何 玲， 侯 麗， 趙 婧

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院兒科， 四川 南充 637000)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是一種常見的早產(chǎn)兒腸道急癥，主要表現(xiàn)是小腸結(jié)腸斑片狀壞死，由于早期癥狀體征不典型，傳統(tǒng)實驗室檢測缺乏特異性，往往容易漏診，具有較高的死亡率[1]。目前研究表明，NEC與早產(chǎn)、感染、缺氧等多因素有關(guān)，但其具體調(diào)控機制仍不清楚[2]。有研究表明，NEC與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常密切相關(guān)，且NEC患兒病情越重，神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)局越差[3,4]。其原因可能與腸道炎癥反應導致腦損傷有關(guān)。趨化因子與其受體結(jié)合，在細胞生長、增殖、分化、凋亡等病理改變中發(fā)揮重要作用，是參與炎癥反應的重要介質(zhì)。CXCL1/CXCR2是趨化因子及其受體家族中常見的亞群。研究已證實，CXCL1/CXCR2在參與了腸道炎癥的調(diào)控過程[5]，但是否對NEC所致的腦損傷是否具有調(diào)控作用尚無報道。本研究旨在通過構(gòu)建新生大鼠NEC模型，檢測其腸、腦組織中CXCL1、CXCR2表達的變化，探討CXCL1/CXCR2在NEC及其相關(guān)腦損傷中的作用。

1 資料與方法

1.1實驗動物:本研究已通過川北醫(yī)學院動物實驗倫理審查。購自川北醫(yī)學院實驗動物中心SPF(Specific Pathogen Free) 級即將臨產(chǎn)的 SD大鼠孕鼠于川北醫(yī)學院實驗動物中心大鼠專用飼養(yǎng)間由專業(yè)人員喂養(yǎng)等待自然分娩，大鼠實驗動物許可證號:SYSK(川)2018-076，實驗對象為出生1日齡的新生SD大鼠43只(1只不明原因死亡)，雌雄不限。

1.2實驗分組及NEC模型建立:按隨機配對原則將新生鼠分為實驗組(21只)和對照組(21只)。NEC模型建立參照以往經(jīng)典的造模方式[6]。實驗組通過葡聚糖硫酸鈉鹽(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)處理，將DSS加入生理鹽水中配制成3%溶液，每次每只新生鼠灌胃量為0.1mL，所有新生大鼠每天同一時間開始灌胃，間隔 3h 灌胃一次，每天4次，共灌胃3d。同時空白對照組給與生理鹽水灌胃，劑量及時間同DSS實驗組。

1.3標本取材:兩組新生鼠分別于灌胃后3h、24h、72h時，采用斷頭處死新生鼠留取全腦及全腸組織(每個時間點各組各取6只，另于72h各組各取3只作病理組織檢測)，具體步驟如下：七氟烷吸入麻醉，斷頭，剪開頭皮，撥開顱骨，露出大腦，于視神經(jīng)及腦干處游離出全腦組織，裝于標本盒中。自腹正中線打開腹腔，分離腸系膜及血管，取出整個腸道立刻放置于提前準備好的4℃無菌生理鹽水中清洗。取腦、腸組織裝于標本盒中，放于液氮中速凍10min后，放入-80℃冰箱保存。作病理組織檢測的標本取下后置于裝有50mL 4%PFA (多聚甲醛)的標本盒中，放入冰箱中冷藏保存24～48h備用。分別對腦、腸組織進行病理切片，通過蘇木精-伊紅染色后，每只新生鼠隨機選取一張腸、腦組織切片(共6張)，在光鏡下(腸組織×100倍，腦組織×400倍)隨機5個視野進行觀察。

1.4CXCL1及CXCR2蛋白含量檢測:應用蛋白質(zhì)印跡法即Western Blot檢測實驗組及對照組新生鼠灌胃后3h、24h、72h時全腦、全腸組織CXCL1及CXCR2蛋白含量(各組各時間點各6只)。分別于冰箱中取大鼠腦、腸樣本，然后向每管加入RIPA裂解液(按照質(zhì)量比大鼠腦、腸:裂解液=1∶10)，裂解；收集裂解液，離心；離心完后取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。制備SDS-PAGE凝膠后，上樣，轉(zhuǎn)膜，封閉。加入一抗(濃度：CXCL1 1∶1000；CXCR2 1∶1000；β-actin 1∶100000)，4℃過夜孵育。次日用TBST進行快速搖洗5min×3次后，加入二抗(稀釋濃度：1∶5000)，室溫孵育2～3h。洗膜、顯影、定影、曝光，凝膠成像系統(tǒng)分析，GelPro軟件進行圖像處理，Graphpad Prism 6、Photoshop軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1兩組新生大鼠腸、腦組織的病理改變:大體觀察，與對照組比較，實驗組大鼠腸組織腸道腫脹，腸腔積氣明顯，腸壁變薄(圖1)；HE染色發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，實驗組腸組織絨毛有受損、脫落和壞死，腸腺體紊亂、缺失，黏膜下及肌層有水腫、分離，基底變薄，有一定數(shù)量的炎癥細胞浸潤；腸道組織病理評分均超過2分(圖2)。實驗組腦組織細胞層次結(jié)構(gòu)不清，室周白質(zhì)多孔、疏松，膠質(zhì)細胞減少(圖3)。

圖1 對照組(A)和實驗組(B)新生大鼠腸組織大體病理變化

圖2 對照組(A)和實驗組(B)新生大鼠光鏡下(100×)腸組織病理變化

圖3 對照組(A)和實驗組(B)新生鼠光鏡下(400×)腦組織病理變化

2.2兩組新生鼠腸、腦組織中CXCL1、CXCR2蛋白表達情況

2.2.1兩組新生鼠腸組織中CXCL1、CXCR2蛋白表達情況:與對照組相比，實驗組新生鼠腸組織中CXCL1蛋白含量在灌胃后3h、72h均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=9.476，P<0.05)，而灌胃后24h時差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與對照組相比，實驗組新生鼠腸組織中CXCR2蛋白含量在灌胃后3h、24h、72h差異均無統(tǒng)計學意義(F=2.012，P>0.05)，見圖4。

圖4 兩組新生鼠腸組織中CXCL1、CXCR2蛋白含量

2.2.2兩組新生鼠腦組織中CXCL1、CXCR2蛋白表達情況:與對照組相比，實驗組新生鼠腦組織中CXCL1蛋白含量在灌胃后3h、24h差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)；而在灌胃后72h，DSS處理組新生鼠腦組織中CXCL1蛋白含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(F=35.767，P<0.05)；與對照組相比，實驗組新生鼠腦組織中CXCR2蛋白含量在灌胃后3h、24h、72h均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(F=50.083，均P<0.05)，見圖5。

圖5 兩組新生鼠腦組織中CXCL1、CXCR2蛋白含量

3 討 論

NEC是早產(chǎn)兒最嚴重的胃腸道疾病，也是早產(chǎn)兒最常見的死亡原因之一。研究報道，新生兒重癥監(jiān)護病房中NEC發(fā)生率約為7%，死亡率為10～30%，存活的部分患兒遠期仍遺留神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥[7]。Biouss G等實驗表明新生鼠NEC與腦損傷有關(guān)，且腦損傷嚴重程度與NEC嚴重程度相關(guān)，而抑制炎癥反應可以減輕NEC導致的不良神經(jīng)系統(tǒng)預后[8]。NEC患兒發(fā)生腦損傷的病因復雜，系多因素所致，其分子機制水平研究是目前的研究熱點。CXCL1是重要的中性粒細胞趨化因子，CXCR2是其受體，它們參與炎癥、神經(jīng)元生長發(fā)育、少突膠質(zhì)細胞增殖、遷移等，在腸、腦發(fā)育及損傷中均有重要作用[9]。在動物實驗絨毛膜羊膜炎中CXCL1/CXCR2信號通路異常通過胎盤-胎兒-腦軸導致圍產(chǎn)期腦損傷。

本研究結(jié)果顯示經(jīng)3%DSS灌胃P1大鼠可成功構(gòu)建NEC模型；同時灌胃后72h，實驗組新生鼠腦組織出現(xiàn)病理損傷表現(xiàn)，以腦室周圍白質(zhì)明顯，表明腸道炎癥之后繼發(fā)了腦損傷。灌胃后3h、72h時，實驗組腸組織中CXCL1蛋白表達較對照組升高，但在灌胃24h時升高不明顯，可能與腸道自身修復機制有關(guān)。在灌胃后72h，實驗組新生鼠腦組織CXCL1蛋白表達較對照組明顯增高，但在灌胃后3h、24h升高不明顯，說明腦組織中的炎癥表達較腸組織有延遲，也證實了NEC相關(guān)的腦組織炎癥繼發(fā)于腸道炎癥之后，這可能與外周炎癥反應、炎癥因子通過腸腦軸導致腦組織炎癥反應過程相關(guān)，同時也表明，CXCL1參與了NEC相關(guān)性腦損傷。灌胃后3h、24h、72h，實驗組腸組織中CXCR2表達較對照組差異無顯著性，與既往研究報道一致，分析原因，可能與CXCR2主要表達分布有關(guān)，CXCR2主要表達于外周中性粒細胞及少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元細胞等；也可能與外周血液系統(tǒng)可能是腸腦軸中免疫調(diào)節(jié)的重要介質(zhì)有關(guān)。以往研究發(fā)現(xiàn)，在腦卒中患者以及全身應用LPS和單側(cè)頸動脈結(jié)扎動物模型中均發(fā)現(xiàn)腦組織中CXCL1和CXCR2表達增高[10]。抑制CXCR2可減輕中性粒細胞遷移入腦、減輕腦損傷[11]。說明，CXCR2在腦損傷中發(fā)揮著重要的作用，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，灌胃后3h、24h、72h實驗組腦組織中CXCR2表達增高，表明CXCR2參與了NEC相關(guān)損傷。

本研究未對腸、腦組織中CXCL1/CXCR2在轉(zhuǎn)錄水平進行分析；未進一步對CXCR2受體進行阻斷實驗；也未檢測其在成熟大鼠的表達情況及檢測外周和中樞中性粒細胞、神經(jīng)系統(tǒng)損傷相關(guān)膠質(zhì)細胞活化情況等，在將來的實驗中可以進一步深入研究。

綜上所述，CXCL1/CXCR2在新生鼠NEC及其所致腦損傷中發(fā)揮作用，但其具體作用機制尚不明確，有待于進一步研究。CXCL1/CXCR2信號通路可能成為臨床治療的新靶點，減輕NEC后炎癥反應及其繼發(fā)性腦損傷，改善神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)局。