孫玲玉，顏家保，胡 杰，鮑彥舟

（武漢科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 煤轉(zhuǎn)化與新型炭材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430081）

氮含量超標(biāo)將導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，并影響人體健康。傳統(tǒng)生物脫氮是利用微生物的硝化反硝化原理，將廢水中的NH首先在好氧條件下通過亞硝酸菌的作用氧化為NO，之后通過硝酸菌進(jìn)一步氧化為NO，硝態(tài)氮在厭氧環(huán)境條件下通過反硝化菌還原為N。傳統(tǒng)生物脫氮理論認(rèn)為，生物脫氮要經(jīng)歷硝化（好氧）和反硝化（厭氧或缺氧）兩個(gè)階段，這兩個(gè)階段分別在不同的反應(yīng)器中完成。基于此，開發(fā)了缺氧—好氧（A/O）、厭氧—缺氧—好氧（A-A/O）、缺氧—好氧—好氧（A/O-O）等工藝。

自ROBERTSON等首次從廢水脫硫和反硝化系統(tǒng)中分離出具有好氧反硝化能力的異養(yǎng)硝化菌泛營(yíng)養(yǎng)硫球菌（Thiosphaera pantotroph）以來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，自然界中還存在許多異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌。這些新菌種為異養(yǎng)菌，同時(shí)具備好氧硝化及反硝化功能。利用異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌可以在好氧環(huán)境中以有機(jī)物為碳源，脫除廢水中的氨態(tài)氮和硝態(tài)氮并同時(shí)去除廢水中的有機(jī)污染物。在同一反應(yīng)器中同時(shí)脫除碳氮，大大節(jié)省了基建投資和運(yùn)行成本。然而，目前分離得到的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌主要來自淡水和鹽含量較低的環(huán)境，對(duì)于石油化工、生物醫(yī)藥、食品加工等行業(yè)排放的部分高含鹽污水，生物脫氮效率低，難以達(dá)到排放要求。

本研究從醫(yī)藥廢水生物處理活性污泥中分離得到1株耐鹽異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌Y1，并對(duì)其進(jìn)行了種屬鑒定和脫氮特性研究，為高含鹽污水的生物脫氮提供了理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料和儀器

菌源取自湖北咸寧惠生醫(yī)藥廢水生物處理系統(tǒng)好氧段活性污泥。

LB培養(yǎng)基（g/L）：NaCl 10.0，蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，pH 7.2。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基（g/L）：NaHPO·12HO 7.900，KHPO1.500，MgSO·7HO 0.100，（NH）SO0.943，CHNaO·6HO 18.000，F(xiàn)eSO·7HO 0.010，NaCl 50.000，微量元素2 mL，pH 7.4。該培養(yǎng)基理論NH-N質(zhì)量濃度為200 mg/L。

好氧反硝化培養(yǎng)基（g/L）：以1.443 g/L KNO代替0.943 g/L （NH）SO，其余同異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基理論NO-N質(zhì)量濃度為200 mg/L。

微量元素溶液配方見文獻(xiàn)。

蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自英國(guó)OXOID公司；其余試劑均為分析純。

QYC-211型恒溫?fù)u床：上海福馬公司；1-14型離心機(jī)：德國(guó)SIGMA公司；UV2000型紫外-可見分光光度計(jì)：美國(guó)UNICO公司；HVE-50 型高壓蒸汽滅菌鍋：日本 HIRAYAMA公司；ABI3730XL型測(cè)序儀：美國(guó)賽默飛公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株分離

取活性污泥樣品于LB培養(yǎng)基中先進(jìn)行活化和富集，將富集后的菌液分別接種到異養(yǎng)硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基中進(jìn)行硝化、反硝化及耐鹽性能馴化。

用稀釋涂布平板法對(duì)馴化后的菌株進(jìn)行分離純化，并分別在異養(yǎng)硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，比較各菌株脫氮性能，選取硝化和反硝化綜合性能優(yōu)異的菌株作為目標(biāo)菌株，加入甘油保存。

1.2.2 菌種鑒定

依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》，對(duì)于分離得到的目標(biāo)菌株進(jìn)行形態(tài)特征和理化特性鑒定。菌株基因組DNA的提取選用DNA試劑盒，采用16S rDNA特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物委托武漢擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果上傳美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）官網(wǎng)進(jìn)行比對(duì)分析，確定細(xì)菌種屬。

1.2.3 菌株脫氮能力的影響因素

將菌株分別接種在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基和好氧反硝化培養(yǎng)基中，研究菌株在不同的鹽度（以NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)，鹽度最高值和最低值分別為菌株耐鹽能力的上限和下限）、碳源、m（C）∶m（N）、初始pH、培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速下的脫氮能力。定期取樣測(cè)定培養(yǎng)基中的NH-N或NO-N質(zhì)量濃度。

1.2.4 菌株在適宜條件下的脫氮性能

確定菌株適宜脫氮條件后，分別取菌液3 mL接種到異養(yǎng)硝化和好氧反硝化培養(yǎng)基，在適宜條件下培養(yǎng)48 h，定時(shí)取樣，測(cè)定培養(yǎng)液中的菌株生長(zhǎng)量（以O(shè)D表征）及各形態(tài)氮的質(zhì)量濃度。

1.3 分析方法

菌株生長(zhǎng)量的測(cè)定采用光密度法；NH-N質(zhì)量濃度的測(cè)定采用納氏試劑分光光度法； NO-N質(zhì)量濃度的測(cè)定采用酚二磺酸紫外分光光度法；NO-N質(zhì)量濃度的測(cè)定采用N-（1-萘基）-乙二胺分光光度法；TN的測(cè)定采用過硫酸鉀氧化紫外分光光度法。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的篩選與鑒定

經(jīng)過馴化分離，得到7株耐鹽異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株，將其編號(hào)為Y1~Y7，再分別對(duì)菌株Y1~Y7進(jìn)行脫氮性能測(cè)試，各菌株的NH-N和NO-N去除率見圖1。由圖1可知，除Y2外，其他6株菌的NH-N和NO-N去除率均高于70%，其中菌株Y1的NH-N和NO-N去除率分別達(dá)到89.08%和87.27%，脫氮效率最高，因而選擇菌株Y1為目標(biāo)菌株。

圖1 各菌株的NH4+-N和NO3--N去除率■ NH4+-N；■ NO3--N

圖2為菌株Y1的菌落形態(tài)和革蘭氏染色顯微照片。由圖2a可知，菌株Y1的菌落形態(tài)呈圓形且邊沿整齊，顏色為不透明的米黃色，表面光滑。由圖2b可知，菌株Y1呈紫色短桿狀，為革蘭氏陽性菌。生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明：接觸酶、硝酸鹽還原及亞硝酸鹽還原試驗(yàn)呈陽性；乙醇發(fā)酵、甲基紅、淀粉水解、硫化氫及明膠液化試驗(yàn)呈陰性。

圖2 菌株Y1的菌落形態(tài)（a）和革蘭氏染色（b）的顯微照片

對(duì)Y1進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，經(jīng)NCBI比對(duì)分析，選取與菌株Y1同源性較高的部分菌株進(jìn)行比較（見表1），發(fā)現(xiàn)其均為海桿菌屬（Marinobacter sp.）。結(jié)合菌株Y1的形態(tài)學(xué)特征、生理生化試驗(yàn)結(jié)果，可以將其歸類為海桿菌屬（Marinobacter sp.）。菌株Y1的NCBI DNA序列數(shù)據(jù)庫（GenBank）登錄號(hào)為MZ831214。

表1 菌株Y1的16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

2.2 菌株脫氮的影響因素

2.2.1 鹽度

在培養(yǎng)溫度為30 ℃、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、m（C）∶m（N）=16、初始pH為9、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，考察不同鹽度對(duì)菌株Y1去除NH-N和NO-N的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：在36 h時(shí)，菌株Y1在3%~7% 鹽度下的NH-N、NO-N去除率均超過95%，而在9%和11%鹽度下的NH-N和NO-N去除率僅為20%~50%；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株Y1逐漸適應(yīng)了高鹽環(huán)境，9%和11%鹽度下雖呈現(xiàn)不同程度的抑制，但最終的NH-N和NO-N去除率均超過99%；當(dāng)鹽度繼續(xù)提高到13%時(shí)，菌株Y1無法再分解NH-N和NO-N；菌株Y1在5%鹽度下脫氮速率最快，30 h時(shí)的NH-N和NO-N去除率分別為99.21%和99.99%。以上結(jié)果表明菌株Y1在3%~11%鹽度范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)并進(jìn)行脫氮，最高耐受鹽度可達(dá)11%，適宜鹽度為5%。

圖3 鹽度對(duì)NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.2 碳源

碳源能為菌株的生長(zhǎng)提供能量并為脫氮過程提供電子，但不同碳源對(duì)菌株脫氮的影響存在差異［10］。在鹽度為5%、m（C）∶m（N）=16、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為9、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，不同碳源對(duì)NH-N和NO-N去除率的影響見圖4。由圖4a可知：在異養(yǎng)硝化過程中，菌株Y1以丁二酸鈉和檸檬酸三鈉為碳源時(shí)，NH-N在6~36 h內(nèi)快速分解，36 h 后的NH-N去除率均超過99%；當(dāng)碳源為蔗糖和葡萄糖時(shí)，NH-N的去除率相對(duì)較低（<75%）。由圖4b可知：好氧反硝化過程中，以葡萄糖、檸檬酸三鈉為碳源時(shí)，30 h 時(shí)的NO-N去除率分別為99.14%和92.78%；而以丁二酸鈉、蔗糖為碳源時(shí)，NO-N的去除率相對(duì)較低。以上結(jié)果表明異養(yǎng)硝化過程中丁二酸鈉為碳源時(shí)的脫氮效果最好，好氧反硝化過程以葡萄糖為碳源時(shí)的脫氮效果最好。

圖4 碳源對(duì)NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.3 m（C）∶m（N）

在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、培養(yǎng)溫度為30 ℃、初始pH為9、搖床轉(zhuǎn)速 為150 r/min的條件下，考察m（C）∶m（N）對(duì)NH-N和NO-N去除率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可見：當(dāng)m（C）∶m（N）分別為4和8時(shí)，NH-N去除率分別為46.89%和82.17%，NO-N去除率分別為27.68%和64.32%，這是由于碳源含量較低時(shí)菌株Y1不能充分生長(zhǎng)，脫氮效率低；當(dāng)m（C）∶m（N）提高至12時(shí)，菌株Y1在36 h時(shí)的NH-N去除率高達(dá)99.79%，但NO-N的去除仍受到部分抑制，這是由于反硝化過程利用有機(jī)碳源作為電子供體，需要更高的m（C）∶m（N）；當(dāng)m（C）∶m（N）達(dá)到16時(shí)，NH-N、NO-N的去除率均超過99%。當(dāng)m（C）∶m（N）進(jìn)一步提高至20時(shí)，過高的m（C）∶m（N）使得菌株Y1生長(zhǎng)代謝不平衡，NH-N、NO-N的去除率不再提高。結(jié)合菌株Y1的硝化、反硝化脫氮效果，選擇適宜的m（C）∶m（N）為16。

圖5 m（C）∶m（N）對(duì)NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.4 初始pH

pH能通過影響細(xì)胞膜的通透性和酶的活性等來影響微生物的生長(zhǎng)和代謝。在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、 m（C）∶m（N）=16、培養(yǎng)溫度為30 ℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下，初始pH對(duì)NH-N和NO-N去除率的影響見圖6。由圖6可知，當(dāng)初始pH為8~10時(shí)，菌株Y1在異養(yǎng)硝化36 h時(shí)的NH-N去除率超過99%，反硝化過程在24 h 時(shí)的NO-N去除率也達(dá)99%以上，表明弱堿性環(huán)境更有利于菌株Y1的生長(zhǎng)和脫氮。當(dāng)初始pH為7時(shí)，菌株Y1的NH-N、NO-N的去除率降低，去除速率均有所變慢。當(dāng)pH=6時(shí)，Y1培養(yǎng)24 h的NH-N去除率僅為28.80%，去除速率明顯減慢，反硝化過程受到嚴(yán)重抑制。表明菌株Y1的適宜初始pH為8~10。

圖6 初始pH對(duì)NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.5 培養(yǎng)溫度

在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、m（C）∶m（N）=16、初始pH為9、搖床轉(zhuǎn)速 為150 r/min的條件下，考察培養(yǎng)溫度對(duì)NH-N和NO-N去除率的影響，結(jié)果見圖7。由圖7可知：異養(yǎng)硝化過程中，當(dāng)培養(yǎng)溫度為20~40 ℃時(shí)，菌株Y1在培養(yǎng)48 h后的NH-N去除率超過99%；好氧反硝化時(shí)，隨著溫度的升高，NO-N去除率呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)，且當(dāng)溫度為25 ℃和30 ℃時(shí)NO-N的去除率皆達(dá)到97%以上，原因是溫度過高或過低時(shí)均會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)代謝。相較于異養(yǎng)硝化過程，反硝化過程對(duì)溫度的變化更為敏感，這可能是由于反硝化過程中相關(guān)酶對(duì)溫度要求更為嚴(yán)苛。菌株Y1在30 ℃時(shí)NH-N和NO-N的去除率最高。

圖7 培養(yǎng)溫度對(duì)NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.2.6 搖床轉(zhuǎn)速

搖床轉(zhuǎn)速是影響培養(yǎng)基中溶解氧濃度的主要因素，提高搖床轉(zhuǎn)速可增大溶解氧濃度。在鹽度為5%、分別以丁二酸鈉和葡萄糖為碳源、m（C）∶m（N）=16、初始pH為9、培養(yǎng)溫度為30 ℃的條件下，考察搖床轉(zhuǎn)速對(duì)NH-N和NO-N去除率的影響，結(jié)果見圖8。由圖8可知：在50~250 r/min轉(zhuǎn)速下，NH-N和NO-N去除率隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高而加快。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為50 r/min時(shí)，NH-N和NO-N的去除率均不超過30%，低轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)基中溶解氧濃度低，菌株Y1生長(zhǎng)速率受到抑制、脫氮效率低；當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速增至150~250 r/min，菌株Y1的NH-N、NO-N去除率均超過99%；搖床轉(zhuǎn)速為250 r/min時(shí)，NH-N和NO-N的去除效果與200 r/min幾近相同。因此適宜的搖床轉(zhuǎn)速為150~200 r/min。

圖8 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)NH4+-N（a）和NO3--N（b）去除率的影響

2.3 菌株的脫氮特性

2.3.1 異養(yǎng)硝化特性

將菌株Y1在上述優(yōu)化條件下以異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液的OD及各形態(tài)N的質(zhì)量濃度見圖9。由圖9可知：在0~6 h，菌株Y1生長(zhǎng)緩慢，NH-N和TN只有少量被降解；6 h后菌株Y1的生長(zhǎng)量開始呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，同時(shí)NH-N和TN的濃度快速降低，至24 h時(shí)ρ（NH-N）和ρ（TN）分別為1.21 mg/L和23.21 mg/L，去除率分別達(dá)到99.31%和88.14%；整個(gè)異養(yǎng)硝化過程幾乎沒有NO-N的積累；NO-N于24 h出現(xiàn)最大積累量（16.23 mg/L），隨后被立即去除。這可能是由于硝酸鹽還原酶活性較低，致使硝化過程中NO-N的積累大于反硝化時(shí)NO-N的消耗，而亞硝酸鹽氧化酶活性較強(qiáng)，在硝化過程中NO-N快速轉(zhuǎn)化為NO-N。TN的減少說明氨態(tài)氮最終被轉(zhuǎn)化為氮?dú)饣虻趸?，菌株Y1在進(jìn)行異養(yǎng)硝化反應(yīng)的同時(shí)也進(jìn)行了反硝化反應(yīng)，表現(xiàn)出同步硝化反硝化優(yōu)勢(shì)。

圖9 優(yōu)化條件下菌株Y1異養(yǎng)硝化培養(yǎng)液的OD600及各形態(tài)N的質(zhì)量濃度

2.3.2 好氧反硝化特性

將菌株Y1在上述優(yōu)化條件下以好氧反硝化培養(yǎng)基（初始NO-N質(zhì)量濃度為189.38 mg/L）培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液的OD及各形態(tài)N的質(zhì)量濃度見圖10。由圖10可見：菌株Y1培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；6~12 h時(shí)NO-N和TN的質(zhì)量濃度快速減少，分別從184.67 mg/L和201.25 mg/L降至42.36 mg/L和66.50 mg/L，平均降解速率分別達(dá)到23.72 mg/（L·h）和22.46 mg/（L·h）；NO-N的快速降解導(dǎo)致NO-N轉(zhuǎn)化不及時(shí)并于12 h出現(xiàn)少量積累（2.91 mg/L），但隨后被立即去除；菌株Y1經(jīng)24 h到達(dá)生長(zhǎng)穩(wěn)定期，此時(shí)NO-N和TN的質(zhì)量濃度分別為10.67 mg/L和23.25 mg/L，去除率分別達(dá)到94.37%和89.36%，表明菌株Y1對(duì)NO-N和TN有良好的反硝化去除能力；繼續(xù)培養(yǎng)至36 h，菌株Y1因培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)不足進(jìn)入衰亡期，幾乎不再進(jìn)行脫氮。

圖10 優(yōu)化條件下菌株Y1好氧反硝化培養(yǎng)液的OD600及各形態(tài)N的質(zhì)量濃度

3 結(jié)論

a）從醫(yī)藥廢水生物處理好氧段活性污泥中分離得到1株耐鹽異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株Y1，鑒定為海桿菌（Marinobacter sp.）。

b）菌株Y1適宜的脫氮條件為：鹽度5%，異養(yǎng)硝化以丁二酸鈉為碳源，好氧反硝化以葡萄糖為碳源，m（C）∶m（N）=16，初始pH=8~10，培養(yǎng)溫度30 ℃，搖床轉(zhuǎn)速150~200 r/min。

c）適宜條件下，異養(yǎng)硝化過程中NH-N和TN的去除趨勢(shì)相同，24 h去除率分別為99.31%和88.14%；好氧反硝化過程中NO-N和TN的去除基本同步，24 h去除率分別為94.37%和89.36%。硝化和反硝化過程中分別出現(xiàn)了少量的NO-N和NO-N的積累，隨后被立即去除，表明菌株Y1在高鹽度環(huán)境下仍具有良好的同步硝化反硝化脫氮潛能。