紀(jì)新博， 顧申紅， 麥華德， 符碧薇

(1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科, 海南 ?？?570100 2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院, 海南 ?？?571199)

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是一種由病毒感染及相關(guān)自身免疫性疾病引起的非缺血性炎癥性疾病，以心肌非特異性間質(zhì)性炎癥為主要病變，占心肌炎的絕大多數(shù)，也是引起年輕人心力衰竭、心律失常和猝死的重要原因[1]。流行病學(xué)研究表明，VMC的發(fā)病率每年約達(dá)到1.0～2.2百萬(wàn)[2]。VMC通常表現(xiàn)為胸痛、心悸、呼吸困難，部分患者可能發(fā)展為心力衰竭，給患者和社會(huì)均帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，抗病毒藥物、免疫抑制劑和循環(huán)支持是VMC的主要治療方法，但仍有許多患者在治療后發(fā)展為心力衰竭[3]。因此，探索VMC的發(fā)病機(jī)制及其新型有效治療方法仍是十分必要的。芳基烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，該基因位于人類7p21染色體上，在人體肺、腎、肝和胸腺等各器官組織中均表達(dá)。AhR在與配體如多環(huán)和鹵代芳烴及其他外源性物質(zhì)相互作用后，以異二聚體形式與AHR核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合，成為介導(dǎo)外源代謝和環(huán)境反應(yīng)的多功能蛋白質(zhì)，在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等方面均表現(xiàn)出不同的生物學(xué)作用，并參與調(diào)控先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)[4,5]。但關(guān)于AhR在VMC中的功能及作用研究報(bào)道相對(duì)較少，鑒于此，本研究通過(guò)柯薩奇B3病(coxsackievirus 3，CVB3)誘導(dǎo)構(gòu)建VMC小鼠模型，并給予AhR抑制劑CH223191進(jìn)行干預(yù)，旨在探討抑制AhR對(duì)VMC中心肌損傷的影響及其作用機(jī)制，從而為該疾病的臨床治療研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:60只健康BALB/c小鼠(購(gòu)于海南藥物研究所有限責(zé)任公司)，雄性，6周齡，體質(zhì)量20～22g，飼養(yǎng)于海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度設(shè)置為22～24℃，相對(duì)濕度為65%，并以12h/12h明暗周期交替。實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠均自由飲水與飲食。

1.2主要試劑與材料:AhR抑制劑CH223191購(gòu)于美國(guó)Selleckchem公司，CVB3購(gòu)于美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌種保存中心，cTnl、TNF-α、IL-1β及IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基生物公司，HE染色試劑盒購(gòu)于上海翌圣生物公司，TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物公司，DAPI染液瑞士Roche公司，Trizol試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程公司，DAB顯色試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白測(cè)定試劑盒、PVDF膜以及ECL試劑液均購(gòu)自上海碧云天生物研究所，抗體caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD及GAPDH等購(gòu)于英國(guó)Abcam公司。

1.3方 法

1.3.1動(dòng)物分組、造模及處理:將60只BALB/c雄性小鼠按照數(shù)字隨機(jī)表法分為4組：對(duì)照組(Control)、AhR抑制劑組(AhR inhibitor)、模型組(VMC)、VMC+AhR抑制劑組(VMC+AhR inhibitor)，每組15只。模型組和VMC+AhR抑制劑組的小鼠參考文獻(xiàn)方法[6]，通過(guò)腹腔注射0.1 mL CVB3病毒液(滴度為107 TCID50)構(gòu)建心肌炎動(dòng)物模型，對(duì)照組和AhR抑制劑組的小鼠同時(shí)腹腔注射等量PBS溶液。同時(shí)，AhR抑制劑組和VMC+AhR抑制劑組(VMC+AhR inhibitor)的小鼠參考文獻(xiàn)[7]按照10 mg/kg的劑量分別腹腔注射AhR抑制劑CH223191，對(duì)照組和模型組的小鼠均腹腔注射等量PBS溶液，連續(xù)10d。

1.3.2心臟超聲檢測(cè):各組小鼠給藥10d后，1.5%異氟烷吸入麻醉，固定在手術(shù)臺(tái)上，通過(guò)高分辨率Vevo2100小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)，記錄小鼠左心室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)、縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular internal diameter at end-diastole，LVIDd)以及左室舒張末期前壁厚度(left ventricular anterior wall during diastole，LVAWd)等心功能相關(guān)指標(biāo)。

1.3.3ELISA法:各組小鼠通過(guò)心臟取血，將血液標(biāo)本室溫靜置2h后，4℃下以4000r/min離心10min，收集上層血清，根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定各組小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β和IL-18的含量。

1.3.4HE染色:收集各組小鼠心臟標(biāo)本，清洗干凈，置于4%多聚甲醛中室溫固定過(guò)夜。次日，采用梯度乙醇對(duì)組織進(jìn)行脫水處理，二甲苯透明，蠟塊包埋，切片機(jī)上連續(xù)切片，制備厚度約為4μm的石蠟組織切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色，切片脫蠟水化，蘇木素染色5min，流水沖洗干凈，伊紅染液復(fù)染3min，經(jīng)過(guò)脫水與透明處理后，中性樹(shù)膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理改變并攝取圖像。

1.3.5TUNEL染色:將心肌組織石蠟切片脫蠟水化后，PBS清洗，加入100μL濃度為20μg/mL蛋白酶K工作液(不含DNase)，室溫水解15min，蒸餾水沖洗，封閉液封閉10min，取新鮮配置的50μL TUNEL檢測(cè)液滴加于切片上，37℃避光孵育1h。PBS清洗后，滴加DAPI染液，室溫避光孵育10min，含抗熒光淬滅劑封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察心肌組織細(xì)胞染色情況，并攝取圖像。TUNEL陽(yáng)性凋亡細(xì)胞染色顯示為綠色，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)固定視野范圍內(nèi)總細(xì)胞數(shù)目與TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，兩者比值為T(mén)UNEL細(xì)胞陽(yáng)性率。

1.3.6免疫組化染色檢測(cè):將心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，按照標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)進(jìn)行染色。將切片置于檸檬酸鹽液浸泡，高溫下修復(fù)抗原。放入新鮮配置的3%過(guò)氧化氫溶液中，室溫孵育10min，再置于5%山羊血清中，室溫封閉30min；分別加入兔抗NLRP3多克隆抗體(1∶200)與兔抗GSDMD多克隆抗體(1∶200)，置于4℃下孵育過(guò)夜。次日，棄原液，甩干切片，加入對(duì)應(yīng)二抗覆蓋切片，室溫繼續(xù)孵育1h；采用DAB試劑在室溫下顯色后，蘇木精復(fù)染5min，分化數(shù)秒，自來(lái)水沖洗干凈，經(jīng)過(guò)脫水與透明后，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下對(duì)免疫組織化學(xué)切片攝影，陽(yáng)性染色呈黃棕色至棕色，Image-Pro Plus6.0軟件測(cè)定陽(yáng)性染色的強(qiáng)度。

1.3.7實(shí)時(shí)熒光定量PCR:在無(wú)菌環(huán)境下將心肌組織剪碎，置于研缽并加入適量液氮充分研磨，取50mg研磨的粉末，利用Trizol試劑盒提取總RNA，Nano drop儀器測(cè)定RNA濃度與純度(OD260/280在1.8～2.1之間為合格)；去除gDNA后，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)合成cDNA，再以獲得的cDNA為模板，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)擴(kuò)增，定量各基因的mRNA表達(dá)水平，β-actin作為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)程序設(shè)置為：95℃預(yù)變性3min，1次循環(huán)；95℃變性20s，60℃退火15s，72℃延伸45s，42次循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，以2-ΔΔCt法計(jì)算各目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列

1.3.8Western blot:將心肌組織置于研缽內(nèi)，加入適量液氮充分研磨，添加新鮮配置的RIPA裂解液充分混勻，置于冰上裂解30 min，4℃下以12000 r/min離心20min，吸取上清，并以BCA法檢測(cè)蛋白濃度；制備10%SDS-PAGE，待膠凝固后，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算上樣體積，在梳孔內(nèi)加入等量蛋白樣品，通過(guò)電泳分離蛋白，切割分離蛋白的凝膠，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將其置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉1h。TBST洗膜，將膜與稀釋的一抗(caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD，均以1∶1000進(jìn)行稀釋)在4℃下共孵育過(guò)夜；次日，棄原液，TBST洗膜，加入對(duì)應(yīng)稀釋的二抗，室溫孵育1h，TBST再次洗膜后，以ECL顯色，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶，Image-Pro Plus 6.0軟件分析條帶灰度值，GAPDH作為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值比值作為各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1抑制AhR改善CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心功能:各組小鼠心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，VMC組小鼠FS和EF顯著下降(P<0.05)，LVIDd和LVAWd顯著增加(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠FS和EF顯著升高(P<0.05)，LVIDd和LVAWd顯著減小(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠心功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2抑制AhR改善CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌損傷:與對(duì)照組比較，VMC組小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β以及IL-18的含量均顯著上升(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠血清中cTnl、TNF-α、IL-1β以及IL-18的含量均顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清中cTnl TNF-α IL-1β和IL-18含量比較

2.3抑制AhR減輕CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌組織病變:通過(guò)HE染色觀察可見(jiàn)，對(duì)照組和AhR抑制劑組小鼠的心肌組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)明顯的損傷現(xiàn)象；VMC組小鼠心肌組織發(fā)生明顯病變，可見(jiàn)組織內(nèi)細(xì)胞排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分血管滲出蛋白黏液；而相較于VMC組，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，細(xì)胞排列較為整齊，病理?yè)p傷現(xiàn)象明顯減輕，見(jiàn)圖2。

圖2 HE染色觀察各組小鼠心肌組織病理學(xué)形態(tài)(×100)

2.4抑制AhR減少CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌細(xì)胞凋亡:TUNEL染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)心肌細(xì)胞凋亡，經(jīng)分析檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)染色區(qū)域明顯多于對(duì)照組，TUNEL陽(yáng)性率顯著升高(P<0.05)；而VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)染色區(qū)域明顯少于VMC組，TUNEL陽(yáng)性率顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

圖3 TUNEL染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡(×100)

2.5抑制AhR抑制CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3和GSDMD表達(dá):利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3和GSDMD表達(dá)，根據(jù)染色結(jié)果分析顯示，與對(duì)照組比較，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率和GSDMD陽(yáng)性表達(dá)率均顯著升高(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率和GSDMD陽(yáng)性表達(dá)率均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織NLRP3和GSDMD表達(dá)(×100)

2.6抑制AhR下調(diào)CVB3誘導(dǎo)的病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)基因/蛋白表達(dá):qRT-PCR測(cè)定各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)基因caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD在mRNA上的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)(P<0.05)；與VMC組比較，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 qRT-PCR測(cè)定各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)基因表達(dá)

Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，VMC組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD 的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；而相較于VMC組，VMC+AhR抑制劑組小鼠心肌組織內(nèi)caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD的蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 Western blot檢測(cè)各組小鼠心肌組織內(nèi)焦亡相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討 論

目前，已有多種病毒被認(rèn)為是引起心肌炎的病因，雖然通過(guò)心內(nèi)膜心肌活檢證明了細(xì)小病毒B19(PVB19)是心肌炎中最常見(jiàn)的病毒，但CVB3仍是導(dǎo)致人類和動(dòng)物病毒性心肌炎的主要病原體，大約25～27%擴(kuò)張型心肌病是由CVB3引起的。與其他多種病毒的模式相同，CVB3能夠通過(guò)對(duì)宿主造成直接損傷和宿主免疫系統(tǒng)功能異常誘導(dǎo)的間接損傷來(lái)引發(fā)VMC[3]。在本研究中，經(jīng)過(guò)CVB3誘導(dǎo)的小鼠表現(xiàn)出FS和EF下降，LVIDd和LVAWd增加，心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增多和心肌細(xì)胞壞死，由此表明CVB3小鼠模型構(gòu)建成功。

VMC的主要特征是由病毒感染引起的心肌實(shí)質(zhì)或間質(zhì)的局部性或彌漫性病變。機(jī)體受到感染后，如果免疫系統(tǒng)無(wú)法消除病毒，可觸發(fā)針對(duì)心肌的自身免疫反應(yīng)，這需要激活浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞、自身反應(yīng)性T細(xì)胞、細(xì)胞因子以及產(chǎn)生交叉反應(yīng)抗體，因此，可以將VMC的發(fā)病機(jī)制視為一種炎癥過(guò)程[8]。由于人類VMC的確切病理生理機(jī)制仍未完全明了，因此，該病的診斷和治療仍然具有較大的挑戰(zhàn)性。目前，心內(nèi)膜心肌活檢結(jié)合組織學(xué)、免疫學(xué)和分子學(xué)技術(shù)有助于VMC的診斷。然而，由于在VMC的早期疾病階段僅存在少數(shù)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)位點(diǎn)，因此仍難以獲得準(zhǔn)確的診斷。

越來(lái)越多的研究表明，AhR是一種重要的疾病調(diào)節(jié)劑，尤其是AhR在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中具有關(guān)鍵作用。已知AhR與多種由免疫或炎癥過(guò)程驅(qū)動(dòng)的疾病有關(guān)，包括重度抑郁癥、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘等[9,10]。作為一種高度保守的核受體，AhR可在配體結(jié)合后調(diào)節(jié)基因表達(dá)，因此，AhR影響免疫或炎癥疾病的機(jī)制可概括為靶向基因表達(dá)。關(guān)于AhR在各種疾病引起的心臟功能異常中作用也已有相關(guān)報(bào)道，且多項(xiàng)研究表明AhR參與了心血管結(jié)構(gòu)及功能異常的發(fā)病機(jī)制，例如，AhR通過(guò)增強(qiáng)c-Jun/HIF-1α信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠心臟纖維化，由此表明了AhR信號(hào)通路在心臟纖維化發(fā)展中的致病作用[11]；在心肌細(xì)胞中消融AhR基因可保護(hù)雄性小鼠免受因NKX2.5單倍體不足引起的心臟功能障礙[12]。由此推測(cè)，抑制AhR可能在一些疾病中發(fā)揮組織保護(hù)作用。鑒于上述內(nèi)容，本研究通過(guò)在CVB3誘導(dǎo)VMC小鼠模型后給予AhR抑制劑CH223191作用，檢測(cè)結(jié)果顯示出小鼠心功能得到恢復(fù)，心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及損傷現(xiàn)象得到有效緩解，這表明抑制AhR對(duì)CVB3誘導(dǎo)VMC小鼠心功能及心肌組織損傷起到保護(hù)作用。

細(xì)胞焦亡是一種程序性細(xì)胞死亡途徑，其特征是DNA裂解、細(xì)胞膜孔形成、細(xì)胞內(nèi)容物釋放和細(xì)胞腫脹，其發(fā)生取決于炎癥因子的激活。NLRP3可以通過(guò)識(shí)別同源配體與ASC結(jié)合形成分子復(fù)合物，觸發(fā)形成炎癥小體以激活caspase-1，活化的caspase-1促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟從而誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及caspase-1介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡；GSDMD在細(xì)胞焦亡中作為效應(yīng)分子，其既是caspase-1的下游分子，又是NLRP3炎性體的上游激活蛋白，此外，GSDMD也能夠通過(guò)促進(jìn)IL-1β分泌來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[13,14]。本研究結(jié)果顯示，在CVB3誘導(dǎo)VMC小鼠中使用AhR抑制劑CH223191作用后，心肌組織內(nèi)NLRP3陽(yáng)性表達(dá)率和GSDMD陽(yáng)性表達(dá)率均降低，caspase-1、ASC、NLRP3及GSDMD在mRNA和蛋白上的表達(dá)水平均下調(diào)，說(shuō)明心肌組織內(nèi)細(xì)胞焦亡受到抑制，這一現(xiàn)象可能與抑制AhR后發(fā)揮的心肌保護(hù)功能相關(guān)。

綜上所述，對(duì)于CVB3誘導(dǎo)VMC小鼠而言，通過(guò)靶向抑制AhR能夠改善心功能障礙，減輕心肌損傷，并抑制心肌細(xì)胞焦亡。本研究初步明確了AhR在CVB3誘導(dǎo)的VMC動(dòng)物模型中的作用及機(jī)制，豐富了VMC相關(guān)潛在疾病標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，但該結(jié)果能否用于臨床治療工作中，有待后續(xù)進(jìn)行深入探討。