劉強(qiáng)欣，林婷，王志超，李雅，王侃，劉芯成

綠城農(nóng)科檢測(cè)技術(shù)有限公司（杭州 310051）

甲醛（CH2O）又稱(chēng)蟻醛，常溫下是一種無(wú)色具有強(qiáng)烈刺激氣味的物質(zhì)[1]，它作為一種代謝成分普遍存在于生物體中，通過(guò)破壞生物體中的蛋白質(zhì)和酶，使得組織細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的損傷[2]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，人體長(zhǎng)期接觸甲醛會(huì)造成機(jī)體各種不良反應(yīng)，可能會(huì)引起神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和肝臟的損傷[3]，研究發(fā)現(xiàn)部分老年癡呆癥狀與甲醛的攝入相關(guān)[4]。因此，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）確認(rèn)甲醛為第一類(lèi)致癌物[5]，同時(shí)世衛(wèi)組織確定甲醛為致癌、致畸物質(zhì)，世界各國(guó)都禁止將甲醛作為防腐劑在食品中使用[6]，美國(guó)環(huán)境環(huán)保局給出的建議是：甲醛每日的容許攝入量為每千克體重0.2 mg[7]，我國(guó)也明令禁止在食品中以任何形式添加甲醛，其限量規(guī)定為“不得檢出”[8]。

長(zhǎng)久以來(lái)，火鍋?zhàn)鳛橹腥A民族的一種獨(dú)創(chuàng)美食，深受到廣大人民的喜愛(ài)且盛行于東亞地區(qū)。牛百葉作為一種含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有補(bǔ)益脾胃、補(bǔ)氣養(yǎng)血等功效的食品，在火鍋中屬于必備的食材。由于甲醛能夠使蛋白質(zhì)變性，具有防腐性能，食品中加入甲醛可以起到防腐保鮮同時(shí)可以使食品表面色澤光亮，還可以增加韌性和脆感，改善食品口感[9-10]。近些年來(lái)，水產(chǎn)品及水發(fā)產(chǎn)品中檢出甲醛的報(bào)道時(shí)有發(fā)生[11-15]，常有一些不法商販為使水發(fā)食品不腐爛變質(zhì)，又能保持好的感觀，在用火堿水溶液浸泡的同時(shí)，加一些甲醛。水產(chǎn)品以及水發(fā)產(chǎn)品中的甲醛即使清洗、烹調(diào)也無(wú)法根除。監(jiān)管部門(mén)為杜絕添加甲醛的水產(chǎn)品流入市場(chǎng)，加大監(jiān)督檢驗(yàn)力度，以確保消費(fèi)者的食用安全。參照SC/T 3025—2006《水產(chǎn)品中甲醛的測(cè)定》[16]，建立牛百葉中甲醛的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)模型，模擬不良商販對(duì)水發(fā)產(chǎn)品（牛百葉）添加甲醛后，甲醛的相關(guān)揮發(fā)狀況。為市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)對(duì)牛百葉中非法添加甲醛的狀況進(jìn)行監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

甲醇（色譜純，默克）；二氯甲烷（色譜純，默克）；2, 4-二硝基苯肼（分析純，浙江長(zhǎng)青化工）；磷酸（分析純，浙江長(zhǎng)青化工）；鹽酸（分析純，浙江長(zhǎng)青化工）；甲醛（100 mg/L，ANPEL）；Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5.0 μm，博納艾杰爾）；試驗(yàn)用水（一級(jí)水，美國(guó)Millipore超純水儀制備）；混合微孔濾膜（0.22 mm）；牛百葉（陽(yáng)性樣品）。

1.1.2 主要儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀器（Shimadzu LC-2030C，配有二極管陣列檢測(cè)器，日本島津公司）；電子天平（BSA224S型，德國(guó)賽多利斯）；凱式定氮儀（Kjeltec 8400，foss）；多管渦旋混合儀（DMT-2500，杭州米歐儀器有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（ST16R，賽默飛世爾）；恒溫水浴鍋（HWS-28，上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；全自動(dòng)平行濃縮儀（AOTO EVA-60，?？苾x器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取10.00 g試樣置于50 mL燒杯中，轉(zhuǎn)移置于500 mL蒸餾瓶，用20 mL水分多次沖洗燒杯，洗滌液合并至蒸餾瓶中，用玻璃棒攪拌均勻后靜置30 min，加入10 mL磷酸溶液（取100 mL磷酸，加水定容至1 000 mL），過(guò)水蒸氣蒸餾，將250 mL容量瓶作為吸收液裝置，待蒸餾至約240 mL時(shí)取出，用水定容至刻度[16]。

取2 mL上述蒸餾液置于15 mL離心管中，加入0.4 mL 2, 4-二硝基苯肼溶液（準(zhǔn)確稱(chēng)取2, 4-二硝基苯肼100 mg溶解于24 mL鹽酸中，冷卻至室溫后，加水定容至100 mL），置于60 ℃水浴衍生15 min，取出冷卻至室溫后加入4 mL二氯甲烷，渦旋3 min于8 000 r/min離心3 min，取上清液再用2 mL二氯甲烷萃取2次，合并3次下層黃色萃取液。萃取液于40 ℃氮?dú)獯蹈桑鋮s至室溫，2 mL甲醇溶解殘?jiān)?，過(guò)0.22 mm混合微孔濾膜，進(jìn)液相色譜儀測(cè)定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱Agela Innoval ODS-2（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動(dòng)相為甲醇-水（70∶30，V/V）；檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm；進(jìn)樣量20 μL；流速1 mL/min。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液

標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（100 mg/L）配制。準(zhǔn)確吸取0.4 mL甲醛置于10 mL容量瓶中，加水定容至刻度，配成甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液（4 mg/L），現(xiàn)配現(xiàn)用。

標(biāo)準(zhǔn)工作液配制。分別準(zhǔn)確吸取0.2 mL甲醛儲(chǔ)備液溶液及甲醛標(biāo)準(zhǔn)中間液2.000，0.500，0.050和0.025 mL，置于15 mL離心管中，加水定容至2 mL，配制成甲醛的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.00，4.00，1.00，0.10和0.05 mg/L）。

1.2.4 甲醛揮發(fā)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

準(zhǔn)確稱(chēng)取73份陽(yáng)性牛百葉樣品（試樣每份10 g），其中1份直接進(jìn)行甲醛含量的測(cè)定（初始?xì)埩袅浚?，其?2份均分為3組，分別放在4，15和35 ℃的恒溫裝置中。樣品在3種恒溫裝置下分別放置1，3，5，7，9，24，30和48 h，3種溫度下每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取出3份試樣，用2, 4-二硝基苯肼衍生液液相色譜法測(cè)定每個(gè)時(shí)間點(diǎn)牛百葉中甲醛含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定2次，統(tǒng)計(jì)6組數(shù)據(jù)并計(jì)算該組數(shù)據(jù)的平均值及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到牛百葉中甲醛在該溫度下的揮發(fā)情況。根據(jù)一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型定甲醛的揮發(fā)速率，建立式（1）。

式中：C為牛百葉樣品中甲醛含量，mg/kg；k為甲醛的衰減反應(yīng)數(shù)率系數(shù)；t為時(shí)間，h。所以甲醛的衰減也可以描述為：

式中：y為牛百葉樣品中甲醛含量，mg/kg，C0為牛百葉中甲醛的初始濃度，mg/L。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法的可靠性考察

在1.2.2的儀器條件下，以測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上6個(gè)不同濃度甲醛與2, 4-二硝基苯肼衍生化生成的2, 4-二硝基腙峰面積，測(cè)定其線(xiàn)性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)形回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線(xiàn)性范圍

通過(guò)液相色譜法試驗(yàn)條件的優(yōu)化，按照1.2.3配制標(biāo)準(zhǔn)工作液（0.01～10 mg/L，即為牛百葉中甲醛含量0.1～100 mg/kg）。結(jié)果表明，線(xiàn)性關(guān)系良好，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)大于0.999，滿(mǎn)足模擬試驗(yàn)甲醛的檢測(cè)要求，能夠準(zhǔn)確測(cè)定牛百葉中甲醛濃度。

2.2 牛百葉中甲醛的揮發(fā)

2.2.1 牛百葉在4 ℃貯藏條件下甲醛的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)

依據(jù)1.2的方法所測(cè)得的數(shù)據(jù)，以4 ℃時(shí)牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)與揮發(fā)時(shí)間作圖（見(jiàn)圖1）。

圖1 在4 ℃時(shí)牛百葉中甲醛的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)隨時(shí)間增加而減少，且在0～9 h的揮發(fā)量顯著性降低（見(jiàn)圖2）。根據(jù)式（3）建立一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即為lny=-0.009 4t+4.577 3；R2=0.958 9。故4 ℃時(shí)牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率k= 0.009 4。

圖2 4 ℃時(shí)牛百葉中甲醛揮發(fā)過(guò)程中時(shí)間與lnC的線(xiàn)性關(guān)系（0～9 h）

2.2.2 牛百葉在15 ℃貯藏條件下甲醛的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)

依據(jù)1.2的方法所測(cè)得的數(shù)據(jù)，在15 ℃時(shí)牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)與揮發(fā)時(shí)間作圖（見(jiàn)圖3）。

圖3 在15 ℃時(shí)甲醛在牛百葉中揮發(fā)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)隨時(shí)間增加而減少，且在0～9 h的揮發(fā)量顯著性降低（見(jiàn)圖4）。根據(jù)式（3）建立一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即為lny=-0.046 7t+4.562；R2=0.973 3。故15 ℃時(shí)牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率k= 0.046 7。

圖4 15 ℃時(shí)牛百葉中甲醛揮發(fā)過(guò)程中時(shí)間與lnC的線(xiàn)性關(guān)系（0～9 h）

2.2.3 牛百葉在35 ℃貯藏條件下甲醛的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)

依據(jù)1.2的方法所測(cè)得的數(shù)據(jù)，在35 ℃時(shí)牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)與揮發(fā)時(shí)間作圖（見(jiàn)圖5）。

圖5 在35 ℃時(shí)甲醛在牛百葉中揮發(fā)動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)

可見(jiàn)，牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)隨時(shí)間增加而減少，且在0～9 h的揮發(fā)量顯著性降低（見(jiàn)圖6）。根據(jù)公式（3）建立一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，即為lny=-0.063 7t+ 4.613 7；R2=0.954 8。故35 ℃時(shí)牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率k=0.063 7。

圖6 35 ℃時(shí)牛百葉中甲醛揮發(fā)過(guò)程中時(shí)間與lnC的線(xiàn)性關(guān)系（0～9 h）

2.2.4 不同溫度下對(duì)甲醛揮發(fā)性的影響

牛百葉試樣在1.2的試驗(yàn)條件下處理，計(jì)算出牛百葉中甲醛的初始含量及各個(gè)不同貯藏條件下甲醛的殘留量及揮發(fā)情況，根據(jù)甲醛殘留量隨時(shí)間的變化情況繪制曲線(xiàn)（見(jiàn)圖7，圖8）。

圖7 不同貯藏條件下牛百葉中甲醛殘留量隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)

結(jié)果表明，在不同貯藏條件下（4，15和35 ℃），放置相同時(shí)間后，牛百葉中甲醛在35 ℃條件下殘留量顯著低于15 ℃條件下；15 ℃條件下甲醛殘留量明顯低于4 ℃條件下，說(shuō)明牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率與放置時(shí)間和外界溫度有關(guān)。牛百葉中甲醛的殘留量隨溫度升高及放置時(shí)間增加而降低，在0～9 h之間有顯著的下降趨勢(shì)，在9～48 h之間，其揮發(fā)程度趨于穩(wěn)定。

由圖8可知，揮發(fā)量隨著溫度升高而增多。在9 h內(nèi)牛百葉中甲醛快速揮發(fā)，其甲醛減少量占整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程甲醛減少總量的60%以上，之后隨著單位時(shí)間增加，甲醛揮發(fā)速率逐漸減少，牛百葉中甲醛含量趨于穩(wěn)定?？赡艿脑蚴羌兹┦蔷哂幸欢〒]發(fā)性有機(jī)物[17]，其氣態(tài)沸點(diǎn)為-19.5 ℃，當(dāng)基質(zhì)所處環(huán)境溫度高于其沸點(diǎn)時(shí)基質(zhì)內(nèi)的甲醛就會(huì)揮發(fā)，而且揮發(fā)速率隨著溫度升高而增加[18-19]。

從圖1～圖6可以看出，牛百葉中甲醛殘留量的對(duì)數(shù)與揮發(fā)時(shí)間基本呈線(xiàn)性相關(guān)性。數(shù)據(jù)表明：甲醛的揮發(fā)速率在0～9 h明顯；9～48 h趨于放緩，且試驗(yàn)結(jié)果表明（圖8）隨著外界溫度升高甲醛的揮發(fā)速率增快?？赡艿脑蚴怯捎诩兹┦且环N易溶于水的物質(zhì)，而牛百葉中甲醛的釋放過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，隨著揮發(fā)時(shí)間增加，牛百葉中水分呈遞減趨勢(shì)，在0～9 h時(shí)牛百葉中水分基本保持穩(wěn)定，而在9～48 h牛百葉中水分發(fā)生明顯改變，導(dǎo)致牛百葉內(nèi)部濕度發(fā)生改變，使得甲醛的釋放速率減慢趨于平緩，故選擇0～9 h時(shí)間范圍內(nèi)數(shù)據(jù)作為揮發(fā)方程的參考值。

圖8 不同貯藏條件下牛百葉中甲醛的揮發(fā)量

分別采用零級(jí)、一級(jí)和二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程對(duì)牛百葉中甲醛（0～9 h）進(jìn)行揮發(fā)動(dòng)力學(xué)模型擬合，通過(guò)各個(gè)擬合方程的r值比較各擬合模型效果，結(jié)果表明一級(jí)模型擬合時(shí)r值最大效果最好。因此可以得出，在試驗(yàn)條件下牛百葉中甲醛的揮發(fā)過(guò)程符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，計(jì)算得到的參數(shù)很好地反映不同溫度條件下牛百葉中甲醛的動(dòng)力學(xué)情況，相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

由于食品中甲醛的含量在貯藏過(guò)程中會(huì)不斷變化，會(huì)受到各種內(nèi)外在因素的影響，如溫度、時(shí)間等[20]。試驗(yàn)表明自然揮發(fā)的主要影響因素是存放的溫度，隨著溫度升高，甲醛揮發(fā)數(shù)率增大（見(jiàn)表2），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加。

表2 不同貯藏條件下牛百葉中甲醛的揮發(fā)動(dòng)力學(xué)方程及相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論

試驗(yàn)?zāi)M非法添加甲醛后牛百葉中甲醛的揮發(fā)殘留量，結(jié)果表明陽(yáng)性樣品在不同溫度貯藏一定時(shí)間后甲醛殘留量有所減少，但是仍有部分殘留。牛百葉中甲醛的揮發(fā)基本符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)過(guò)程，牛百葉中甲醛的揮發(fā)速率與溫度有關(guān)，溫度越高，揮發(fā)速率越快；同一外界環(huán)境下，在0～9 h的揮發(fā)速率顯著，放置9 h后揮發(fā)趨于平緩。試驗(yàn)方法不足之處在于未能發(fā)現(xiàn)牛百葉中水分與甲醛揮發(fā)速率的相關(guān)性；因試驗(yàn)所用牛百葉測(cè)試樣品均制成糜狀，未能驗(yàn)證樣品不同狀態(tài)下對(duì)甲醛揮發(fā)速率是否存在影響；另外，甲醛試驗(yàn)對(duì)象僅為牛百葉，未能涉及到其他水發(fā)產(chǎn)品，無(wú)法驗(yàn)證甲醛揮發(fā)速率是否與樣品間的差異性相關(guān)。