尹朝奇，陶如意，王少華，陳佳，唐封杰，劉燦，劉岱松，陳舒悅，周建大，陳豐原

（中南大學湘雅三醫(yī)院燒傷整形科，湖南長沙 410013）

膿毒癥相關(guān)肝損傷（sepsis related liver injury，SRLI） 的治療仍是醫(yī)學界重大難題，深入研究SRLI 的發(fā)病機制尤其是探明早期發(fā)病機制以及尋找新的治療方法對SRLI 具有重要意義。在膿毒癥病理條件下， 肝竇內(nèi)皮細胞（liver sinusoidal endothelial cells，LSECs）總是暴露于循環(huán)的病原體和細菌內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS），血管內(nèi)皮細胞作為血液與全身組織細胞信息交換的界面，最先受到代謝物質(zhì)及其引發(fā)的系統(tǒng)性炎癥損害，從而導致內(nèi)皮功能障礙[1-3]。

前期研究[4]發(fā)現(xiàn)RNA 特異性腺苷脫氨酶1（ADAR1）作為一種全新的血管調(diào)節(jié)分子在血管生長、發(fā)育以及血管再生中具有重要作用。腺苷脫氨酶是與雙鏈RNA（dsRNA）結(jié)合并通過脫氨將腺苷（A） 轉(zhuǎn)化為肌苷（I） 的酶。研究[5-6]還發(fā)現(xiàn)，體外血管內(nèi)皮細胞中下調(diào)ADAR1 可致質(zhì)膜微囊蛋白Caveolin 1（Cav-1）明顯下調(diào)，Cav-1 是一種特化的細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，在血管內(nèi)皮細胞存在豐富，其在內(nèi)吞、膜轉(zhuǎn)運以及信號轉(zhuǎn)導等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。那么ADAR1 及Cav-1 是否參與了SRLI 目前未見文獻報道。

考慮到LSECs 在肝損傷中起著至關(guān)重要的作用，本研究觀察了ADAR1 缺乏在LPS 誘導的肝損傷中對LSECs 的作用，并探討ADAR1 在LPS 誘導的肝損傷中的作用及相關(guān)機制，以期為臨床早期防治SRLI 開拓新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

ADARl 內(nèi)皮特異性敲除小鼠（ADAR1ECKO小鼠） 由本實驗室自行培育，ADAR1flox/flox野生型小鼠、 高表達ADARl 基因腺病毒（adenoviruses expressing ADARl gene，Ad-ADARl） 由美國匹茲堡大學Qing Dewang 副教授友情提供。所有基因工程小鼠經(jīng)過嚴格標準化PCR 鑒定，按文獻[7]方法體外培養(yǎng)的原代LSECs。其他實驗材料與儀器包括：Anti-ADAR1 Antibody （Abcam，英國）、RIPA 裂解液（Servicebio，中國）、50×Cooktail （Servicebio，中國）、PMSF（Servicebio，中國）、磷酸化蛋白酶抑制劑（Servicebio， 中國）、 顯影定影試劑（Servicebio，中國）、BCA 蛋白定量檢測試劑盒（Servicebio，中國）、TRIzol （Life Technologies，美國）、M-MLV（promega，美國）、dNTPs（Promega，美國）、oligo dT（生工，中國上海）、Bulge-LoopTM miRNA （銳博， 中國廣州）、 Rnase Inhibitor（Promega，美國）、SYBR Master Mixture （Takara，日本）、胎牛血清（Ausbian，澳大利亞）、DMEM（Corning，美國）、胰酶（上海化學試劑有限公司，中國上海）、酶標檢測儀（Rayto，美國）、冷凍離心機（Heal Force，中國）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司，中國北京）、Nanodrop 分光光度計（Thermo，德國）、Real time PCR 儀（Agilent，美國）、 96 孔板（Cornning， 美國）、 掃描儀（EPSON，日本）。

1.2 實驗方法

1.2.1 總體設計 取ADAR1ECKO小鼠和ADAR1flox/flox野生型小鼠各20 只，腹腔注射20 mg/kg LPS 建立膿毒癥小鼠模型，在LPS 處理6 h 后，每組各處死10 只小鼠后采集肝臟組織，并分離LSECs，用于組織形態(tài)學與免疫熒光檢測，每組剩余10 只用于生存率觀察。取正常野生型小鼠的LSECs 轉(zhuǎn)染ADARl siRNA，以轉(zhuǎn)染siRNA 陰性序列及無轉(zhuǎn)染的LSECs為對照，觀察LSECs 增殖能力及Cav-1 下游蛋白VE-cadherin 與β-Catenin 表達的變化。

1.2.2 組織病理 將福爾馬林固定的肝臟標本進行石蠟包埋，采用HE 染色進行評價。所有的照片均用Olympus Provis 顯微鏡拍攝。

1.2.3 LSECs 分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法 取新鮮離體小鼠肝組織，分離培養(yǎng)并鑒定細胞為血管內(nèi)皮細胞，將細胞放置在37 ℃，5% CO2的環(huán)境下EGM-2 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2～3 代，接種至6 孔板[7]。取生長良好的3～8 代用于實驗，培養(yǎng)細胞時隔天用新鮮培養(yǎng)基換液，并待細胞生長到80%密度時可傳代繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染ADARl siRNA 24 h 前，在2 mL 無抗生素EGM-2 培養(yǎng)基中接種106個細胞，轉(zhuǎn)染時細胞融合度為80%。轉(zhuǎn)染時，將50 nmol/L ADARl siRNA、對照siRNA 和6 μL LipofectamineTM 2000 混合加入到200 μL opti-MEM 培養(yǎng)基中，室溫下靜置30 min。細胞板opti-MEM 漂洗2 遍后，轉(zhuǎn)染復合物加入到細胞板，前后搖晃混勻。轉(zhuǎn)染48 h 后即進行實驗。ADARl siRNA 序列：5′-CAU CAA AUG CCU CAA AUA A-3′（Dhamacon）。

1.2.4 Western blot 檢測小鼠LSECs 的ADAR1 及相關(guān)蛋白表達水平 提取細胞總蛋白溶液，加入蛋白質(zhì)上樣緩沖液（2∶1）后沸水浴10 min，以10 μL 每孔進行上樣電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育30 min 后，TBST 漂洗3 次。避光，顯色，凝膠成像儀中拍照。掃描存檔，PhotoShop 整理去色，Alpha 軟件處理系統(tǒng)分析目標帶的光密度值。

1.2.5 細胞免疫熒光 首先將轉(zhuǎn)染ADARl 的肝內(nèi)皮細胞種植在玻璃片上，然后用4% PFA 室溫下固定30 min，PBS 漂洗2 次后，0.1% TX-100 室溫下作用1～2 min 使細胞膜通透。然后將玻璃片置于濕盒中，用5%BSA/TBS 封閉30 min，PBS 漂洗3 遍。接著將一抗稀釋在1% BSA/TBS（稀釋倍數(shù)依具體抗體而定），每個玻璃片加50 μL 抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜。過夜后PBS 漂洗3 遍，將二抗稀釋在1%BSA/TBS 中，每個玻璃片加50 μL 二抗稀釋液，常溫下30 min，最后滴加DAPI 染核5 min，加上封片膠后用載玻片封片在激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.6 內(nèi)皮細胞小管形成檢測 先將Matrigel 放入40 ℃冰箱過夜待其融化。96 孔板和槍頭提前置于-20 ℃冰箱預冷。第2 天取50 μL Matrigel 加入冷凍的96 孔板中，靜止后放入37 ℃孵育待其凝固。分別取消化的siR-對照組、空白對照組、siADAR1 組肝內(nèi)皮細胞后計數(shù)，將2.5×104細胞接種于Matrigel上，利用EGM-2 培養(yǎng)，置于37 ℃孵箱孵育6 h。最后在顯微鏡下照相，計算小管的數(shù)目。小管計數(shù)時以長是寬的4 倍及以上作為小管的標準。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行處理。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組之間的比較采用非配對t檢驗。大于兩組之間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用Neuman-Keuls 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 LPS處理后兩組小鼠的成活情況

將ADAR1flox/flox和ADAR1ECKO小鼠用20 mg/kg LPS 腹腔注射， 生存監(jiān)測結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 10 只ADAR1ECKO小鼠在40 h 后全部死亡，而ADAR1flox/flox小鼠在3 d 內(nèi)仍有7 只存活。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示， ADAR1ECKO小鼠死亡時間早于ADAR1flox/flox小鼠（P<0.05），存活率明顯低于ADAR1flox/flox小鼠（P<0.05）。

2.2 LPS處理后兩組小鼠肝臟組織形態(tài)學變化

ADAR1flox/flox組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)和肝細胞間隙均未見明顯異常，肝索走向正常；ADAR1ECKO組小鼠肝細胞胞質(zhì)內(nèi)可見圓形空泡，炎細胞浸潤，肝索紊亂，大部分細胞壞死。因此，ADAR1ECKO小鼠的肝損傷比ADAR1flox/flox小鼠更嚴重（圖1）。

2.3 LPS 處理后兩組小鼠內(nèi)皮細胞Cav-1 和VEcadherin的表達

LPS 處理后的ADAR1ECKO小鼠LSECs 中Cav-1 和VE-cadherin 的表達明顯低于對照組ADAR1flox/flox小鼠，說明內(nèi)皮細胞缺失ADARl 可抑制肝臟血管內(nèi)皮細胞相關(guān)蛋白 Cav-1 和 VE-cadherin 的表達（圖2）。

2.4 沉默ADAR1后LSECs的增殖能力

與空白對照組比較，siR-ADAR1 組鏡下細胞成血管網(wǎng)稀疏，內(nèi)皮細胞增殖、小管形成功能抑制；對照siRNA 組與空白對照組間無明顯差異（圖3）。

2.5 Western blot 檢測LSECs轉(zhuǎn)染siRNA后Cav-1下游蛋白的表達

與空白對照組比較，LSECs 轉(zhuǎn)染ADARl siRNA后，ADARl 與VE-Cadherin 表達下調(diào)，但β-Catenin的表達無明顯變化；對照siRNA 組與空白對照組間各蛋白表達水平無明顯差異（圖4）。

3 討 論

SRLI 發(fā)生率高，往往發(fā)展為多器官功能障礙，導致病死率顯著增加，是急危重癥領(lǐng)域內(nèi)的救治難題[8-10]，因此，深入研究SRLI 的發(fā)病機制尤其是探明早期發(fā)病機制以及尋找新的治療方法對SRLI具有重要意義[11-12]。

SRLI 的發(fā)病機制是肝內(nèi)皮細胞在受到有害刺激時（如膿毒癥及其引發(fā)的炎癥和代謝紊亂等因素），產(chǎn)生內(nèi)皮細胞應激反應，炎癥細胞因子激活嗜中性粒細胞釋放損傷相關(guān)分子模式和炎癥介質(zhì)，活化的補體系統(tǒng)最終形成膜攻擊成分并損傷內(nèi)皮細胞[13-16]。因此，內(nèi)皮細胞應激是導致SRLI 早期的關(guān)鍵步驟，尋找SRLI 血管內(nèi)皮應激過程中起關(guān)鍵作用的生物分子，闡明其作用機制，從內(nèi)皮細胞應激的啟動、調(diào)控、干預等環(huán)節(jié)建立早期預警體系，將最終為SRLI 早期防控提供方向[17-20]。

前期研究[15]發(fā)現(xiàn)ADAR1 作為一種全新的血管調(diào)節(jié)分子在血管生長、發(fā)育以及血管再生中具有重要作用。腺苷脫氨酶是與dsRNA 結(jié)合并通過脫氨將腺苷（A） 轉(zhuǎn)化為肌苷（I） 的酶[21]。ADAR1是ADAR 家族中定義最明確的成員，它有兩個亞型：P110 和P150[5]。ADAR1 于1994年從牛肝臟中被鑒別和分離出來，由于其在體內(nèi)的廣泛的編譯作用，近年研究發(fā)現(xiàn)其在多個功能領(lǐng)域具有重要作用，越來越受到重視，最新的研究主要包括炎癥損傷與免疫調(diào)控[4,22-23]，ADAR1 可被多種炎癥刺激激活， 并已被證實參與局部和全身炎癥反應[24-25]。

為了觀察ADAR1 表達對膿毒癥小鼠肝損傷的影響，本研究將ADAR1flox/flox和ADAR1ECKO小鼠用20 mg/kg LPS 腹腔注射，生存監(jiān)測結(jié)果顯示，ADAR1ECKO小鼠死亡早于ADAR1flox/flox小鼠，存活率顯著低于ADAR1flox/flox小鼠。 對LPS 刺激的ADAR1flox/flox和ADAR1ECKO小鼠中肝組織學分析顯示，ADAR1ECKO小鼠的肝損傷比ADAR1flox/flox小鼠更嚴重。提示ADAR1 在SRLI 的發(fā)病機制起了重要作用。細胞免疫熒光技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)：通過檢測發(fā)現(xiàn)LPS 處理后的ADAR1ECKO小鼠Cav-1 和VE-cadherin 的表達顯著低于對照組ADAR1flox/flox小鼠，提示ADARl與Cav-1/VE-Cadherin 通路密切關(guān)聯(lián)。

研究[20,26-28]發(fā)現(xiàn)，Cav-1 是細胞表面的小窩樣內(nèi)陷結(jié)構(gòu)（Caveolae）的標志性蛋白，是一種特化的細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，在血管內(nèi)皮細胞存在豐富，其作為小窩主要的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)成分，在生理情況下，能夠與細胞膜及小窩上的eNOS 穩(wěn)定結(jié)合，抑制其活性從而實現(xiàn)其對下游蛋白分子活性的負向調(diào)控。本研究利用ADAR1 敲除策略，初步檢測了ADAR1在體外培養(yǎng)的原代LSECs 中的作用。結(jié)果顯示，與對照組比較，si-ADAR1 組鏡下細胞成血管網(wǎng)稀疏，內(nèi)皮細胞增殖、小管形成功能抑制；Cav-1 下游蛋白VE-Cadherin 表達下調(diào)，但β-Catenin 的表達無明顯變化。提示ADARl 在SRLI 中的作用可能與其調(diào)控Cav-1/VE-Cadherin 通路的活性有關(guān)。

綜上所述，根據(jù)前期研究積累及實驗結(jié)果，結(jié)合SRLI 發(fā)病機制研究的最新進展，筆者提出以下假說：膿毒癥導致的內(nèi)皮細胞應激是其繼發(fā)SRLI 的早期關(guān)鍵機制，膿毒癥狀態(tài)下，肝內(nèi)皮細胞受缺氧刺激致ADAR 下降，繼而通過Cav-1/VECadherin 途徑造成LSECs 屏障損傷，繼而可能導致一系列反應，如組織因子增加，激活外源性凝血途徑促使血小板活化聚集等，進一步加快了肝損傷的進展。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。