周娃娃，符愛貞，高梅

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種人類胎盤疾病，同時伴有母體多種器官系統(tǒng)反應(yīng)[1]。雖然PE的病因尚未完全闡明，但血管功能障礙導(dǎo)致胎盤功能不良(包括功能障礙和無序的新生血管形成)被認(rèn)為是其主要原因[2]。人組織激肽釋放酶結(jié)合蛋白(kallistatin，KS)是一種主要由肝臟合成的絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)[3]，它在抑制組織激肽釋放酶的同時，其活性部分可刺激內(nèi)皮一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)、人沉默調(diào)節(jié)蛋白1(sirtuin 1,SIRT1)和細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子-3(suppressor of cytokine signaling-3,SOCS-3)的表達(dá)[4-6]。因此，一些基礎(chǔ)和人體研究都證實KS具有抑制炎癥、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和血管生成以及血管舒張功能，例如通過修復(fù)血管損傷和強(qiáng)大的擴(kuò)血管作用，對肺動脈高壓[7]、腎實質(zhì)性高血壓[8]等都具有一定的保護(hù)機(jī)制。基于KS在降壓和血管系統(tǒng)中的作用，推斷其與PE的相關(guān)病理學(xué)有關(guān)。因此本研究旨在分析PE患者和正常妊娠人群血清KS水平在孕早期時的差異，并進(jìn)一步評估血清KS水平預(yù)測早發(fā)型子癇前期(early onset preeclampsia，EOPE)的價值，從而為尋找可靠的生物標(biāo)志物及潛在的PE治療靶點提供證據(jù)支持。

1 資料和方法

1.1 研究對象

回顧性分析2020年3～11月在?？谑袐D幼保健院產(chǎn)科門診建檔、接受常規(guī)檢查和分娩，且追蹤隨訪確診的110例PE患者的臨床和實驗室參數(shù)，根據(jù)PE類型分為55例EOPE(EOPE組，34孕周之前發(fā)生)和55例晚發(fā)型PE(LOPE組，34孕周之后發(fā)生)。另外按照1∶1比例招募與研究對象孕周(±1周)相匹配、無任何妊娠并發(fā)癥且適于胎齡兒的55例孕婦作為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：18～40歲單胎妊娠女性，自愿參與本研究，產(chǎn)檢和分娩資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：<18歲和>40歲的女性，有炎癥性腸病、血管炎、風(fēng)濕性疾病等炎癥性疾病史的女性；合并急性或慢性感染者；多胎妊娠；任何胎兒染色體或發(fā)育異常；孕產(chǎn)婦系統(tǒng)性疾病，如妊娠期糖尿病、已知的高血壓疾病、已知的肝臟、腎臟和腎上腺疾??；胎膜早破；已經(jīng)進(jìn)入第二產(chǎn)程的孕婦。該研究方案得到我院倫理委員會的批準(zhǔn)，遵守世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言關(guān)于人類受試者和/或動物研究的道德行為。

1.2 PE診斷標(biāo)準(zhǔn)

既往沒有高血壓病史的孕婦在20孕周產(chǎn)檢時測量2次動脈壓(至少間隔4 h)≥140/90 mmHg，且符合以下一項或多項標(biāo)準(zhǔn)則可診斷為PE[9]：① 24 h尿蛋白≥300 mg或蛋白/肌酐比值≥30 mg/mL；② 急性腎損傷的生化或臨床體征(肌酐≥90 μmol/L或1 mg/dL)或肝臟受累(丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶或天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶>40 IU/L)或神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，如子癇、精神狀態(tài)改變、失明、中風(fēng)、痙攣、嚴(yán)重頭痛、持續(xù)性視覺暗點或血液學(xué)并發(fā)癥(血小板計數(shù)<150×109/L、彌散性血管內(nèi)凝血、溶血)；③ 多普勒檢查證實宮內(nèi)生長遲緩(intrauterine growth retardation,IUGR)或子宮胎盤循環(huán)受損或胎兒死亡[1]。

1.3 檢測指標(biāo)

在入組時記錄孕婦的臨床特征和生化結(jié)果。血液參數(shù)包括全血細(xì)胞計數(shù)(complete blood count,CBC)、血清電解質(zhì)、肝酶、尿酸、膽紅素、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐和血清KS。采集5～13孕周孕婦的外周血。孕齡根據(jù)最后1次月經(jīng)周期和妊娠頭3個月的超聲波頂臀長來計算。在給予任何藥物前用乙二胺四乙酸或血清管采集外周靜脈血標(biāo)本。收集樣品后30 min內(nèi)，在2～8°C下1 000 r/min離心15 min。立即置于-80℃保存直至進(jìn)行生化檢查。將樣品解凍，使用KS酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(SL3025Hu，中國Sunlong Biotech公司)定量測定血清樣KS含量。在標(biāo)準(zhǔn)全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)上讀取450 nm波長處的光密度值。檢測范圍為1 ～ 80 ng/mL，靈敏度為0.1 ng/mL。

1.4 子宮動脈多普勒檢測

于妊娠22～24周時，使用GE Voluson E10彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)(美國GE醫(yī)療公司)進(jìn)行子宮動脈多普勒超聲掃描。將傳感器沿腹股溝管放置。利用彩色多普勒二維超聲顯像，確定子宮外側(cè)髂外血管和子宮血管。子宮動脈以大約90°的角度穿過髂外血管。從子宮動脈近端應(yīng)用脈沖波多普勒超聲。波形與血管之間的共振角度保持在0°左右(<30°)。獲得3個連續(xù)完整的波形，計算平均搏動指數(shù)(pulsatile index,PI)，注意是否存在舒張早期切跡(圖1，見彩插1)。子宮動脈多普勒異常表現(xiàn)為平均PI>相應(yīng)孕周PI值的95個百分位。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3組孕婦基線資料比較

EOPE組孕婦血清KS水平低于對照組，子宮動脈PI值、收縮壓及單雙側(cè)存在舒張早期切跡的比例高于對照組，且分娩孕周相對更早，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。EOPE組孕婦甘油三酯高于LOPE組，血清KS水平則低于LOPE組(P<0.05)，LOPE組孕婦血清KS水平和子宮動脈PI值與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 3組孕婦人口統(tǒng)計學(xué)、臨床和實驗室特征

2.2 ROC曲線分析血清KS預(yù)測EOPE的臨床價值

基于ROC曲線，血清KS預(yù)測EOPE的最佳截斷值為28.60 ng/mL(AUC=0.725,95%CI：0.603-0.848，P<0.001)。使用血清KS≤28.60 ng/mL預(yù)測EOPE時，敏感性為59.1%，特異性為87.4%，陽性預(yù)測值(positive predictive value,PPV)為19.7%，陰性預(yù)測值(negative predictive value,NPV)為97.6%，見下頁圖2。

圖2 血清KS用于預(yù)測EOPE時的ROC曲線

2.3 多因素Logistic回歸分析預(yù)測EOPE發(fā)生風(fēng)險的臨床因素

以EOPE作為因變量，將舒張早期切跡(單側(cè)和雙側(cè))、血清KS、甘油三酯和其他混雜因素(年齡、采血孕周)納入回歸模型，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，舒張早期切跡(單側(cè)和雙側(cè))、血清KS≤28.60 ng/mL是預(yù)測EOPE風(fēng)險的獨立危險因素(P<0.05)，詳見下頁表2。

表2 多因素Logistic回歸分析預(yù)測EOPE發(fā)生風(fēng)險的臨床因素

2.4 ROC曲線分析血清KS和子宮動脈平均PI值對EOPE的預(yù)測價值

經(jīng)ROC曲線分析，血清KS≤28.60 ng/mL聯(lián)合子宮動脈平均PI>相應(yīng)孕周PI值的95個百分位用于預(yù)測EOPE的敏感度、特異度、PPV、NPV、似然比(likelihood ratio,LR)詳見表3。

表3 ROC曲線分析血清KS和子宮動脈平均PI值對EOPE的預(yù)測價值

3 討論

雖然PE的確切病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚，但目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制包括胎盤灌注不良、血管生成不平衡以及胎盤炎癥因素等[10]。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入螺旋動脈的過程受損，導(dǎo)致胎盤灌注不良。子宮動脈總外周阻力增加表明絨毛間隙血管重塑失敗[11]。系統(tǒng)觀察表明，子宮動脈PI值單獨增加和/或聯(lián)合舒張早期切跡是預(yù)測PE較好的指標(biāo)，但是在孕早期的靈敏度有限[12]。本研究數(shù)據(jù)也證實了這一點，ROC曲線得到的靈敏度僅為5.7%，但特異性很高。而子宮動脈多普勒超聲和/或血清KS用于預(yù)測EOPE，則很好地提高了敏感性，說明結(jié)合子宮動脈多普勒和生化標(biāo)志物可以更好地預(yù)測EOPE，但是對于LOPE幾乎沒有預(yù)測價值。

在生理性妊娠中，血管舒張功能的正常發(fā)揮至關(guān)重要，這主要與NO通路正常有關(guān)[13]。NO通路在排卵、著床、子宮血管重塑、調(diào)節(jié)周圍血管阻力和血管反應(yīng)活性等方面具有重要作用。此外NO通路在缺乏自主神經(jīng)支配的胎盤中具有自分泌和旁分泌作用，并可調(diào)節(jié)胎盤循環(huán)[14]。預(yù)防性給予NO供體季戊四醇四硝酸酯可降低孕中期胎盤灌注異常的女性發(fā)生IUGR的風(fēng)險[15]。雖然PE的病理生理學(xué)不能完全解釋，但母體血管功能障礙的存在是PE的基礎(chǔ)。與LOPE相比，EOPE與導(dǎo)致灌注不足的胎盤病變具有更高的相關(guān)性[16]。體內(nèi)和體外研究表明，NO信號通路異常與PE的發(fā)展及其嚴(yán)重程度之間存在密切關(guān)聯(lián)[2,17]。在PE患者中，NO生物利用度降低，抑制NOS和抗血管生成因子的相關(guān)分子分泌增加[2]。由于KS可通過其活性部分誘導(dǎo)NOS，因此PE患者血清KS水平的降低可導(dǎo)致NO合成減少。

從分子機(jī)制分析，KS結(jié)構(gòu)中的活性部分可刺激SIRT1和SOCS-3。SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白脫乙酰酶家族的成員，是一種營養(yǎng)傳感器。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1在胎盤發(fā)育和滋養(yǎng)層分化中發(fā)揮重要作用[18]。SIRT1在缺氧病例中表達(dá)增加，在炎癥和氧化病例中表達(dá)減少，例如PE患者的胎盤組織中[18-19]。這種減少與PE患者胎盤滋養(yǎng)層能量不足導(dǎo)致的壽命縮短有關(guān)。此外SOCS-3可抑制IL-6、瘦素和促紅細(xì)胞生成素。SOCS-3在PE患者母體內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)減少，被認(rèn)為與改變了細(xì)胞因子信號、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)增加有關(guān)[20]。在動物實驗中，高血壓大鼠血清KS較正常大鼠普遍降低，靜脈給藥后，高血壓大鼠和正常大鼠的血壓都能迅速但暫時下降。即使在轉(zhuǎn)基因大鼠中，給予外源性KS也能降低血壓[21]。除了降壓作用外，給予外源性KS還會引起孤立性主動脈環(huán)患者血管舒張，但是不能消除艾替班特(激肽B2受體拮抗劑)引起的血壓降低和血管舒張，表明KS對血壓的影響與組織激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)無關(guān)[22]。然而，給予NOS抑制劑(Nω-硝基-L-精氨酸甲酯，L-NAME)可阻斷KS的擴(kuò)血管效應(yīng)。這表明，KS的血管擴(kuò)張作用與內(nèi)皮NOS表達(dá)增加和激活相關(guān)的NO生成有關(guān)。因此在本研究中，EOPE孕婦血清KS水平降低可能預(yù)示著SIRT1和SOCS-3刺激減少，導(dǎo)致NOS活性和NO生成的降低，胎盤滋養(yǎng)層能量供應(yīng)不足且炎癥反應(yīng)增加，最終導(dǎo)致胎盤壽命縮短。

KS在妊娠中的作用是目前國內(nèi)一個鮮有人關(guān)注的方面。Chao J等[23]曾觀察到21例孕婦的血漿KS水平低于30名健康女性和男性。這種下降是由于懷孕期間產(chǎn)量減少或血漿稀釋增加。而我們研究的主要優(yōu)勢是對EOPE和LOPE孕婦進(jìn)行了血清KS評估，并證實檢測孕早期血清KS水平可提高子宮動脈PI值和舒張早期切跡對于EOPE預(yù)測的靈敏度。但局限性在于病例樣本偏少，KS在PE中的作用機(jī)制尚不明確。

綜上，與孕齡匹配的對照組相比，EOPE孕婦孕早期血清KS水平普遍降低，同時也低于LOPE孕婦。而低血清KS水平預(yù)示著孕婦EOPE風(fēng)險增加，檢測孕早期血清KS水平可提高子宮動脈PI值和舒張早期切跡預(yù)測EOPE的靈敏度。但是KS對PE患者的降壓作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。