周文，周歡群，李思楠，陳旭龍，謝妍，倪運萍，陸杉

目前男性不育的診斷是基于WHO第五版定義的精液常規(guī)參數(shù)，如精液量、濃度、活力、總數(shù)及形態(tài)等，但對男性不育的診療價值有限。精子DNA碎片在自然妊娠和輔助生殖中對受精、胚胎發(fā)育和父方遺傳信息傳遞都有重要影響[1]。精子DNA碎片是評估男性不育非常有價值的工具，但在預(yù)測輔助生殖技術(shù)結(jié)局方面的臨床意義仍不確定。關(guān)于精子DNA碎片指數(shù)(DNA fragmentation index，DFI)與輔助生殖結(jié)局的關(guān)聯(lián)，報道集中于體外受精(in vitro fertilization，IVF)、卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytoplasm sperm injection，ICSI)，對宮腔內(nèi)人工授精(intrauterine insemination，IUI)的報道較少，精子DFI對IUI臨床結(jié)局的預(yù)測價值存在較大的爭議，且難以確定預(yù)測IUI結(jié)果的閾值[2]。其次，關(guān)注點主要集中于精子DFI對IUI臨床妊娠率、自然流產(chǎn)的影響[3]，而與活產(chǎn)率、新生兒身長、體重相關(guān)性的報道較少。本研究對廣東省中醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科近4年完成的首次IUI臨床結(jié)局資料及術(shù)前3個月內(nèi)的精子DFI數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，主要探討精子DFI對IUI臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率及新生兒指標(biāo)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對2016年12月至2020年2月廣東省中醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科完成的首次IUI周期的臨床結(jié)局資料及術(shù)前3個月內(nèi)的精子DFI數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，納入條件：① 女性為第一個IUI周期，且丈夫術(shù)前3個月內(nèi)完成了精子DFI篩查(SCD法)；② 20歲<女性年齡<45歲；③ 臨床結(jié)局資料隨訪至分娩，資料完善。排除條件：① 排除SCSA法、TUNEL法、Comet法檢測精子DFI的患者；② 排除優(yōu)化后PR精子總數(shù)<2×106/mL的患者；③ 排除嚴(yán)重精神疾病及其他系統(tǒng)性疾病的患者。最終納入393例女性，年齡22～43歲，平均(30.91±1.79)歲；平均不孕年限(3.19±1.79)年；平均體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)(21.98±3.31) kg/m2。根據(jù)丈夫精子DFI分為以下兩組：DFI<30%組(318例)，DFI≥30%組(75例)，兩組男方年齡、女方年齡、女方BMI、不孕因素、流產(chǎn)史、處理后PR精子總數(shù)等一般資料有可比性(P>0.05)，詳見下頁表1。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

(1)一般資料收集：從生殖醫(yī)學(xué)科IUI病歷系統(tǒng)收集患者首次IUI時的年齡、不孕年限、不孕因素、BMI、流產(chǎn)史、方案及精液優(yōu)化結(jié)果等臨床資料。

(2)IUI臨床結(jié)局資料收集：所有患者隨訪至分娩。從生殖醫(yī)學(xué)科IUI病歷系統(tǒng)隨訪模塊收集患者首次IUI的臨床結(jié)局資料，包括臨床妊娠、生化妊娠、自然流產(chǎn)、異位妊娠、早產(chǎn)、活產(chǎn)、出生體重、出生身長、出生缺陷等。計算公式：臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總周期數(shù)×100%，自然流產(chǎn)率=自然流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%，活產(chǎn)率=活產(chǎn)周期數(shù)/總周期數(shù)×100%。

(3)IUI治療方案：

① 自然周期：監(jiān)測卵泡發(fā)育；確定排卵日及選擇夫精人工授精(artificial insemination by husband，AIH)時機(jī)：當(dāng)主導(dǎo)卵泡直徑達(dá)16～20 mm，血E2達(dá)到900～1 110 pmol/L(270～300 pg/mL)，出現(xiàn)尿黃體生成素(luteinizing hormone，LH)峰或血LH水平上升到大于基礎(chǔ)值2倍以上，12～36 h后行AIH。未出現(xiàn)尿LH峰或血LH水平未達(dá)到基礎(chǔ)值2倍以上，使用人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)5 000～10 000 U肌注誘導(dǎo)排卵，24～36 h后行AIH。

② 促排卵周期：促排卵方案包括：克羅米芬(clomiphene citrate，CC)/來曲唑+hCG、CC/來曲唑+人絕經(jīng)期促性腺激素(human menopausal gonadotropin，hMG)+hCG、卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)/hMG +hCG。卵泡生長及子宮內(nèi)膜監(jiān)測：B超監(jiān)測卵泡發(fā)育情況及子宮內(nèi)膜的同步增長情況。注射hCG及AIH時機(jī)的選擇：若1個卵泡直徑≥18 mm，或2個卵泡直徑≥17 mm，停用Gn，若未出現(xiàn)尿LH峰或血LH水平未達(dá)到基礎(chǔ)值2倍以上，注射hCG10 000 U或GnRHa誘導(dǎo)排卵，24～36 h后行AIH；若前1天晚上尿中出現(xiàn)LH峰值，當(dāng)日上午B超監(jiān)測未排卵，當(dāng)日上午注射hCG 10 000 U并行AIH 1次；若當(dāng)日晨尿中出現(xiàn)LH峰值，當(dāng)日上午B超監(jiān)測未排卵，當(dāng)日上午注射hCG10 000 U，當(dāng)日下午行AIH。

③ 精液優(yōu)化：密度梯度離心法優(yōu)化精液，處理后精子重懸于0.3～0.5 mL G-VIF中備用。

④ IUI：人工授精管接注射器，吸取經(jīng)洗滌優(yōu)化處理的精液0.3～0.5 mL，超聲引導(dǎo)下通過宮頸將人工授精導(dǎo)管插入宮腔，緩慢將精液推注宮腔。

⑤ 術(shù)后監(jiān)測及處理：術(shù)后14～16 d，行尿妊娠試驗檢查或測血hCG水平。陽性者在術(shù)后30～35 d行B超檢查受孕情況。黃體功能不足者行黃體支持。

⑥ 隨訪時間：人工授精術(shù)后14～16 d、術(shù)后30～35 d、術(shù)后50 d、孕12周、分娩后。

1.2.2 精子DFI檢測(SCD法) 收集患者首次IUI術(shù)前3個月內(nèi)的精子DFI數(shù)據(jù)。精子DFI均采用染色質(zhì)擴(kuò)散法(SCD法)檢測，試劑盒為深圳華康精子核DNA完整性檢測試劑盒(SCD法)，主要步驟包括：制片、變性、裂解、脫水、染色、閱片等。于1 000×油鏡下分別計數(shù)大暈環(huán)、中暈環(huán)、小暈環(huán)、無暈環(huán)精子數(shù)，總數(shù)不少于400條。精子DFI=(小暈環(huán)精子數(shù)+無暈環(huán)精子數(shù))/計數(shù)精子總數(shù)×100%。

1.3 評價指標(biāo)

1.3.1 比較DFI<30%組與DFI≥30%組患者的臨床資料 包括男女方年齡、不孕年限、不孕因素、原發(fā)/繼發(fā)不孕、女方BMI、流產(chǎn)史、自然/促排卵周期、處理后PR總數(shù)等指標(biāo)。

1.3.2 比較DFI<30%組與DFI≥30%組患者的IUI臨床結(jié)局 包括臨床妊娠率、生化妊娠率、自然流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、新生兒體重、新生兒身長等指標(biāo)。

1.3.3 比較妊娠組與未妊娠組、活產(chǎn)組與未活產(chǎn)組患者的精子DFI。

1.3.4 ROC曲線分析精子DFI對IUI妊娠、活產(chǎn)的預(yù)測價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床資料比較

兩組患者男方年齡、女方年齡、女方BMI、不孕年限、不孕因素、原發(fā)性不育/繼發(fā)性不育、流產(chǎn)史、自然/促排卵周期、處理后PR精子總數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 精子DFI對IUI臨床結(jié)局的影響

兩組臨床妊娠率、自然流產(chǎn)率、活產(chǎn)率、出生體重、出生身長比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。DFI<30%組生化妊娠7例、異位妊娠1例、早產(chǎn)3例、出生缺陷0例，DFI≥30%組生化妊娠0例、異位妊娠0例、早產(chǎn)0例、出生缺陷1例，樣本量太少，未進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，詳見表2。

表2 精子DFI對IUI臨床結(jié)局的影響

2.3 妊娠組、活產(chǎn)組精子DFI分析

妊娠組與未妊娠組精子DFI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；町a(chǎn)組與未活產(chǎn)組精子DFI比較，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表3 妊娠、活產(chǎn)組精子DFI分析

2.4 精子DFI對IUI臨床結(jié)局的預(yù)測價值分析

通過ROC曲線分析精子DFI對IUI臨床結(jié)局的預(yù)測價值，結(jié)果顯示精子DFI不能預(yù)測IUI臨床妊娠(AUC=0.521，P=0.611，95%CI：0.439-0.603)或活產(chǎn)(AUC=0.502，P=0.985，95%CI：0.331-0.673)，詳見下頁圖1。

A：精子DFI預(yù)測IUI臨床妊娠；B：精子DFI預(yù)測IUI活產(chǎn)

3 討論

精子DNA碎片發(fā)生于精子發(fā)生和成熟的過程中[4]。受體內(nèi)、外界多種因素的影響，精子細(xì)胞染色體和DNA完整性受損，導(dǎo)致DNA片段化。目前已知導(dǎo)致精子DNA損傷的主要因素有3個：精子染色質(zhì)組裝異常、精子細(xì)胞異常凋亡和過度氧化應(yīng)激[4]。精子DNA損傷影響精子受精能力及胚胎發(fā)育潛能，已知高精子DFI男性生育力下降及伴侶自然流產(chǎn)率明顯升高[5]。目前，精子DFI在預(yù)測IUI臨床結(jié)局的意義仍不明確，文獻(xiàn)報道存在較大差異；可能與低質(zhì)量的證據(jù)有關(guān)，包括有缺陷的研究設(shè)計、有限的研究規(guī)?；驖撛诘幕祀s因素等。

關(guān)于精子DFI與IUI臨床結(jié)局關(guān)聯(lián)的報道較少，其中大部分研究認(rèn)為精子DFI對IUI臨床結(jié)局沒有顯著影響。Yang H等[6]對1 185個IUI周期進(jìn)行回顧分析，結(jié)果顯示DFI>30%、15%30%三組的IUI臨床妊娠率、流產(chǎn)率、活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Siddhartha N等[8]對105例行IUI治療的不育男性進(jìn)行DFI檢測，結(jié)果顯示DFI≥20%與DFI<20%組IUI臨床妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Muriel L等[9]對100個IUI周期進(jìn)行研究，未發(fā)現(xiàn)精子DFI與IUI臨床妊娠率之間的相關(guān)性。Vandekerckhove FW等[10]對25例不明原因不育男性精子DFI進(jìn)行分析，結(jié)果顯示精子DFI不能預(yù)測首次IUI的臨床妊娠率及活產(chǎn)率。相反，少部分研究認(rèn)為精子DFI對IUI臨床結(jié)局有顯著影響。Bungum M等[11]對387個IUI周期的研究顯示DFI> 30%組的生化妊娠、臨床妊娠和活產(chǎn)顯著低于DFI≤30%的夫婦。曹曉敏等[12]對88個IUI周期的研究顯示未妊娠組精子DFI顯著升高。楊曉玉等[13]對428個IUI周期的研究顯示DFI>25%的患者IUI妊娠率明顯低于DFI≤25%的患者。本研究結(jié)果顯示，DFI≥30%組與DFI<30%組臨床妊娠率、自然流產(chǎn)率、活產(chǎn)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與相關(guān)文獻(xiàn)[6-10]報道一致，但與部分文獻(xiàn)[11-13]存在差異?？赡茉驗榛祀s因素的影響、精子DFI檢測方法的差異、單次IUI結(jié)局與累計結(jié)局的差異以及樣本量的影響。以上多數(shù)報道存在較多混雜因素，如女方因素、女方年齡、處理后PR總數(shù)等，本研究中兩組的一般資料具有可比性，減少了部分混雜因素的影響。本研究采用SCD法檢測精子DFI，而文獻(xiàn)主要采用SCSA法[6-7,11,13]、部分采用SCD法[9-10,12]、TUNEL法[8]，及在各個實驗室的檢測流程均可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏倚[14]，影響統(tǒng)計結(jié)果。絕大多數(shù)研究[6,8,11,13]統(tǒng)計了入組患者的多個周期的累計妊娠及流產(chǎn)情況，而本研究僅對首次IUI結(jié)局進(jìn)行統(tǒng)計，減少周期累計變量導(dǎo)致結(jié)局改善的影響，相關(guān)文獻(xiàn)也統(tǒng)計了首次IUI結(jié)局，研究結(jié)果與本研究類似[7,10]。

本研究中DFI≥30%組與DFI<30%組出生嬰兒體重、身長比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。劉玉林等[15]對4 080個IVF/ICSI周期分娩結(jié)局的研究顯示，精子DFI升高可導(dǎo)致IVF/ICSI優(yōu)胚率降低，但不影響新鮮周期的早產(chǎn)率、新生兒體重以及出生缺陷率。Bungum M等[16]對131例IVF/ICSI出生子代的健康與發(fā)育進(jìn)行分析，結(jié)果顯示高精子DFI對新生兒體重、孕周沒有明顯影響。以往認(rèn)為IUI是輔助生殖技術(shù)中最接近于自然妊娠的一種手段，因此對IUI后代健康及發(fā)育的跟蹤隨訪較少，幾乎未見精子DFI對IUI子代影響的報道，結(jié)合以上兩篇IVF/ICSI的報道及本研究的結(jié)果，預(yù)測精子DFI對IUI新生兒體重、新生兒身長應(yīng)無明顯影響，未來應(yīng)加大樣本量進(jìn)行研究驗證。本研究還發(fā)現(xiàn)DFI<30%組異位妊娠1例、早產(chǎn)3例、出生缺陷0例，DFI≥30%組異位妊娠0例、早產(chǎn)0例、出生缺陷1例，但由于樣本量太少，數(shù)據(jù)未能進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，因此對于異位妊娠、早產(chǎn)、出生缺陷的比較還需更大樣本量的研究。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)精子DFI≥30%對IUI臨床結(jié)局沒有顯著影響，可能原因為密度梯度離心可剔除部分高DFI精子，顯著降低處理后精液中的DFI，從而降低DFI差異對IUI結(jié)局的影響。此外，本研究分別對妊娠組/未妊娠組、活產(chǎn)組/未活產(chǎn)組的精子DFI進(jìn)行比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也提示IUI妊娠及活產(chǎn)與精子DFI無明顯關(guān)聯(lián)；ROC曲線顯示精子DFI不能預(yù)測臨床妊娠及活產(chǎn)。

本研究存在以下優(yōu)勢，即僅對首次IUI周期臨床結(jié)局進(jìn)行分析，排除累計妊娠結(jié)局對統(tǒng)計的影響。此外，還對活產(chǎn)率、胎兒體重身長等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計，從分娩數(shù)據(jù)分析DFI對IUI結(jié)局的影響。SCSA法雖然是檢測精子DFI的金標(biāo)準(zhǔn)，但仍存在局限性，如目標(biāo)細(xì)胞群的選擇、門的設(shè)置及結(jié)果計算仍存在一些爭議[15]，而SCD法結(jié)果評估直觀簡單，雖然存在主觀性，但在質(zhì)控充分的基礎(chǔ)上也可保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。然而，本研究的不足主要為樣本量偏少可能影響統(tǒng)計結(jié)果，尤其是流產(chǎn)、活產(chǎn)的統(tǒng)計結(jié)果，樣本量少也使得異位妊娠、早產(chǎn)、先天畸形等指標(biāo)無法統(tǒng)計。盡管本研究中高DFI與低DFI組的一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但并未細(xì)分混雜因素，例如男方因素、女方因素的具體病因以及促排卵方案的具體策略等。

綜上所述，本研究證實了高精子DFI對IUI臨床妊娠、自然流產(chǎn)、活產(chǎn)及部分新生兒指標(biāo)無明顯影響。未來將對更多的IUI周期數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，包括單次周期及重復(fù)周期，分別探討DFI對首次IUI結(jié)局及累計IUI結(jié)局的影響。此外，術(shù)前3個月內(nèi)的DFI數(shù)據(jù)難以反映IUI手術(shù)時的DFI，未來將考慮分析IUI前后的DFI與妊娠結(jié)局的關(guān)聯(lián)，通過增加樣本量深入研究精子DFI預(yù)測IUI臨床分娩結(jié)局的價值及可能的截取值。