，降低了LIP1的酶活?？傊?，基于組合優(yōu)化策略，依次經(jīng)過(guò)密碼子偏好性優(yōu)化、目的基因多拷貝、信號(hào)肽優(yōu)化以及分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化，最終篩選出一株脂肪酶活性最高的菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1，其酶活達(dá)到1 136 U/mL，是已報(bào)道的未經(jīng)過(guò)組合策略優(yōu)化的LIP1表達(dá)于畢赤酵母中酶活[9]的7.28倍。說(shuō)明本研究采用的組合優(yōu)化策略能顯著提高LIP1在畢赤酵母中的表達(dá)水平。

2.5 重組畢赤酵母的高密度發(fā)酵

重組酵母在發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵，是進(jìn)一步提高LIP1重組表達(dá)效率的有效方法。Xu等[18]利用3 L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)皺褶念珠菌脂肪酶的酵母重組菌，在高密度發(fā)酵130 h后，脂肪酶活性達(dá)到13 490 U/mL，相對(duì)于搖瓶培養(yǎng)提高了7.67倍。按1.2.4方法利用5 L發(fā)酵罐對(duì)GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1菌株進(jìn)行高密度發(fā)酵，每隔24 h取樣，測(cè)定重組菌株的OD600、細(xì)胞干質(zhì)量、脂肪酶的蛋白表達(dá)水平及酶活，結(jié)果如圖5所示。

注：M. Marker；24、48、72、96、120、144、168 h分別為甲醇誘導(dǎo)時(shí)間

由圖5可看出，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，重組LIP1的酶活和蛋白表達(dá)水平逐漸增加，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間達(dá)到144 h時(shí)，重組LIP1的酶活最高，達(dá)到12 150 U/mL，是搖瓶發(fā)酵酶活的10.7倍，說(shuō)明高密度發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了LIP1在重組酵母中高效表達(dá)和積累。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組菌株的OD600和細(xì)胞干質(zhì)量也在不斷增加，在誘導(dǎo)時(shí)間為168 h時(shí)，細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)到最大，為120.5 g/L?？傊诮M合優(yōu)化策略的實(shí)施，可在發(fā)酵上清液中獲得大量重組LIP1(見(jiàn)圖5A)，有利于重組LIP1進(jìn)一步在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中的分離和純化。

2.6 重組脂肪酶的底物特異性(見(jiàn)圖6)

圖6 重組LIP1的底物特異性

脂肪酶特殊的底物特異性很大程度上決定了其在工業(yè)化中應(yīng)用的領(lǐng)域[19]。由圖6可看出：重組LIP1對(duì)不同鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酚酯的水解能力差異很大，其對(duì)中鏈脂肪酸底物(C8和C10)呈現(xiàn)較高活性，最適底物為C8鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酚酯；而當(dāng)?shù)孜锾兼滈L(zhǎng)度大于12或低于8時(shí)，重組LIP1的催化活力顯著降低，表明重組LIP1對(duì)中鏈底物具有特異性的親和力，能夠特異性地水解生成大量的中鏈脂肪酸。由于中鏈脂肪酸獨(dú)特的生理生化功能，常應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食用油及養(yǎng)殖業(yè)等領(lǐng)域[20]，因而重組LIP1在中鏈脂肪酸的工業(yè)化生產(chǎn)中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)杜邦嗜熱菌來(lái)源的脂肪酶密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)合G418高濃度抗性篩選和BMMY-羅丹明B平板篩選，獲得了一株脂肪酶活性較高的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-LIP1，其酶活為576 U/mL；然后，通過(guò)信號(hào)肽優(yōu)化和分子伴侶共表達(dá)優(yōu)化，獲得一株高效表達(dá)脂肪酶的畢赤酵母菌株GS115/pPIC9K-Mss-SSA4-LIP1，其酶活達(dá)到1 136 U/mL；采用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，誘導(dǎo)144 h后，脂肪酶酶活最高，達(dá)到12 150 U/mL，是搖瓶發(fā)酵的10.7倍。通過(guò)測(cè)定重組脂肪酶的底物特異性發(fā)現(xiàn)，其對(duì)中鏈(C8)底物的對(duì)硝基苯酚酯存在特異性的催化活性。后續(xù)研究將基于對(duì)高密度發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高LIP1的重組表達(dá)水平，為重組LIP1規(guī)?；a(chǎn)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。