鄭 丹，王莎莎

（1.咸陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712000；2.四川省資陽市環(huán)境保護(hù)局，四川 資陽 641300）

花椒是一種食藥兩用原料，其提取物生物堿因良好的抗氧化性、抑菌活性、抗炎、鎮(zhèn)痛、殺蟲、抑制血小板凝集、抗腫瘤、抗瘧疾等已被廣泛應(yīng)用于制藥、食品、化妝品行業(yè)[1,2]。超聲輔助提取天然產(chǎn)物已被廣泛應(yīng)用[3,4]。目前，生物堿的常用測定方法為高效液相色譜法[5-7]，其測定雖準(zhǔn)確，但耗時(shí)長，費(fèi)用高，前處理較為繁瑣，不適宜快速檢測含量。分光光度法操作簡單，尤其當(dāng)分析樣本數(shù)量較大時(shí)，其簡便、快速、可靠的特性更具實(shí)際意義，因此，在定量分析生物堿類化合物含量中應(yīng)用廣泛。本文運(yùn)用超聲輔助提取技術(shù)，結(jié)合中心復(fù)合設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析處理方法優(yōu)化花椒提取工藝參數(shù)，旨在為其實(shí)驗(yàn)研究和工業(yè)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所）；韓城大紅袍花椒（2020年產(chǎn)，干燥至恒重，粉碎備用）；無水乙醇（成都市科龍化工試劑廠）、三氯甲烷（成都市科龍化工試劑廠）、HCl（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），以上試劑均為優(yōu)級純。

KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；FW-100型植物粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 花椒生物堿提取方法 采用乙醇浸泡輔助超聲提取[8]。在錐形瓶中準(zhǔn)確稱取1.00g花椒粉末，加入乙醇浸泡后超聲提取。提取液經(jīng)砂芯漏斗抽濾，吸取5mL濾液水浴蒸干后加入5%HCl溶液溶解，過濾，濾液經(jīng)氯仿多次萃取，分離氯仿層，水浴蒸干后加無水乙醇溶解，過濾，50mL容量瓶定容。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 保持其他條件不變，逐步考察單一因素對花椒生物堿提取率的影響。

1.2.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn) Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)（“-1”為低水平，“+1”為高水平）[9]。在單因素基礎(chǔ)上，從料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、浸泡時(shí)間（C）、超聲功率（D）、超聲溫度（E）、提取次數(shù)（F）、乙醇濃度（G）中篩選顯著影響花椒生物堿提取率的因子。

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化方法 中心復(fù)合響應(yīng)面分析法是考察響應(yīng)值與影響因素之間的關(guān)系，是一種非線性的多項(xiàng)式模式，用來估計(jì)一階、二階與一階相互交互作用[10]。繼單因素實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)后，得知料液比（A）、超聲功率（D）、乙醇濃度（G）為花椒生物堿提取率的顯著影響因素，進(jìn)一步采用響應(yīng)面分析優(yōu)化各因素對響應(yīng)值的影響。中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2。

表2 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Tab.2 Factors and levels in response surface design

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

向盛有5.00mg白屈菜紅堿標(biāo)準(zhǔn)品的小燒杯中加入無水乙醇，經(jīng)溶解、定容后，配制成0.200mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液25mL，分別量取0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制成20.00，30.00，40.00，50.00，60.00，70.00，80.00μg·mL-1溶液各10mL，在425nm處測定A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:A=0.0085ρ-0.0187，R2=0.9996。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)初選提取條件

2.1.1 料液比對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1花椒生物堿提取方法，保持其他條件不變，料液比與花椒生物堿提取率的關(guān)系見圖1。

圖1 料液比對花椒生物堿提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of alkaloids

由圖1可知，當(dāng)料液比小于1∶20，花椒生物堿提取率隨著料液比的增加逐漸增大；當(dāng)料液比大于1∶20，花椒生物堿在乙醇中的溶出率趨緩，考慮到節(jié)能、環(huán)保，選用料液比1∶20為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.1.2 超聲時(shí)間對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1花椒生物堿提取方法，保持其他條件不變，考察超聲時(shí)間對花椒生物堿提取率的影響，見圖2。

圖2 超聲時(shí)間對花椒生物堿提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic on extraction yield of alkaloids

由圖2可知，5~20min，花椒生物堿提取率隨著超聲時(shí)間增加而增大，20min達(dá)到最大值，超過20min后花椒生物堿的提取率反而下降，可能是由于花椒生物堿的溶出趨于飽和，且超聲破壞了花椒生物堿中的不穩(wěn)定成分。因此，選用超聲20min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.1.3 浸泡時(shí)間對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1花椒生物堿提取方法，保持其他條件不變，超聲提取前浸泡時(shí)間與花椒生物堿提取率之間的關(guān)系，見圖3。

圖3 浸泡時(shí)間對花椒生物堿提取率的影響Fig.3 Effect of soak time on extraction yield of alkaloids

由圖3可知，花椒生物堿提取率隨著超聲前浸泡時(shí)間增加呈先增大后減小，在浸泡時(shí)間50min時(shí)，花椒生物堿提取率最大，此時(shí)花椒生物堿的溶出趨于飽和，因此，選用浸泡時(shí)間50min作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.1.4 超聲功率對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，考察超聲功率與花椒生物堿的關(guān)系，見圖4。

圖4 超聲功率對花椒生物堿提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on extraction yield of alkaloids

由圖4可知，在超聲功率40~80W，花椒生物堿的提取率隨超聲功率的增大而增大，但當(dāng)超聲功率大于80W時(shí)，過大的超聲功率使花椒中的色素、脂溶性等成分不斷溶出，生物堿成分被破壞，因而，生物堿的提取率逐漸下降。因此，選用超聲功率80W作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.1.5 超聲溫度對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，考察超聲溫度與花椒生物堿提取率的關(guān)系，見圖5。

圖5 超聲溫度對花椒生物堿提取率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of alkaloids

由圖5可知，花椒生物堿提取率隨超聲溫度的增大呈先增大后減小。在超聲溫度30~70℃，花椒生物堿提取率隨著超聲溫度的升高逐漸增大，在超聲溫度達(dá)70℃時(shí)，生物堿提取率最大。當(dāng)提取溫度繼續(xù)升高，花椒生物堿結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易被破壞，且雜質(zhì)溶出增多，花椒生物堿提取率下降。因此，選用超聲溫度70℃作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.1.6 提取次數(shù)對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1的提取方法，考察提取次數(shù)與花椒生物堿關(guān)系，見圖6。

圖6 提取次數(shù)對花椒生物堿提取率的影響Fig.6 Effect of extracting times on extraction yield of alkaloids

由圖6可知，花椒生物堿提取率隨著提取次數(shù)的增加而增大，當(dāng)提取次數(shù)達(dá)到兩次后，花椒生物堿的提取率變化不大，說明此時(shí)花椒生物堿的有效成分已基本提取完成，考慮到經(jīng)濟(jì)、時(shí)間成本，選用提取次數(shù)兩次作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.1.7 乙醇濃度對花椒生物堿提取率的影響 采用1.2.1花椒生物堿提取方法，保持其他條件不變，考察乙醇濃度對花椒生物堿提取率的影響，見圖7。

圖7 乙醇濃度對花椒生物堿提取率的影響Fig.7 Effect of ethanol concentration on extraction yield of alkaloids

由圖7可知，花椒生物堿提取率隨乙醇濃度的增大呈先增大后減小，在乙醇濃度為70%時(shí)，出現(xiàn)拐點(diǎn)。這是因?yàn)殡S溶液濃度增大，溶液極性與生物堿極性越接近時(shí)，根據(jù)相似相溶原理，花椒生物堿溶出率增大。因此，選用與生物堿極性最為接近的70%的乙醇濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的參考值。

2.2 顯著影響因子的篩選

進(jìn)行12組Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值，見表3。

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Tab.3 Plackett-Burman test design and result

PB實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Minitab15進(jìn)行回歸模型方差分析，結(jié)果見表4。

表4 回歸模型方差分析Tab.4 Analysis of variance of regression equation

由表4可知，P=0.002，小于0.05，表明回歸擬合顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

料液比（A）、超聲功率（D）、乙醇濃度（G）是影響花椒生物堿提取率主要因素，見表5和圖8、9。

圖8 影響因素的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖（響應(yīng)為C12,Alpha=.05）Fig.8 Pareto diagram of standardization of influencing factors

表5 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Tab.5 Partial regression coefficients and significance test

回歸得到多元一次方程為Y=9.627+0.576A+0.223B+0.251C-1.068D+0.198E-0.183F+1.266G

圖9 影響因素的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的正態(tài)圖（響應(yīng)為C12,Alpha=.05）Fig.9 Normal graph of the standardization effect of influencing factors

2.3 非線性優(yōu)化工藝條件

2.3.1 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)過單因素初步優(yōu)化及顯著性篩選試驗(yàn)后，選取料液比（A）、超聲功率（D）、乙醇濃度（G）3個(gè)對花椒生物堿提取效果顯著的因素，將3因素的最優(yōu)值作為中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)的中心點(diǎn)，選取中心點(diǎn)6個(gè)，析因點(diǎn)14個(gè)，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表6。

表6 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值Tab.6 Experiment design and result of response surface design

2.3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸模型方差分析 表6實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Minitab15分析后，得到生物堿提取率Y與自變量A、D和G的關(guān)系的多元二次回歸方程：

Y＝0.079A-0.009D-0.047G-0.302A2-0.258D2-0.120G2-0.074AD-0.019AG-0.0088DG+12.867，回歸方程顯著性檢驗(yàn)見表7。

表7 回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表Tab.7 Significance test table of regression coefficient

由表7可知，一次項(xiàng)料液比A，二次項(xiàng)料液比A2、超聲功率D2、乙醇濃度G2，交互項(xiàng)料液比與超聲功率AD等對生物堿的提取影響顯著。

表8為回歸方程方差分析。

表8 回歸方程方差分析Tab.8 Analysis of variance of regression equation

由表8可知，模型中F＝84.25大于F0.01（9,5）＝10.2，P小于0.001，表明該模型中有顯著的影響因子；對線性進(jìn)行分析，P=0.001表明料液比、超聲功率、乙醇濃度對花椒生物堿提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。對模型進(jìn)行可信分析，得到復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=97.40%，表明該模型能夠解釋97.40%生物堿含量的影響因素，該模型擬合較好。Y的變異系數(shù)較低，驗(yàn)證該實(shí)驗(yàn)的變異程度低、精確度高。綜上所述，該實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蚝芎玫哪M生物堿的提取。

2.3.3 非線性回歸模型擬合最優(yōu)條件的確定 對上述非線性回歸模型擬合分析，得生物堿的最佳提取量的條件：A=0.1515，D=0，G=-0.03030，Y=59.4841。所以與之對應(yīng)的花椒生物堿得率最高時(shí)的提取條件組成為：料液比為1∶20，超聲功率80W，乙醇濃度70%。

3 結(jié)論

經(jīng)單因素、Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)一步采用中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取花椒生物堿影響因素和水平，并建立數(shù)學(xué)模型，得出料液比為1∶20、超聲功率80W、乙醇濃度70%為花椒生物堿最佳提取工藝，及此工藝條件下花椒生物堿含量為12.48mg·g-1。采用超聲輔助提取技術(shù)，耗時(shí)短、操作簡便，拓寬了花椒功能研究的途徑。