王丙蓮，馬耀宏，公維麗，楊艷，鄭嵐，劉慶艾，孟慶軍

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 山東省科學(xué)院生物研究所，山東 濟(jì)南 250103)

乙醇質(zhì)量濃度是檢驗(yàn)果汁質(zhì)量的重要指標(biāo)，目前國(guó)內(nèi)主要采用國(guó)標(biāo)法測(cè)定，即重鉻酸鉀氧化-硫酸亞鐵銨滴定法[1]。該方法耗時(shí)較長(zhǎng)、操作復(fù)雜、條件難控制，所以在實(shí)際應(yīng)用中存在一定弊端。對(duì)于乙醇質(zhì)量濃度的檢測(cè)還有很多其他方法，如蒸餾法、分光光度法、氣相色譜法(gas chromatography, GC)[2]、氣質(zhì)聯(lián)用法(gas chromatograohy-mass spectrometry ,GCMS)[3]、光譜分析法[4]、生物傳感器法[5]等，其中傳統(tǒng)的蒸餾法、分光光度法測(cè)定精確度低，測(cè)定誤差大；GC法、GCMS法、光譜分析法等所需設(shè)備昂貴、對(duì)操作人員要求高、耗時(shí)長(zhǎng)，不適于實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。生物傳感器法因其靈敏度高、操作簡(jiǎn)單，近年來(lái)發(fā)展較快，主要是固定化乙醇氧化酶或乙醇脫氫酶，制成酶電極生物傳感器[6-7]，通過(guò)其電化學(xué)性能變化達(dá)到乙醇檢測(cè)的目的。因?yàn)槊复呋磻?yīng)專一性較強(qiáng)，所以酶電極生物傳感器用于底物質(zhì)量濃度測(cè)定時(shí)，專一性亦較強(qiáng)。但果汁成分復(fù)雜，不僅含糖類、脂類、烴類、金屬元素，還含電化學(xué)活性物質(zhì)，如維生素C、過(guò)氧化氫酶等。這些物質(zhì)能夠誘導(dǎo)底物反應(yīng)之外的氧化還原反應(yīng)及電子轉(zhuǎn)移[8-9]，從而導(dǎo)致反應(yīng)系統(tǒng)出現(xiàn)與待測(cè)底物無(wú)關(guān)的電信號(hào)干擾，引起電極信號(hào)檢測(cè)的誤差，所以乙醇酶電極生物傳感器直接用于果汁乙醇測(cè)定時(shí)，受電活性干擾物影響較大。本文構(gòu)建了一種新型不受氧化還原性干擾物影響的乙醇電極檢測(cè)系統(tǒng)，并與GC法、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)法進(jìn)行了對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高、抗干擾性強(qiáng)；回收率、重現(xiàn)性好,更適合低成本要求的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

乙醇氧化酶(Sigma公司進(jìn)口分裝，250U)；氧化石墨烯(實(shí)驗(yàn)室自制)；牛血清蛋白(阿拉丁試劑有限公司)；殼聚糖(阿拉丁試劑有限公司)；甘油、戊二醛(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%)，所有化學(xué)試劑均為分析純。

SBA-40E型生物反應(yīng)系統(tǒng)(山東省科學(xué)院生物研究所)；5804R型低速冷凍離心機(jī)(德國(guó)艾本德公司)；IKA VORTEX 3型漩渦混勻器(德國(guó)艾卡公司)；UC型超聲波精密噴涂設(shè)備(東方金榮超聲電氣有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基礎(chǔ)電極探頭的制備及處理

根據(jù)文獻(xiàn)[10]將鉑絲、銀片、熱敏電阻、屏蔽電阻等集成一體，制備基礎(chǔ)電極探頭。晾干后，在電極探頭超聲霧化滴涂包覆納米氧化石墨烯層，后室溫真空干燥，得到石墨烯均勻修飾的基礎(chǔ)電極探頭，晾干備用。

1.2.2 工作酶電極的制備

將制備的基礎(chǔ)電極探頭置于超凈臺(tái)，按本實(shí)驗(yàn)室酶固定化技術(shù)，將5 U乙醇氧化酶、血清蛋白、甘油、戊二醛進(jìn)行有序混合，混合液均勻涂布于基礎(chǔ)電極探頭表面，室溫固化干燥，乙醇氧化酶經(jīng)戊二醛交聯(lián)劑固定于基礎(chǔ)電極探頭表面。取質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%殼聚糖水凝膠溶液，滴涂在乙醇氧化酶固定化的電極表面，冷凍干燥，制成乙醇工作酶電極。

1.2.3 輔助酶電極的制備

另取一支基礎(chǔ)電極探頭，將乙醇氧化酶在80 ℃下加熱滅活，將滅活的乙醇氧化酶按照步驟1.2.2固定于基礎(chǔ)電極表面，制得乙醇輔助酶電極。

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 抗干擾性能檢測(cè)

將工作酶電極、輔助酶電極作為電極系統(tǒng)，同時(shí)安裝于SBA-40E生物反應(yīng)系統(tǒng)，啟動(dòng)儀器，運(yùn)行系統(tǒng)檢測(cè)程序。以1 %亞鐵氰化鉀(K4Fe(CN)6)作為抗干擾性能檢測(cè)的基礎(chǔ)物質(zhì)，準(zhǔn)確進(jìn)樣25 μL，反應(yīng)20 s。記錄各電極相對(duì)電信號(hào)，其中輔助酶電極相對(duì)電信號(hào)記為A0、工作酶電極相對(duì)電信號(hào)記為A1，連續(xù)測(cè)定3次。計(jì)算并比較連續(xù)測(cè)定時(shí)A1/A0，根據(jù)A1/A0變化值Δ(A1/A0)，判斷整套系統(tǒng)的抗干擾性能。

1.3.2 抗干擾系數(shù)計(jì)算

通常，欠缺結(jié)婚形式要件的法律后果是婚姻不成立，而不是婚姻無(wú)效。中俄婚姻法都持此見(jiàn)解，故在婚姻無(wú)效的事由中并無(wú)欠缺形式要件這一項(xiàng)。

1.3.3 系統(tǒng)定標(biāo)

再次提示進(jìn)樣時(shí)，準(zhǔn)確吸取1 mg/mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)液，注射入反應(yīng)池，分別記錄工作酶電極和輔助酶電極電信號(hào)值，按照公式(1)計(jì)算工作酶電極酶活性I，按照公式(2)計(jì)算第n次和第n+1次測(cè)定的工作酶電極酶活性差值ΔI，n為大于等于1的正整數(shù)。

(1)

ΔI=I(n+1)-In

(2)

1.3.4 樣品測(cè)定

當(dāng)系統(tǒng)定標(biāo)通過(guò)后，運(yùn)行樣品檢測(cè)程序。儀器提示進(jìn)樣時(shí)，準(zhǔn)確吸取25 μL果汁樣品注入反應(yīng)池，按照公式(3)計(jì)算果汁中乙醇的質(zhì)量濃度：

(3)

2 結(jié)果與討論

2.1 抗干擾性能檢測(cè)結(jié)果

K4Fe(CN)6是電化學(xué)實(shí)驗(yàn)中常被用于研判電極表面的電子活性的氧化還原反應(yīng)標(biāo)記物，此處用作基礎(chǔ)電化學(xué)活性物質(zhì)，檢測(cè)電極系統(tǒng)抗干擾性能的穩(wěn)定性。根據(jù)步驟1.3.1，得到表1。結(jié)果表明，連續(xù)測(cè)定3次，A1/A0值保持穩(wěn)定，變化率(Δ(A1/A0))<1%，即重復(fù)測(cè)定誤差<1%，整套系統(tǒng)抗干擾性能穩(wěn)定，可用于進(jìn)一步測(cè)定。

表1 抗干擾性能參數(shù)Table 1 Anti-interference parameters

2.2 抗干擾系數(shù)的確定

(4)

2.3 系統(tǒng)定標(biāo)結(jié)果

以1 mg/ mL乙醇溶液為標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)操作步驟1.3.3，記錄工作酶電極和輔助酶電極相對(duì)電信號(hào)值，并計(jì)算各酶電極酶活性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 系統(tǒng)定標(biāo)數(shù)據(jù)Table 2 System calibration data

由表2求得乙醇質(zhì)量濃度計(jì)算公式：

(5)

表2表明，底物單一的情況下，輔助酶電極的信號(hào)增減情況與工作酶電極一致，且其變化更為劇烈。但兩者協(xié)同工作時(shí)，工作酶電極的酶活能夠快速穩(wěn)定下來(lái)，連續(xù)測(cè)定2次，酶活變化率為0.92%，系統(tǒng)達(dá)到定標(biāo)通過(guò)狀態(tài)。分析其原因，可能輔助酶電極不僅能消除人為進(jìn)樣的誤差，而且能夠靈敏檢測(cè)系統(tǒng)的信號(hào)波動(dòng)，通過(guò)其與工作酶電極的協(xié)同比對(duì)，消除不平穩(wěn)的系統(tǒng)信號(hào)，使電極系統(tǒng)更快穩(wěn)定下來(lái)。

2.4 樣品測(cè)定穩(wěn)定性檢驗(yàn)

根據(jù)操作步驟1.3.4，系統(tǒng)提示進(jìn)樣時(shí)，準(zhǔn)確進(jìn)樣稀釋為原質(zhì)量濃度1/20的乙醇樣品25 μL，測(cè)定其中乙醇質(zhì)量濃度，每個(gè)測(cè)定重復(fù)5次。依據(jù)2.3實(shí)驗(yàn)得到的乙醇質(zhì)量濃度計(jì)算公式(5)，求得乙醇質(zhì)量濃度，見(jiàn)表3。

表3 果汁中乙醇質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination of ethanol concentration in juices

由表3可知，工作酶電極電信號(hào)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.18 %，輔助酶電極電信號(hào)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為31.82%，但工作酶電極與輔助酶電極協(xié)同作用時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.80 %，表明通過(guò)引入輔助酶電極及系統(tǒng)抗干擾系數(shù)K(0.895)，進(jìn)一步提高了檢測(cè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和重復(fù)性，排除電極信號(hào)本身不穩(wěn)定對(duì)乙醇測(cè)定的干擾，達(dá)到準(zhǔn)確、穩(wěn)定測(cè)定的目的。

2.5 回收率檢驗(yàn)

取市售果汁樣品，3 000 r/min離心5 min，上清液分成等體積的兩份。一份加入等體積、質(zhì)量濃度為10 mg/mL的乙醇溶液，制成加標(biāo)樣品。另一份加入等體積蒸餾水作為對(duì)照樣品。加標(biāo)樣品和對(duì)照樣品均稀釋10倍，后依據(jù)步驟1.3.4和2.3分別測(cè)定并計(jì)算加標(biāo)樣品和對(duì)照樣品中乙醇質(zhì)量濃度，每個(gè)測(cè)定重復(fù)4次。結(jié)果表明(表4)，該方法測(cè)定果汁中乙醇質(zhì)量濃度的回收率為99.10%～101.10 %，可初步認(rèn)為測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

表4 乙醇檢測(cè)系統(tǒng)的回收率實(shí)驗(yàn)Table 4 Recovery test of ethanol detection system

2.6 抗干擾性檢驗(yàn)

果汁成分復(fù)雜，含有較多干擾物，如維生素、果酸、葡萄糖、蔗糖，少量脂類、芳香烴、過(guò)氧化氫酶，以及鈣、鐵等元素。1 mg/mL乙醇溶液中分別加入維生素C、葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Ca2+、過(guò)氧化氫酶等物質(zhì)，調(diào)整干擾物濃度為2 mg/mL，其中，過(guò)氧化氫酶活性單位為0.01 U/mL。乙醇檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定乙醇質(zhì)量濃度，驗(yàn)證這些物質(zhì)對(duì)乙醇測(cè)定的影響。結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、Ca2+對(duì)乙醇測(cè)定沒(méi)有明顯影響。維生素C存在時(shí)，工作酶電極、輔助酶電極電信號(hào)均出現(xiàn)大幅上漲，但經(jīng)計(jì)算所得乙醇質(zhì)量濃度跟其實(shí)際值相較無(wú)明顯區(qū)別。這是因?yàn)榫S生素C具有較強(qiáng)的還原性，是一種靈敏的電化學(xué)活性物質(zhì)，能夠在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，引起電極電信號(hào)的明顯增強(qiáng)，但輔助酶電極的協(xié)同作用和比較，恰好消除了這一類非乙醇底物參與產(chǎn)生的電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)維生素C的抗干擾目的。過(guò)氧化氫酶存在時(shí)，工作酶電極與輔助酶電極的電信號(hào)則均大大低于其他實(shí)驗(yàn)組，最終計(jì)算得乙醇質(zhì)量濃度值也與實(shí)際值相一致。分析其原因可能是，乙醇底物反應(yīng)產(chǎn)生的部分過(guò)氧化氫被過(guò)氧化氫酶催化[11]，故工作酶電極、輔助酶電極所能采集到電信號(hào)均降低，輔助酶電極的協(xié)同作用，消除了因過(guò)氧化氫產(chǎn)物減少引起的信號(hào)誤差，實(shí)現(xiàn)了過(guò)氧化氫酶存在情況下的乙醇準(zhǔn)確測(cè)定。因此，輔助酶電極的存在，能夠有效消除果汁中常見(jiàn)干擾物對(duì)乙醇檢測(cè)的影響，達(dá)到乙醇準(zhǔn)確測(cè)定的目的。

2.7 與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、GC法對(duì)比實(shí)驗(yàn)

取兩種市售果汁，分別記為1#、2#，離心稀釋，并分別用本實(shí)驗(yàn)方法、GC法、國(guó)標(biāo)方法測(cè)定乙醇質(zhì)量濃度，重復(fù)4次。T檢驗(yàn)比較三種方法的差異顯著性(表5)。由表5可知，利用生物傳感器法測(cè)定果汁乙醇質(zhì)量濃度時(shí)，與GC法相比較，測(cè)定結(jié)果低，但是差異不明顯(P>0.05)?？梢哉J(rèn)為，工作酶電極和輔助酶電極協(xié)同工作，用于測(cè)定成分復(fù)雜的果汁中乙醇質(zhì)量濃度時(shí)，準(zhǔn)確度較高。

表5 乙醇檢測(cè)系統(tǒng)與國(guó)標(biāo)法、GC法對(duì)比實(shí)驗(yàn)Table 5 Comparison of ethanol detection system with national standard method and GC

3 結(jié)論

本文構(gòu)建了一種新型的乙醇檢測(cè)系統(tǒng)，將工作酶電極和輔助酶電極協(xié)同作用，建立了乙醇抗干擾測(cè)定方法。該方法對(duì)果汁中常見(jiàn)干擾物質(zhì)，諸如糖類、金屬離子、檸檬酸的抗干擾能力強(qiáng)。此外，輔助酶電極的存在，不僅能消除電化學(xué)活性物質(zhì)對(duì)電信號(hào)的干擾，實(shí)現(xiàn)對(duì)乙醇的抗干擾測(cè)定，而且能消除底物中的氧化還原酶對(duì)測(cè)定的影響。鑒于以上抗干擾性能，該方法不僅能用于果汁中乙醇的測(cè)定，還可廣泛應(yīng)用于其他相關(guān)行業(yè)(如啤酒、果味酒、飲料、調(diào)味品等生產(chǎn)中的乙醇測(cè)定)發(fā)酵過(guò)程中乙醇的含量控制，以及血清、血漿中的乙醇測(cè)定。因此，該方法在食品行業(yè)、發(fā)酵行業(yè)，甚至血液制品行業(yè)均有廣闊的應(yīng)用前景。此外，該方法操作簡(jiǎn)單、成本低廉且準(zhǔn)確度高，能夠滿足低成本要求的實(shí)際生產(chǎn)要求，有望代替國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或GC法成為乙醇測(cè)定的主要手段，對(duì)于提高相關(guān)領(lǐng)域的生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本具有重要意義。