王芬， 潘發(fā)蓮， 楊秀， 韋永歡， 裴會敏

黔南民族師范學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州 都勻 558000

蛋白質(zhì)相互作用是指互相物理接觸或者在功 能上有關(guān)的蛋白質(zhì)通過復(fù)雜多樣的相互作用連接形成網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)相互作用是探索生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，研究蛋白質(zhì)相互作用對理解和分析茶樹生物功能有著極其重要的意義。蛋白質(zhì)相互作用在蛋白功能預(yù)測、疾病的研究和預(yù)防、藥物候選研究等方面已得到廣泛應(yīng)用［1-3］。已有研究基于基因表達譜和核心連接方法從蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中識別蛋白質(zhì)復(fù)合物，研究結(jié)果在幫助了解細胞過程機制方面具有重要的生物學(xué)意義［4］。劉家俊等［5］通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)挖掘出了7個可能與小麥赤霉病抗性相關(guān)的蛋白，這些蛋白可能在響應(yīng)赤霉病中具有重要作用。Seong等［6］利用蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析了松仁油的脂肪調(diào)控機制，結(jié)果表明給小鼠口服松仁油可降低組織中的脂肪含量。崔紅梅［7］發(fā)現(xiàn)，研究在表觀遺傳修飾領(lǐng)域環(huán)境應(yīng)答基因孕烷受體參與的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，有助于開展環(huán)境應(yīng)答基因孕烷受體在細胞應(yīng)激反應(yīng)領(lǐng)域功能的探索。Adhami等［8］通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的方法重新篩選新冠病毒的治療候選藥物，發(fā)現(xiàn)CARBOPLATIN、CRIZOTINIB和CYTARABINE藥物是潛在的新型冠狀病毒肺炎治療藥物。

茶樹適應(yīng)于降雨量多、濕度大和溫度適中的地帶，具有適應(yīng)性廣、綜合性狀優(yōu)良的特性［9-10］。都勻毛尖茶是中國十大名茶之一［11］，福鼎大白茶是都勻毛尖茶的一個原料品種。茶樹在轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組和基因組等方面已有相關(guān)研究［12-15］，但是茶的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)方面研究較少。此外，茶樹的大多數(shù)生命活動都與蛋白質(zhì)相互作用密切相關(guān)。本研究利用三代Nanopore測序技術(shù)和同源比對的方法預(yù)測福鼎大白茶葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行功能模塊預(yù)測、拓撲屬性分析、集群注釋和聚類分析，以期為尋找關(guān)鍵蛋白、鑒定蛋白質(zhì)的功能和選育福鼎大白茶優(yōu)良品種等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441），ONT SQK-LSK109試 劑 盒 ，Nanodrop2000，Agilent RNA 6000 Nano Kit，SuperscriptⅣ reverse transcriptase，數(shù)字3×32PCR儀，PromethⅠ-ON測序儀，Cytoscape3.3.0和Cytoscap3.8.2軟件，ClusterViz軟件，Blast2GO v2.5。

1.2 方法

1.2.1 取樣 試驗材料選取黔南民族師范學(xué)院基地扦插的福鼎大白茶，在本實驗室培育的茶苗中選取培養(yǎng)條件相同、長勢情況基本一致、沒有被污染過的茶苗植株9株，分為3組，每組3株，每株取5片嫩葉分別放入離心管中并迅速放入液氮中，將9個樣本放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 差異表達分析 從-80℃冰箱取出福鼎大白茶的根莖葉共9個樣品，送至北京百邁客生物科技有限公司進行三代Nanopore測序，并利用CPM［16］進行基因表達量的分析，再對葉與根、葉與莖、莖與根的差異表達基因進行分析，將差異基因與STRING v11.5［17］數(shù)據(jù)庫進行同源比對得到葉與根、葉與莖、莖與根的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。這3個網(wǎng)絡(luò)用Cytoscape3.3.0［18］軟件進行可視化，最后對3個差異基因網(wǎng)絡(luò)進行合并，得到根、莖、葉的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，并對網(wǎng)絡(luò)進行功能模塊預(yù)測、拓撲特性分析、集群注釋和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵蛋白質(zhì)的篩選

利用Nanopore測序方法獲得福鼎大白茶葉、根和莖的全長轉(zhuǎn)錄組，然后利用CPM分別計算出葉、根和莖中基因的表達量，篩選出葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉的差異表達基因，將差異表達基因與STRING數(shù)據(jù)庫進行同源比對獲得葉與根、葉與莖、莖與根以及根、莖、葉的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（圖1）。4個網(wǎng)絡(luò)分別有2 951、1 717、1 420、3 704個蛋白，33 131、12 939、8 092、49 545個互作。然后利用Cytoscape3.3.0軟件篩選出4個網(wǎng)絡(luò)中度最大的關(guān)鍵蛋白分別有53、39、42和53個（表1）。圖1中V形、三角形、正方形、平行四邊形、菱形和六邊形節(jié)點代表關(guān)鍵蛋白。將4個網(wǎng)絡(luò)中的蛋白與GO、Swiss-Prot和NR 3個數(shù)據(jù)庫比對，預(yù)測出4個網(wǎng)絡(luò)中的幾個關(guān)鍵蛋白的功能。TEA003744存在于葉綠體膜上，具有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性和ATP結(jié)合性，參與光合作用和蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA026776具有蛋白激酶活性和ATP結(jié)合活性，參與蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA019056具有RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域激酶活性和ATP結(jié)合活性，參與蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA005686具有激酶活性，參與磷酸化過程。TEA007967具有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、2烯醛還原酶活性和ATP結(jié)合活性，參與氧化還原和蛋白質(zhì)磷酸化過程。TEA016315具有MAP激酶活性和ATP結(jié)合活性，參與MAPK級聯(lián)反應(yīng)。這些關(guān)鍵蛋白在茶樹生長過程中具有重要作用。

圖1 差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.1 Protein-protein interaction network of DEGs

表1 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵蛋白Table 1 The hub proteins in the PPIN

2.2 功能模塊

利用Cytoscape3.3.0軟件的插件MCODE預(yù)測葉與根、葉與莖、莖與根及根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的功能模塊，4個網(wǎng)絡(luò)得分最高的功能模塊分別為23.07，44個節(jié)點（蛋白）、496條邊（互作）；25.026，40個節(jié)點、488條邊；17.846，27個節(jié)點、232條邊；39.278，73個節(jié)點、1 414條邊（圖2）。將4個功能模塊分別與GO、Swiss-Prot和NR進行比對，預(yù)測出4個功能模塊的功能，葉與根差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中得分最高的功能模塊的功能可能為蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合活性、蛋白激酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性，可能參與蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程；葉與莖的功能模塊可能為蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合活性、核苷酸結(jié)合活性、蛋白激酶活性，可能參與蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程；莖與根的功能模塊可能為ATP結(jié)合活性、微管結(jié)合活性、ATP酶活性活性，可能參與基于微管的運動等生物過程；根莖葉功能模塊可能為蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、ATP結(jié)合活性、蛋白激酶活性等，可能參與蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程。通過功能模塊可以得到各功能模塊中的蛋白具有與功能模塊相關(guān)的功能。

圖2 4個網(wǎng)絡(luò)得分最高的功能模塊Fig.2 The four functional modules with the highest scores

2.3 拓撲屬性

利用Cytoscape3.3.0軟件對葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行拓撲特性分析［19］。度是指網(wǎng)絡(luò)中的一個點與其他點的連接數(shù)，度分布指網(wǎng)絡(luò)中度為k的節(jié)點出現(xiàn)的概率，本研究發(fā)現(xiàn)這4個網(wǎng)絡(luò)的度分布服從冪律分布規(guī)律，葉與根差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中 P（k）=725.42k-1.195，R2=0.708，相關(guān)性為 0.958；葉與莖 P（k）=544.77k-1.262，R2=0.790，相關(guān)性為 0.954；莖與根 P（k）=583.50k-1.388，R2=0.777，相關(guān)性為0.919；根莖葉 P（k）=867.73k-1.191，R2=0.714，相關(guān)性為0.953（圖3A）。中介中心性指網(wǎng)絡(luò)中兩個節(jié)點經(jīng)過其他為中介節(jié)點的最短路徑的個數(shù)，其計算公式見式（1），值介于0和1之間（圖3B）。

接近中心性是指網(wǎng)絡(luò)中某個節(jié)點與其他點之間的接近程度［20］，其計算公式見式（2）。

式中，L（j，i）是指從節(jié)點 j到i的最短路徑，其值也介于0和1之間（圖3C）。

聚合系數(shù)計算公式見式（3）。

式中，ka指節(jié)點a的全部鄰居數(shù)；ea指全部鄰居節(jié)點的連接邊數(shù)（圖3D）。

路徑的長度是形成路徑的邊數(shù)，可能有多個路徑連接兩個給定節(jié)點。兩個節(jié)點a和b之間的最短路徑長度用L（a，b）表示（圖3E）。拓撲系數(shù)是一個節(jié)點與其他節(jié)點共享鄰居的程度的相對度量［21］，拓撲系數(shù)計算公式見式（4）。

圖3 根莖葉差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)拓撲屬性Fig.3 Topological properties of the PPIN in root-stem-leaf

式中，J（a，b）是指所有節(jié)點a至少跟節(jié)點b共享一個鄰居節(jié)點，它的值是節(jié)點a和b共享的鄰居節(jié)點數(shù)（圖3F）。

利用Cytoscape3.8.2軟件中的插件CytoNCA對葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)進行分析，得出部分蛋白質(zhì)的中心性值的排名，進一步分析可知，葉與根的差異基因 TEA026776、TEA019056、TEA003744的度中心性和特征向量中心性分別為389.0和0.14 099 002，排名第一；TEA026734的中介中心性為141 918.7，排名第一；葉與莖的差異基因TEA019056、TEA003744的度中心性、特征向量中心性分別為231.0、0.176 189 48，排名第一；TEA005686的中介中心性為92 430.77，排名第一。莖與根的差異基因TEA003744度中心性、特征向量中心性分別為199.0、0.215 793 98，排名第一；TEA024522的中介中心性為118 051.8，排名第一。根莖葉的差異基因TEA026776、TEA019056、TEA003744的度中心性、特征向量中心性分別為492.0、0.128 961 82，排名第一，TEA005686的中介中心性為215 518.08，排名第一。排名越靠前代表這個蛋白質(zhì)越重要。通過對拓撲特性的分析表明這4個網(wǎng)絡(luò)是可靠的，符合一般網(wǎng)絡(luò)的特性。

2.4 集群注釋和聚類分析

2.4.1 集群注釋 通過Cytoscape3.8.2軟件中的插件AutoAnnotate［9］對4個網(wǎng)絡(luò)進行集群注釋，葉與根有24個集群，葉與莖有19個集群，莖與根有13個集群，根莖葉有17個集群。集群根據(jù)所選屬性的詞頻自動生成集群標(biāo)簽，這些集群突出了蛋白質(zhì)的共享關(guān)系。每個集群折疊成一個“元節(jié)點”并將集群之間的邊緣折疊成一個“元邊緣”來創(chuàng)建一個簡化的視圖，有助于蛋白功能預(yù)測，即在一個集群中的蛋白質(zhì)可能具有相似的功能。

2.4.2 聚類分析 聚類是將數(shù)據(jù)分成一簇或一類，在同一簇或一類比不同簇更具有相似性。通過 Cytoscape3.8.2 軟件中的插件 ClusterViz［22］的典型FAG-EC算法對4個網(wǎng)絡(luò)進行聚類分析，分別得到211、163、136、244個聚類簇，對節(jié)點數(shù)多的聚類簇進行分析（表2），通過聚類分析可幫助識別蛋白質(zhì)功能模塊和預(yù)測蛋白質(zhì)功能［23］。

表2 4個網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)多的聚類簇Table 2 The clusters with a large number of nodes among the four networks

3 討論

利用同源比對方法得到葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。4 個網(wǎng)絡(luò)分別有2 951、1 717、1 420、3 704個蛋白，33 131、12 939、8 092、49 545個互作。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)可以預(yù)測出關(guān)鍵蛋白和蛋白質(zhì)的功能。預(yù)測出4網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白分別有53、39、42和53個。通過對網(wǎng)絡(luò)進行拓撲屬性分析得出預(yù)測的網(wǎng)絡(luò)較可靠；通過對網(wǎng)絡(luò)進行功能模塊分析，可以預(yù)測蛋白質(zhì)的功能。研究結(jié)果為鑒定蛋白質(zhì)的功能和選育福鼎大白茶優(yōu)良品種等提供了理論依據(jù)。

本研究利用三代Nanopore測序技術(shù)對都勻福鼎大白茶根莖葉進行全長轉(zhuǎn)錄組測序，并利用同源比對方法得到葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。使用Cytoscape3.3.0軟件篩選出葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉的差異基因蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中度最大的關(guān)鍵蛋白，分別為53、39、42和53個，并預(yù)測出關(guān)鍵蛋白的功能。結(jié)果表明葉與根、葉與莖、莖與根和根莖葉差異基因的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵蛋白相互作用最多的5個蛋白TEA003744、TEA026776、TEA019056、TEA007967、TEA016315的分子功能都具有ATP結(jié)合活性，TEA003744、TEA026776、TEA019056、TEA007967蛋白都與蛋白質(zhì)磷酸化生物過程有關(guān)，TEA003744、TEA007967蛋白的分子功能都具有蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性，其他關(guān)鍵蛋白分子功能各異，例如，TEA003744具有光合作用、光反應(yīng)的調(diào)節(jié)能力；TEA026776具有蛋白激酶活性；TEA019056具有RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域激酶活性；TEA005686具有激酶活性、磷酸化功能；TEA007967具有2-烯醛還原酶［NAD（P）］活性、氧化還原過程；TEA016315具有MAPK級聯(lián)反應(yīng)、MAP激酶活性。以上結(jié)果表明，具有相同功能的關(guān)鍵蛋白表明在不同器官中具有相同的作用，是福鼎大白茶的生長發(fā)育過程中必不可少的蛋白。功能不同的關(guān)鍵蛋白在福鼎大白茶的不同部位發(fā)揮獨特的作用以完成茶樹的生命過程。TEA003744是蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶，具有ATP結(jié)合功能；TEA019056是RNA聚合酶Ⅱ羧基末端結(jié)構(gòu)域激酶，具有ATP結(jié)合功能；TEA005686具有激酶活性的功能，都參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，該結(jié)果與二代轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果［24］一致。

通過插件MCODE對網(wǎng)絡(luò)進行功能模塊分析，若一個功能模塊的功能已知，其中所有的蛋白可能具有與之相關(guān)的功能，或者是根據(jù)功能模塊中大部分蛋白的功能來推測功能模塊的功能。在葉與根的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的功能模塊中由 于 TEA005819、 TEA003983、 TEA009758、TEA012564、TEA016721、TEA018506具有ATP結(jié)合和轉(zhuǎn)移酶活性，因此推測其他非特征蛋白TEA021959、TEA005388、TEA013868也可能具有ATP結(jié)合和轉(zhuǎn)移酶活性等類似功能，通過這種方法可以預(yù)測出網(wǎng)絡(luò)中其他非特征蛋白質(zhì)的功能。本文預(yù)測出的功能模塊與前人相關(guān)研究［25-26］的功能模塊特征一致。因此，功能模塊對于預(yù)測蛋白質(zhì)的功能具有重要的作用，為培育優(yōu)良茶苗奠定了理論基礎(chǔ)。

通過拓撲屬性分析，得出4個網(wǎng)絡(luò)是比較可靠的，它符合網(wǎng)絡(luò)的一般特性與Li［25］的網(wǎng)絡(luò)特性一致。中心性排名越靠前則該蛋白越重要，說明以上蛋白質(zhì)在網(wǎng)絡(luò)中是核心蛋白，如果缺失或去掉，該網(wǎng)絡(luò)則會癱瘓。集群注釋和聚類分析的結(jié)果可為后期分子生物學(xué)分析提供一定的理論依據(jù)［27］。本研究為都勻福鼎大白茶關(guān)鍵蛋白及功能預(yù)測提供了一定的理論依據(jù)，并為選育優(yōu)良品種等提供了參考。