康建軍， 高 樂

(陜西省榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科， 陜西 綏德 718000)

肺癌是全球最常見的癌癥類型，死亡率高。2020年中國癌癥新發(fā)病例數(shù)和癌癥死亡病例數(shù)最高的均是肺癌[1]。盡管目前的放療、化療、靶向治療等手段可以較好的控制肺癌進(jìn)展，但癌癥干細(xì)胞(Cancer stem cell，CSC)的存在常常引起腫瘤復(fù)發(fā)及化療耐藥。與普通腫瘤細(xì)胞相比，CSC顯示出強大的自我更新和分化能力，雖然CSC在大多腫瘤中廣泛報道，但在肺癌中關(guān)于CSC的具體作用調(diào)控機制還不甚清楚[2]，故當(dāng)前針對肺癌干細(xì)胞的靶向治療十分迫切。HOXC10 基因是 HOX 基因家族的一員，在哺乳動物的生理過程中起著至關(guān)重要的作用，如肢體發(fā)育、肢體再生和腰椎運動神經(jīng)元分化。HOXC10 還與血管生成、脂肪代謝和性別調(diào)節(jié)有關(guān)。HOXC10是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過調(diào)節(jié)ERK、AKT、p65和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因等多種靶分子來激活多種致癌途徑，還可通過促進(jìn)DNA修復(fù)途徑誘導(dǎo)腫瘤耐藥性，近期研究人員將HOXC10報告為NSCLC細(xì)胞中一種新的腫瘤促進(jìn)癌基因[3]，而HOXC10的異常高表達(dá)是否影響腫瘤干細(xì)胞仍無研究報告。胱抑素SN(胱抑素1，CST1)促進(jìn)多種癌癥的進(jìn)展[4]，CST1對甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞生長、侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和干性等具有重要調(diào)控功能[5]。研究發(fā)現(xiàn)，HOXC10可以通過調(diào)控CST1的水平影響胃癌細(xì)胞的遷移和增殖[6]。但目前尚無文獻(xiàn)報道HOXC10和CST1與肺癌干細(xì)胞的關(guān)系，我們猜想HOXC10是否可以調(diào)控CST1進(jìn)而影響肺癌細(xì)胞干性。為此，本研究探討HOXC10通過調(diào)控CST1的表達(dá)，對肺癌細(xì)胞干性的影響，為針對肺癌干細(xì)胞治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞系及試劑:人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549(CL-0016)購買武漢普諾塞公司。胎牛血清購買自Hyclone公司，DMEM培養(yǎng)基和DMEM-F12培養(yǎng)基購買自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，總RNA提取試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司，Primescript RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京智杰遠(yuǎn)科技有限公司，CCK-8試劑盒購自Biosharp公司，qPCR引物由金唯智生物科技有限公司合成。ShNC、ShHOXC10慢病毒載體由上海吉瑪基因負(fù)責(zé)構(gòu)建和包備，CST1過表達(dá)載體pcDNA3.1-CST1由本實驗室構(gòu)建、PGL6-CST1-2000熒光報告質(zhì)粒由本實驗構(gòu)建，Lipofectamine 2000購自日本TaKaRa公司，一抗Actin Beta(#4970)、SOX2(#3579)、Nanog(#8822)、OCT4(#2750)、CD44(#96848)、CD133(#64326)均購買自CST，HOXC10(ab153904)購買自Abcam公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549在常規(guī)條件下(DMEM培養(yǎng)液中胎牛血清濃度為10%，5% CO2，37℃)過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時備用。按照吉瑪基因給的慢病毒感染操作手冊，構(gòu)建ShNC和ShHOXC10細(xì)胞，感染48h后使用2μM嘌呤霉素篩選2周。生長至對數(shù)生長期時用胰酶消化、計數(shù)，然后接種于6孔板，培養(yǎng)24h以備轉(zhuǎn)染。嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000試劑盒說明書將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CST1至ShHOXC10 A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果，并通過qPCR和蛋白質(zhì)印記法檢測各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

1.3CCK-8細(xì)胞增殖檢測:ShNC、ShHOXC10、ShHOXC10+OE_CST1組細(xì)胞以每孔2000個細(xì)胞接種于96孔板中，每孔體積為100ul，設(shè)置6個平行實驗對照。在細(xì)胞孵育0h、24h、48h、72h、96h、120h時，每孔添加10μL CCK-8溶液，將細(xì)胞在37℃下孵育2h，并在酶標(biāo)儀中于450nm波長讀取吸光度。

1.4CST1啟動子活性檢測載體構(gòu)建:使用賽默飛的基因組DNA純化試劑盒(K0512)提取A549細(xì)胞基因組，PCR法擴增CST1基因上游2000BP啟動子序列(F：cccaagcttatggagaccaaacgggt，R：cgcggatcctcaaaggtccaagattttca)，克隆插入PGL6熒光素報告載體。

1.5蛋白質(zhì)印記法檢測CD44、CD133等蛋白表達(dá):胰酶消化人肺癌A549細(xì)胞，離心5min，PBS溶液洗滌，棄上清，重覆3次。提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。每組取50μg進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白條帶，用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45um的PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，加入一抗(1∶500)，4℃孵育過夜；次日，TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h；TBST洗滌3次后加入ECL化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影，然后在凝膠成像儀上觀察拍照。

1.6腫瘤成球分析:在人肺癌細(xì)胞A549狀態(tài)良好時使用胰蛋白酶-EDTA溶液消化貼壁生長的各組細(xì)胞，在非粘附的24孔板中每孔接種500個細(xì)胞，然后在含有B27(20ng/mL)和表皮生長因子(10ng/mL)的無血清DMEM-F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每兩天后，通過添加新鮮的無血清培養(yǎng)基補充舊培養(yǎng)基，而無需去除舊培養(yǎng)基。培養(yǎng)14d后計數(shù)大于100μm的球體，每孔設(shè)置三個平行，并重復(fù)三遍。后續(xù)下游實驗均采用體積大于100μm的腫瘤球。細(xì)胞球形成效率(Sphere Formation Efficiency，SFE)：SFE=每孔中直徑大于100μm的細(xì)胞球的個數(shù)/每孔中原始接種細(xì)胞的總數(shù)

1.7雙螢光素酶報告基因檢測:HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGL6-CST1-2000熒光素酶報告基因質(zhì)粒，用PBS洗滌，并用裂解緩沖液裂解。13000g，5min離心收集上清液，并按照制造商的說明進(jìn)行雙熒光素酶測定(Promega)。轉(zhuǎn)染效率通過海腎熒光素酶的共表達(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8肺癌小鼠皮下瘤模型構(gòu)建:BALB/c免疫缺陷雌鼠12只，3～4周齡，體重為12～15g，由西安交通大學(xué)實驗動物中心提供。將12只小鼠隨機均分為兩組：ShNC組(接種ShNC A549細(xì)胞)、ShHOXC10組(接種ShHOXC10 A549細(xì)胞)。收集生長狀態(tài)良好，細(xì)胞活率>98%的兩組細(xì)胞，以1×107個/100μL/只接種于小鼠右側(cè)腋窩皮下，當(dāng)有腫瘤塊生成時，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤體積，腫瘤體積計算(V=1/2LS2，L長徑，S短徑)。接種30d后脫頸處死全部小鼠，測量瘤體重量。

1.9免疫組化:肺癌小鼠腫瘤組織用固定劑(甲醇：丙醇，1∶1)固定，切片和復(fù)水后用0.3%Triton X-100孵育。用anti-HOXC10、anti-CST1、anti-CD44、anti-CD133抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測。

1.10統(tǒng)計學(xué)處理:使用SPSS20軟件進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad7.0軟件進(jìn)行相關(guān)圖片繪制。所有實驗獨立重復(fù)3次，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 qPCR引物

2 結(jié) 果

2.1HOXC10調(diào)控肺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特征:通過無血清富集培養(yǎng)，在A549肺癌細(xì)胞系中成功生長出腫瘤球(圖1A)。Western Blotting結(jié)果顯示，HOXC10在腫瘤球中的蛋白表達(dá)水平高于貼壁細(xì)胞部分，且干性標(biāo)志蛋白CD44、CD133、SOX2、Nanog、OCT4等蛋白水平在腫瘤球部分也顯著提升(圖1B)。當(dāng)在A549細(xì)胞中敲低HOXC10時，相較于ShNC組，ShHOXC10組的干性標(biāo)志蛋白CD44、CD133、SOX2、Nanog、OCT4明顯下調(diào)(圖1C)。腫瘤成球?qū)嶒烇@示，ShHOXC10組(1.48%±0.16)細(xì)胞腫瘤成球能力顯著低于ShNC組(3.89%±0.38)細(xì)胞(P<0.001，圖1D)，細(xì)胞活力實驗顯示，相較于ShNC組，ShHOXC10組細(xì)胞活力在第3天后顯著降低(圖1E)。上述結(jié)果表明，HOXC10在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的腫瘤球部分顯著上調(diào)，敲低HOXC10可抑制干性標(biāo)志蛋白CD44、CD133、SOX2、Nanog、OCT4等表達(dá)，抑制A549細(xì)胞的細(xì)胞增殖和腫瘤成球能力。

圖1 HOXC10調(diào)控肺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特征

2.2敲除HOXC10可減少肺癌細(xì)胞小鼠成瘤能力及干性特征:測定腫瘤細(xì)胞成瘤能力分析結(jié)果顯示，相較于ShNC組小鼠，ShHOXC10組小鼠的腫瘤體積顯著減小(P<0.01，圖2A、2B)。測定腫瘤重量結(jié)果顯示，ShHOXC10組(1.47±0.23g)小鼠的腫瘤重量顯著低于ShNC組(0.45±0.19g)小鼠(P<0.0001，圖2C)。此外，免疫組化實驗結(jié)果顯示相對于ShNC組，ShHOXC10組小鼠腫瘤組織中的HOXC蛋白顯著下調(diào)，并且CST1、CD44、CD133蛋白水平也明顯降低(圖2D)。上述結(jié)果表明，敲除HOXC10抑制A549細(xì)胞在小鼠中的腫瘤體積與重量，并且抑制干性標(biāo)志蛋白CD44、CD133和CST1的表達(dá)。

圖2 敲除HOXC10可減少肺癌細(xì)胞小鼠成瘤能力及干性特征

2.3HOXC10調(diào)控CST1轉(zhuǎn)錄:qPCR結(jié)果顯示，ShHOXC10組(0.34±0.15)A549細(xì)胞中CST1 mRNA水平顯著低于ShNC組(0.97±0.21)(P<0.01，圖3A)。Western Blotting檢測結(jié)果顯示，相較于ShNC組，ShHOXC10組的CST1蛋白表達(dá)水平降低(圖3B)。ChIP-PCR和ChIP-qPCR結(jié)果顯示，HOXC組成功富集到大量CST1啟動子序列(P<0.01，圖3C、3D)。雙熒光素酶報告實驗顯示，ShHOXC10組(0.46±0.23)中的CST1啟動子活性顯著低于ShNC組(0.96±0.18)(P<0.01，圖3E)。上述結(jié)果表明，在肺癌細(xì)胞A549中，敲低HOXC10，CST1的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)，并且HOXC10與CST1的啟動子序列結(jié)合，敲低HOXC10后，CST1的啟動子活性被顯著下調(diào)。

圖3 HOXC10調(diào)控CST1轉(zhuǎn)錄

圖4 過表達(dá)CST1逆轉(zhuǎn)HOXC10調(diào)控A549細(xì)胞干細(xì)胞樣性狀

2.4過表達(dá)CST1逆轉(zhuǎn)HOXC10調(diào)控A549細(xì)胞干細(xì)胞樣性狀:WesternBlotting檢測結(jié)果顯示，相較于ShNC組，ShHOXC10組細(xì)胞中CST1、CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4蛋白水平明顯降低，但是過表達(dá)CST1后，ShHOXC10+OE_CST1組細(xì)胞中CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4等蛋白水平顯著高于ShHOXC10組，與ShNC組表達(dá)水平無明顯差異(圖4A)。腫瘤成球?qū)嶒烇@示，相較于ShNC組(4±0.36)%，ShHOXC10組(1.2±0.24)%細(xì)胞腫瘤成球能力顯著降低；而ShHOXC10+OE_CST1組(3.9±0.15)%細(xì)胞的腫瘤成球能力顯著高于ShHOXC10組，與ShNC組無顯著差異(P>0.05，圖4B)。CCK8實驗結(jié)果顯示，ShHOXC10組細(xì)胞增殖能力顯著低于ShNC組和ShHOXC10+OE_CST1組細(xì)胞(P<0.01，圖4C)。上述結(jié)果表明，過表達(dá)CST1可以上調(diào)CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4蛋白水平，增強A549細(xì)胞的腫瘤成球能力和細(xì)胞增殖能力。

3 討 論

肺癌是最常見腫瘤發(fā)病率和死亡率極高。雖然放療和化療能在一定程度上延緩腫瘤進(jìn)展，但患者的五年生存率仍不足15%。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞的存在是肺癌耐藥和復(fù)發(fā)的重要原因。原癌基因HOXC10在多種腫瘤中被異常激活或高表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，通過抑制腫瘤細(xì)胞的分化與增殖調(diào)控腫瘤細(xì)胞的命運。之前的研究表明HOXC10對綿羊骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(sBMSCs)增殖和成脂分化起著至關(guān)重要的作用[7]；研究人類胎盤的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)中的HOX基因發(fā)現(xiàn)，HOXC10在羊膜來源的MSC中高表達(dá)；并且HOXC10還可維持小鼠MSC的干性，抑制其成骨分化潛能[8]。這充分表明了HOXC10在維持干細(xì)胞干性，抑制分化的潛能，但沒有文獻(xiàn)報告腫瘤組織中異常升高的HOXC10是否和腫瘤干細(xì)胞有關(guān)。本研究表明在肺癌A549細(xì)胞系形成的腫瘤球中HOXC10和腫瘤干細(xì)胞蛋白標(biāo)志CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4等表達(dá)水平顯著高于正常貼壁A549細(xì)胞。當(dāng)在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中敲低HOXC10的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞的腫瘤成球能力顯著降低，且腫瘤球內(nèi)的腫瘤干細(xì)胞蛋白標(biāo)志CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4等表達(dá)水平顯著降低。相較于ShNC組，ShHOXC10組細(xì)胞的增殖能力也顯著降低。這表明HOXC10可促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖能力和腫瘤成球能力，并且調(diào)控腫瘤干細(xì)胞蛋白標(biāo)志CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4等的表達(dá)，HOXC10可調(diào)控肺癌干細(xì)胞性狀。

進(jìn)一步通過構(gòu)建肺癌小鼠皮下瘤模型研究發(fā)現(xiàn)，ShHOXC10組A549細(xì)胞腫瘤體積和大小均顯著低于ShNC組A549細(xì)胞，說明敲低HOXC10抑制了A549細(xì)胞的腫瘤形成能力。腫瘤組織免疫組化實驗顯示，ShHOXC10組腫瘤組織內(nèi)的HOXC10表達(dá)水平顯著低于ShNC組，且細(xì)胞增殖指標(biāo)Ki67在ShHOXC10組也顯著降低，干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD44和CD133也發(fā)生顯著的下降。至此，體內(nèi)實驗進(jìn)一步顯示，HOXC10的敲低抑制了腫瘤形成能力和對干細(xì)胞樣特性的調(diào)控。

Cystatin SN(胱抑素1，CST1)是胱抑素超家族的成員，可抑制半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。CST1是一種腫瘤生物標(biāo)志物，可為食管癌、胃癌和結(jié)直腸癌、胰腺癌的診斷提供有用的信息。CST1在腫瘤中的異常高表達(dá)受上游轉(zhuǎn)錄因子、MicroRNA等的調(diào)控，在結(jié)腸癌研究中發(fā)現(xiàn)MicroRNALet-7d通過CST1/P65通路調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，HOXC10在胃癌中通過轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控CST1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移。我們研究發(fā)現(xiàn)在肺癌細(xì)胞中敲低HOXC10，CST1在mRNA和蛋白水平均發(fā)生下調(diào)，隨后通過ChIP-PCR和ChIP-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，HOXC10可以和CST1上游啟動子序列結(jié)合，表明HOXC10與CST1基因直接結(jié)合，發(fā)揮直接調(diào)控作用。在HEK293T中通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，敲低HOXC10直接下調(diào)了CST1的啟動子活性。表明在肺癌細(xì)胞A549中HOXC10直接結(jié)合CST1上游啟動子序列，從而調(diào)控CST1基因的表達(dá)。接著為了探究HOXC10可通過CST1調(diào)控肺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特征，進(jìn)行回補實驗，在ShHOXC10的基礎(chǔ)上進(jìn)行CST1過表達(dá)，結(jié)果顯示過表達(dá)CST1可以逆轉(zhuǎn)由敲低HOXC10下調(diào)的干細(xì)胞標(biāo)志蛋白CD44、CD133、Nanog、SOX2、OCT4表達(dá)水平，且細(xì)胞腫瘤成球能力和增殖能力也顯著恢復(fù)。表明在肺癌細(xì)胞A549中 HOXC10通過CST1調(diào)控的干細(xì)胞樣特征。綜上所述，在肺癌細(xì)胞中，HOXC10異常高表達(dá)，通過調(diào)控CST1基因轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞干細(xì)胞樣特性。