周 穎， 高 天

(1.海南省東方市東方醫(yī)院， 海南 東方 572600 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 重慶 400016)

卵巢癌在我國(guó)發(fā)病率高，死亡率也高居女性惡性腫瘤榜首。據(jù)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，因卵巢結(jié)構(gòu)及癥狀隱匿等特點(diǎn)，多數(shù)卵巢癌患者發(fā)病時(shí)已進(jìn)展至中晚期，導(dǎo)致患者預(yù)后不良[1]。腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移是威脅卵巢癌患者術(shù)后生存質(zhì)量的首要問(wèn)題[2]。腫瘤在發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)腫瘤細(xì)胞會(huì)隨淋巴循環(huán)及血液循環(huán)游走至其他部位，產(chǎn)生新的腫瘤灶[3]。已有報(bào)道指出，在多種惡性腫瘤侵襲、遷移過(guò)程中有Nck的參與[4]。因此本次研究特對(duì)Nckα基因沉默時(shí)上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力及相關(guān)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析，為上皮性卵巢癌治療提供新的參考思路。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:選擇上皮性卵巢癌SKOV3細(xì)胞株、OVCAR-3細(xì)胞株以及正常卵巢上皮細(xì)胞IOSE-80細(xì)胞株，本次研究所用細(xì)胞均購(gòu)于南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2組織樣本:取正常、良性病變、卵巢癌組織切片，本次研究所使用切片均來(lái)自本院接受卵巢疾病治療患者組織樣本，正常卵巢組織切片為良性疾病切除附件。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:本次研究選用4～6周齡BALB/C雄性大鼠10只，所有動(dòng)物均進(jìn)行為期一周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，用于后期實(shí)體瘤實(shí)驗(yàn)。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑:枸櫞酸鹽(美國(guó)BD)，DAB顯色液(上海賽默飛世爾科技),中性樹(shù)膠(美國(guó)ATGene)，兔抗Nckα多克隆抗體(美國(guó)Sigma)，多聚甲醛(武漢博士德)，蛋白提取試劑盒(美國(guó)ATGene)，冰醋酸(上海碧云天)，結(jié)晶紫(江蘇凱基生物)等。

1.1.5實(shí)驗(yàn)儀器:移液槍(德國(guó)Eppendorf)，電泳儀、發(fā)光圖像分析儀(美國(guó)Bio-rad)，顯微鏡(日本蔡司)，孵育箱(海爾生物醫(yī)療)，離心機(jī)(貝克曼中國(guó)分公司)等。

1.2方 法

1.2.1免疫組化:取組織樣本進(jìn)行免疫組化反檢測(cè)，恒溫烤片，經(jīng)脫蠟水化處理，抗原修復(fù)滴加枸櫞酸，滴加阻斷劑，10min孵育，滴加山羊血清，15min，反應(yīng)結(jié)束后棄上清，滴加一抗，以PBS作為陰性對(duì)照，過(guò)夜孵育，PBS沖洗，滴加二抗，15min孵育，沖洗后滴加工作液，15min，沖洗后滴加顯色液，鏡下觀察染色情況，待細(xì)胞出現(xiàn)棕黃色著色后終止染色，加蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗終止，碳酸鋰返藍(lán)，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察染色情況。細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色染色為陽(yáng)性。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng):復(fù)蘇凍存細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，待貼壁后進(jìn)行傳代，棄原培養(yǎng)基，沖洗后常規(guī)消化，5% CO2，37℃環(huán)境內(nèi)孵育3min，觀察細(xì)胞消化情況，待完全消化后棄上清，加培養(yǎng)基重懸，1000r/min離心，5min后收集沉淀，再次加培養(yǎng)基重懸，繼續(xù)培養(yǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖情況進(jìn)行觀察，根據(jù)需求可對(duì)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞進(jìn)行凍存，滴加凍存液，置于-80℃環(huán)境內(nèi)存儲(chǔ)。

1.2.3細(xì)胞分組及干預(yù):空白組：SKOV3、OVCAR3正常培養(yǎng)。陰性對(duì)照組：SKOV3、OVCAR3均進(jìn)行對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染。Nckα基因沉默組：SKOV3、OVCAR3均進(jìn)行Nckα干擾病毒轉(zhuǎn)染。Nckα高表達(dá)組：SKOV3、OVCAR3均進(jìn)行Nckα過(guò)表達(dá)病毒轉(zhuǎn)染

1.2.4免疫熒光:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制細(xì)胞懸液，二氧化碳濃度5%，37℃培養(yǎng)，觀察細(xì)胞融合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行后續(xù)研究，棄培養(yǎng)基PBS沖洗，多聚甲醛固定，沖洗后滴加Triton，5min孵育，避光。棄殘液，沖洗后滴加山羊血清，1h避光，滴加一抗，孵育過(guò)夜，次日棄上清后PBS沖洗，滴加標(biāo)記過(guò)的二抗，1h避光，沖洗，滴加鬼筆環(huán)肽，1h孵育，封片，于鏡下對(duì)熒光反應(yīng)情況進(jìn)行觀察。

1.2.5Transwell細(xì)胞侵襲、遷移實(shí)驗(yàn):細(xì)胞侵襲：提前備好Matrigel基質(zhì)膠，配置上下室培養(yǎng)液，試驗(yàn)前需對(duì)食管癌細(xì)胞進(jìn)行12h饑餓培養(yǎng)，取24孔板，加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，將重懸后的待測(cè)細(xì)胞接種于Transwell小室中，每個(gè)小室選擇相同細(xì)胞數(shù)目，培養(yǎng)48h后觀察細(xì)胞侵襲情況，PBS沖洗小室，蘇木素染色，沖洗殘液后封片，鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行觀察，采用相關(guān)軟件計(jì)數(shù)，判斷細(xì)胞侵襲能力。細(xì)胞遷移：試驗(yàn)前細(xì)胞需饑餓培養(yǎng)24h，取24孔板，加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，注意避免氣泡，選取各組對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化，離心處理，滴加含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基進(jìn)行重懸，并將其接種于Transwell小室中，每個(gè)小室細(xì)胞數(shù)目相同，將各小室放入24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)24h，取出小室進(jìn)行PBS沖洗，多聚甲醛固定，再次沖洗，蘇木素染色，洗凈殘余染液，裁下聚碳酸酯膜，滴加中性樹(shù)膠封片，高倍鏡下觀察細(xì)胞情況，并通過(guò)相關(guān)軟件進(jìn)行數(shù)目統(tǒng)計(jì)。

1.2.6細(xì)胞增殖:采用CCK-8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，胰酶消化待測(cè)細(xì)胞，取96孔板設(shè)置5000個(gè)/孔，另設(shè)空白對(duì)照，滴加培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，貼壁后滴加CKK-8試劑，4h孵育，置入酶標(biāo)儀，對(duì)波長(zhǎng)450nm處吸光度值進(jìn)行讀取，剩余4個(gè)96孔板分別在培養(yǎng)24h、48h、72h以及96h時(shí)滴加CCK-8試劑，對(duì)450nm波長(zhǎng)處吸光度值進(jìn)行測(cè)量。

1.2.7構(gòu)建皮下移植瘤動(dòng)物模型:將待測(cè)細(xì)胞制成懸液，胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，取沉淀PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度，取雌性裸鼠，將細(xì)胞懸液與腹股溝處皮下對(duì)大鼠進(jìn)行注射，每只大鼠均一側(cè)注射陰性對(duì)照組細(xì)胞，一側(cè)注射Nckα沉默組細(xì)胞，完成注射后對(duì)裸鼠一般情況進(jìn)行觀察，并定期對(duì)皮下移植瘤直徑進(jìn)行測(cè)量。于接種4周后對(duì)所有裸鼠進(jìn)行處死，分離取出移植瘤，福爾馬林固定后制成石蠟切片用于后續(xù)研究。

1.2.8皮下移植瘤HE染色:取皮下移植瘤組織切片進(jìn)行HE染色，烤片，脫蠟水化處理，10min蘇木素染色，沖洗殘液，滴加鹽酸乙醇，碳酸鋰返藍(lán)，再次流水沖洗，伊紅復(fù)染，脫水處理，中性樹(shù)膠封片，鏡下觀察染色情況。

1.2.9Western blot檢測(cè):取皮下移植瘤組織進(jìn)行裂解，操作全程于冰上進(jìn)行，充分裂解后進(jìn)行12000r/mL高速離心處理，5min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度，蛋白濃度調(diào)節(jié)，按比例上樣，蛋白加熱至變性，進(jìn)行凝膠、電泳處理。配置濃縮膠，進(jìn)行電泳、電轉(zhuǎn)處理，取出PVDF膜，采用TBST沖洗，滴加封閉液，滴加一抗4℃過(guò)夜孵育，次日滴加二抗，室溫孵育1h，采用ECL法進(jìn)行顯影。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化法分析卵巢組織Nckα表達(dá)情況:Nckα主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，在正常卵巢組織、良性病變卵巢組織、卵巢癌組織中均存在Nckα表達(dá)，卵巢癌組織中Nckα陽(yáng)性細(xì)胞更多，具體見(jiàn)圖1。

圖1 不同卵巢組織免疫組化染色

2.2Nckα基因沉默對(duì)卵巢癌SK0V3細(xì)胞偽足形成的影響:Nckα基因沉默(SKOV3-shRNA3)時(shí)SKOV3細(xì)胞形態(tài)變鈍、變圓，絲狀偽足和片狀偽足數(shù)量明顯降低，具體見(jiàn)圖2。

圖2 卵巢癌SK0V3細(xì)胞偽足的免疫熒光染色

2.3Nckα基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響:通過(guò)Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)得出，Nckα沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞穿過(guò)包被Matrigel膠細(xì)胞數(shù)量減少，Nckα過(guò)表達(dá)卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞穿過(guò)包被Matrigel膠細(xì)胞侵襲數(shù)量增多，見(jiàn)圖3。通過(guò)Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn)得出，Nckα沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜細(xì)胞數(shù)量減少，Nckα過(guò)表達(dá)卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞穿過(guò)聚碳酸酯膜細(xì)胞侵襲數(shù)量增多，見(jiàn)圖4。

圖3 卵巢癌細(xì)胞侵襲能力

圖4 卵巢癌細(xì)胞遷移能力

2.4Nckα基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響:通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)得出，在培養(yǎng)48h后三組細(xì)胞吸光度差異明顯，Nckα沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞吸光度值明顯低于對(duì)照組，Nckα過(guò)表達(dá)卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞吸光度值明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 Nckα基因沉默對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖能力的影響

2.5Nckα基因沉默作用機(jī)制分析:Nckα沉默卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞PI3K p110α、p70S6K、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組，Nckα過(guò)表達(dá)卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞PI3K p110α、p70S6K、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 卵巢癌SKOV3及OVCAR3細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)水平與NC組相比，*P<0.05

3 討 論

卵巢癌屬于高發(fā)女性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康，在我國(guó)卵巢癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)。目前臨床對(duì)于卵巢癌的治療主要是手術(shù)治療并輔以化療，但是仍有一部分患者會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，甚至?xí)驗(yàn)榛熌退幎劳鯷5]。因此急需尋找更加敏感有效的卵巢癌治療靶點(diǎn)。目前現(xiàn)有的卵巢癌治療靶點(diǎn)穩(wěn)定性差，具有較高的突變頻率，導(dǎo)致治療效果降低，因此在卵巢癌治療中亟待尋找更加穩(wěn)定、有效的治療靶點(diǎn)[6]。腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素就包含癌細(xì)胞與癌細(xì)胞之間粘附性降低，導(dǎo)致癌細(xì)胞脫離原發(fā)病灶，隨淋巴或血液游走至其它器官或組織，形成轉(zhuǎn)移腫瘤[5]。癌細(xì)胞定向遷移運(yùn)動(dòng)的能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要因素。曾有學(xué)者指出，肌動(dòng)蛋白的聚合所可謂腫瘤細(xì)胞偽足向某一方向延伸提供動(dòng)力[7]。Nck作為一種在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛表達(dá)的銜接蛋白，可以激活下游多種磷酸化蛋白，可參與絡(luò)氨酸激酶信號(hào)傳代，屬于重要的結(jié)合蛋白，參與局部肌動(dòng)蛋白的聚合，與腫瘤細(xì)胞偽足形成之間存在密切聯(lián)系[8]。本次研究對(duì)正常卵巢組織、良性病變卵巢組織以及卵巢癌組織Nckα表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，Nckα在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，提示Nckα可能參與上皮性卵巢癌病變。因此本次研究選擇Hckα基因作為研究重點(diǎn)，分析其對(duì)相關(guān)腫瘤標(biāo)志物水平的影響，探究其對(duì)于腫瘤增殖、遷移的作用機(jī)制。

本次研究在對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行免疫組化分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，Nckα基因沉默后卵巢癌細(xì)胞偽足數(shù)目降低，且細(xì)胞形態(tài)變鈍、變圓，提示Nckα基因沉默可通過(guò)干預(yù)卵巢癌細(xì)胞偽足形成的方式調(diào)控癌細(xì)胞遷移能力。癌細(xì)胞獲得運(yùn)動(dòng)能力主要是依靠癌細(xì)胞偽足向某一方向延伸的動(dòng)力，從而脫離原發(fā)病灶形成轉(zhuǎn)移瘤[9]。為進(jìn)一步了解Nckα基因沉默對(duì)于上皮性卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響，特展開(kāi)Transwell小室實(shí)驗(yàn)。研究結(jié)果顯示Nckα基因沉默可對(duì)上皮細(xì)胞卵巢癌侵襲、遷移產(chǎn)生抑制作用。惡性腫瘤侵襲、遷移的前提是細(xì)胞獲得無(wú)限增殖能力[10]。本次研究通過(guò)CKK-8實(shí)驗(yàn)對(duì)Nckα基因沉默狀態(tài)下上皮性卵巢癌增殖情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示Nckα基因沉默可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞體外增殖能力。

為進(jìn)一步分析Nckα基因在腫瘤增殖、侵襲中的作用機(jī)制，本次研究采用多因子固相抗體芯片技術(shù)對(duì)45中磷酸化激酶變化情況進(jìn)行檢測(cè)，共獲得11種差異蛋白，其中AKT、p70S6K變化最為明顯。有研究指出，AKT、P70S6K是構(gòu)成PI3K/AKT通路的重要組成部分，而該通路可參與多種惡性腫瘤的發(fā)生[11]。在癌癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中IA類PI3K均有參與，其中p85可對(duì)p100α產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)PI3K參與惡性腫瘤過(guò)程時(shí)，p110α發(fā)揮重要作用[12]。mTOR屬于AKT信號(hào)下游受體，曾有學(xué)者在研究中指出，多種疾病發(fā)生過(guò)程中有TOR/S6K通路的參與，如糖尿病、癌癥等[13]。結(jié)合以往研究結(jié)論，本次研究對(duì)PI3K p110α、p70S6K、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示當(dāng)存在Nckα基因沉默時(shí)，上皮細(xì)胞卵巢癌SKOV3細(xì)胞、OVCAR3細(xì)胞PI3K p110α、p70S6K、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)明顯降低，而在Nckα過(guò)表達(dá)時(shí)各類蛋白均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，提示Nckα基因沉默可能是通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K p110α、p70S6K、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)的方式調(diào)控上皮性卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲。

有報(bào)道指出，Nckα過(guò)表達(dá)可逆轉(zhuǎn)由馬兜鈴酸導(dǎo)致的腎小管周圍毛細(xì)血管減少，認(rèn)為Nckα可能參與新生血管生成。為進(jìn)一步證實(shí)Nckα基因?qū)τ谀[瘤增殖、遷移的影響，本次特開(kāi)展動(dòng)物研究，通過(guò)制作皮下移植瘤動(dòng)物模型，對(duì)動(dòng)物模型皮下腫瘤生長(zhǎng)情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，移植Nckα基因沉默卵巢癌細(xì)胞的裸鼠皮下瘤體生長(zhǎng)速度明顯低于Nckα表達(dá)正常組，提示Nckα基因沉默可抑制實(shí)體瘤生長(zhǎng)，可能是通過(guò)干預(yù)新生血管形成方式進(jìn)行調(diào)節(jié)。

綜上所述，Nckα基因沉默可導(dǎo)致上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移能力降低，延緩皮下移植瘤生長(zhǎng)速度，可能與Nckα基因沉默調(diào)控PI3K p110α、p70S6K、AKT、P-AKT蛋白表達(dá)有關(guān)。