趙 凡，夏瑞祥（通信作者）

（安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液科 安徽 合肥 230022）

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞在骨髓中積累，導(dǎo)致骨破壞和骨髓衰竭的惡性腫瘤。治療上對于全身體能狀態(tài)良好的患者首選誘導(dǎo)治療后行自體造血干細(xì)胞移植（ASCT），對于不適合ASCT 的患者選擇誘導(dǎo)治療至最大緩解程度后維持治療。近些年，第3 代免疫調(diào)節(jié)劑泊馬度胺、第2 代蛋白酶體抑制劑卡非佐米、CD38 單抗等藥物的出現(xiàn)顯著提高了MM 患者的療效，但在整個(gè)治療過程中，患者反復(fù)復(fù)發(fā)，將不可避免地面臨藥物的耐藥，因此個(gè)體化選擇給藥方案，選擇合適的藥物組合，降低治療成本至關(guān)重要。ATP-TCA 是一種檢測腫瘤細(xì)胞體外藥物敏感性的一種方法，在新藥開發(fā)、耐藥機(jī)制研究及臨床決策中均有良好應(yīng)用。目前已證實(shí)該項(xiàng)技術(shù)在多種實(shí)體腫瘤中的應(yīng)用價(jià)值，在血液系統(tǒng)疾病的新藥開發(fā)及指導(dǎo)臨床用藥中也有廣泛使用，但是目前為止該項(xiàng)技術(shù)在MM 中鮮有報(bào)道，因此我們收集了多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤體外藥敏結(jié)果及其他臨床數(shù)據(jù)來論證ATPTCA 對指導(dǎo)MM 臨床治療的適用性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

收集2020 年6 月—2021 年3 月就診于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院的63 例多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓標(biāo)本，納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合2016 年國際骨髓瘤工作組（IMWG）多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)骨髓細(xì)胞學(xué)、免疫固定電泳、免疫球蛋白、影像學(xué)等檢查明確診斷為活動(dòng)性多發(fā)性骨髓瘤；②預(yù)計(jì)生存時(shí)間≥3 個(gè)月；③簽署知情同意書，同意行骨髓采樣送檢。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并有其他的危重癥疾病以及預(yù)計(jì)生存時(shí)間不滿3 個(gè)月；②一般情況差不能耐受骨髓穿刺檢查；③非初診初治患者既往接受過除化療以外的其他類型的治療（自體造血干細(xì)胞移植、免疫治療等）。63 例患者包括男性36 例，女性27 例，平均年齡66 歲（45 ～89 歲）。免疫球蛋白類型：IGA 12 例，IGD 2 例，IGG 39 例，IGM 1 例，κ 輕鏈2 例，λ 輕鏈7 例。

1.2 方法

1.2.1 材料來源 所有的ATP-TCA 標(biāo)本均采集患者骨髓血，樣本采集后于48 h 內(nèi)低溫4 ℃送檢，標(biāo)本送至安徽省精準(zhǔn)用藥技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。生物培養(yǎng)基及細(xì)胞提取液、藥敏試劑盒均購買自中科普瑞昇生物有限公司，化療藥物購買自MedChemExpress（MCE）。

1.2.2 ATP 檢測方法 細(xì)胞分離：將采集的骨髓標(biāo)本混勻離心后將血細(xì)胞沉淀注入淋巴細(xì)胞分離液中，吸取淋巴細(xì)胞層，加入紅細(xì)胞裂解液后加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，備用。細(xì)胞質(zhì)檢：取少量樣本加入臺盼藍(lán)混合后加入計(jì)數(shù)板，電腦軟件計(jì)數(shù)大細(xì)胞和存活細(xì)胞比例，采用流式細(xì)胞術(shù)通過檢測CD38（+）、CD138（+）、CD19（-）、CD56（+）抗原確定惡性漿細(xì)胞比例。細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞加入培養(yǎng)基中后分別接種于高通量培養(yǎng)板中（雙孔復(fù)測），不加藥物的細(xì)胞作為空白對照，置37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h 后檢測生長情況。ATP 檢測：加入CTG 化學(xué)發(fā)光細(xì)胞活性檢測試劑盒后放入儀器測量發(fā)光值。

1.2.3 ATP-TCA 結(jié)果判定

以100%峰值血漿濃度（PPC）為篩選濃度，評估藥物對自體癌細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，抑制率越高，細(xì)胞毒作用越強(qiáng)；抑制率（%）=（1-藥物篩選組腫瘤細(xì)胞存活數(shù)目/空白對照組腫瘤細(xì)胞存活數(shù)目）×100%。為方便統(tǒng)計(jì)將抑制率≥50%定義為藥物敏感，抑制率＜50%定義為不敏感。

1.3 臨床結(jié)果的評估和定義

參考2016 年IMWG 更新的傳統(tǒng)療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將療效分為完全緩解（CR）；非常好的部分緩解（VGPR）；部分緩解（PR）；疾病穩(wěn)定（SD）；疾病進(jìn)展（PD）；嚴(yán)格意義的完全緩解（sCR）定義為滿足CR 標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，加上血清游離輕鏈比值正常以及經(jīng)免疫組化證實(shí)骨髓中無克隆性漿細(xì)胞，可以用敏感性達(dá)到10的多色流式細(xì)胞術(shù)檢測骨髓標(biāo)本無克隆漿細(xì)胞代替。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行分析。不同藥物種類組合間差異采用單因素協(xié)方差分析；體外敏感度的影響因素中分類變量采用χ檢驗(yàn)，連續(xù)變量采用Person 相關(guān)性分析；藥敏結(jié)果與臨床數(shù)據(jù)及臨床療效的相關(guān)性采用有序logistics 回歸?！?.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 藥物體外敏感度的組間差異分析

體外藥物及藥物組合共7 組。各組抑制率以均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示：硼替佐米+來那度胺+地塞米松組（72.30%±22.38%）＞硼替佐米+環(huán)磷酰胺+地塞米松組（70.64%±23.61%）＞硼替佐米組（58.05%±28.95%）＞美法侖+潑尼松+沙利度胺組（16.15%±16.16%）＞來那度胺+地塞米松組（16.14%±13.73%）＞環(huán)磷酰胺組（11.76%±11.56%）＞來那度胺組（8.93±10.71%）。各組間差異顯著，（WelchF = 152.171，＜0.001），見圖1。

圖1 藥敏結(jié)果的組間差異

2.2 藥敏結(jié)果和療程對緩解程度的影響

研究過程中共36 例患者接受了不少于2 個(gè)療程的化療并進(jìn)行了療效評估，根據(jù)患者所采用的臨床方案對應(yīng)的ATP-TCA 數(shù)據(jù)，將敏感度≥50%分為敏感組，敏感度＜50%分為不敏感組，敏感組29 例，不敏感組7 例，運(yùn)用有序logistics 回歸分析腫瘤藥物體外敏感性及療程對于緩解程度的影響。敏感組的緩解程度明顯高于不敏感組，OR 值是不敏感組的8.89 倍（95%：3.38 ～4.04，χ= 19.61，＜0.001）；隨著療程數(shù)的增多，緩解程度有所升高，8 個(gè)療程后療效的OR 值是2 個(gè)療程的6.43 倍，（95%：2.14 ～19.33，χ= 11.00，= 0.001），見圖2。敏感組sCR 的獲得高于不敏感組，（= 0.028）。

圖2 藥敏結(jié)果對緩解程度的影響

2.3 體外敏感度與臨床特征的相關(guān)性

根據(jù)ATP-TCA 中蛋白酶體敏感性的結(jié)果，將患者分為敏感組和不敏感組，在骨髓FISH 檢測中，29 名患者檢出高危染色體異位，含一項(xiàng)高危因素的有21 例，兩項(xiàng)高危因素的有7 例，三項(xiàng)高危因素的有1 例，兩組間無顯著差異（= 0.761）；兩組間免疫表型（CD19, CD20,CD56, CD3, CD4, CD7, CD13, CD33, CD117），高乳酸脫氫酶（LDH），腎功能不全，高鈣血癥，低蛋白血癥均無顯著差異，（＞0.05），見表1。

表1 組間臨床特征差異

2.4 體外敏感度對生存的影響

最終47 例患者接受了不少于3 個(gè)月的隨訪，根據(jù)患者所采用的臨床方案的敏感性分為敏感組和不敏感組，其中敏感組35 例，不敏感組12 例，中位隨訪16 個(gè)月后敏感組總生存期（OS）28.5 個(gè)月（95%：26.64 ～30.49） 高 于 不 敏 感 組17.8 個(gè) 月（95%：13.5 ～22.1），差異顯著（χ= 7.38，= 0.007）；敏感組無進(jìn)展生存期（PFS）27.55 個(gè)月（95%：24.48 ～30.61）高于不敏感組16.76 個(gè)月（95%：12.47 ～21.04），差異顯著（χ= 9.315，= 0.002），見圖3。

圖3 組間生存差異

3.討論

腫瘤是目前臨床上常見的致死性疾病之一，因?yàn)槠溥z傳學(xué)上的特征，極易在體內(nèi)生長擴(kuò)散且極難根治。雖然大量新藥以及免疫療法的出現(xiàn)顯著改善了患者預(yù)后，但化療作為貫穿全程的一部分，最終都將面臨腫瘤耐藥以及嚴(yán)重不良反應(yīng)的威脅，因此通過“精準(zhǔn)用藥”，找到最合適的治療方法至關(guān)重要。在傳統(tǒng)的腫瘤藥物敏感性檢測實(shí)驗(yàn)中，因骨髓瘤細(xì)胞的不均質(zhì)性，不同個(gè)體的骨髓瘤細(xì)胞比例差異大，直接進(jìn)行藥敏檢測難以區(qū)分正常細(xì)胞和癌細(xì)胞，因此我們采用流式細(xì)胞術(shù)，通過檢測骨髓瘤細(xì)胞特異性抗原對細(xì)胞進(jìn)行分類，確保了骨髓瘤細(xì)胞的比例在50%以上，并且采用有選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，從而減少了非惡性漿細(xì)胞所引起的誤差。

在納入的7 種臨床常用的單藥及聯(lián)合組別中，含PIs的方案敏感度更高，這與目前臨床上的數(shù)據(jù)相符。MPT方案表現(xiàn)為體外耐藥，這與其抗腫瘤機(jī)制有關(guān)，烷化劑類藥物主要通過烷化作用形成DNA 鏈間或鏈內(nèi)的交聯(lián)或DNA 與蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)，屬于細(xì)胞周期特異性藥物，而藥敏檢驗(yàn)周期短，在這個(gè)過程中癌細(xì)胞只需保持存活，不需要分裂。

在臨床療效方面，敏感組的患者無論是緩解的深度還是生存的時(shí)間都有明顯獲益。但值得一提的是，有兩例敏感組的患者出現(xiàn)了短期內(nèi)再次復(fù)發(fā)。在歐洲的一項(xiàng)關(guān)于早期復(fù)發(fā)的模型預(yù)測中，對2 190 例患者依據(jù)高LDH、FISH 高危因素、低蛋白血癥、骨髓漿細(xì)胞數(shù)和血游離輕鏈，進(jìn)行了多發(fā)性骨髓瘤簡化早期復(fù)發(fā)（S-ERMM）的評分，結(jié)果提示S-ERMM 評分高者易復(fù)發(fā)，這兩例早期復(fù)發(fā)的患者均為高危型復(fù)發(fā)型患者，因此臨床上對于高風(fēng)險(xiǎn)的患者，我們?nèi)孕枰鹬匾?。除此之外，MM 的腫瘤微環(huán)境（TME）復(fù)雜多變，各種免疫細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子等參與腫瘤的發(fā)生與耐藥，一些針對靶向微環(huán)境的藥物依賴于髓內(nèi)微環(huán)境發(fā)揮作用，體外培養(yǎng)的過程難以復(fù)刻髓內(nèi)環(huán)境，因此ATP-TCA 僅作為臨床用藥的參考而不能替代實(shí)際的療效。通過這項(xiàng)研究我們發(fā)現(xiàn)了ATP-TCA 檢測與臨床療效有相關(guān)性，可以作為臨床藥物選擇的參考依據(jù)。