鄧志鵬，李靜，趙盼，宋佳

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

楊芽黃素(tectochrysin)為黃酮類化合物，主要來源于姜科多年生植物益智(AlpiniaoxyphyllaMiq.)的干燥成熟果實[1-2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，楊芽黃素具有抗炎、抗氧化、抗心腦血管疾病等作用[3-6]。近年來的研究表明楊芽黃素對前列腺癌、非小細胞肺癌、結(jié)腸癌等細胞均產(chǎn)生抗腫瘤活性[7-9]。Zhao等[10]用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)法對大鼠灌胃給予益智仁后的楊芽黃素和白楊素進行了比較藥代動力學研究，但該單體給藥后的藥代動力學性質(zhì)至今仍不清楚。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)，對Wistar大鼠單次灌胃低、中、高劑量(5、10、20 mg/kg)楊芽黃素后，檢測大鼠血漿中楊芽黃素量,結(jié)果對闡明楊芽黃素在體內(nèi)的藥動學特征以及臨床前試驗設(shè)計具有重要意義。

1 儀器與材料

1.1 實驗儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀串聯(lián)TSQ Quantum Access Max型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific)配備電噴霧離子源；Xcalibur 2.1軟件系統(tǒng)(美國Thermo Scientific)；PX85ZH型分析天平(美國Ohaus)；Synergy UV-R超純水儀(法國Millipore)；5427R型高速離心機(德國Eppendorf)；MTV-1型旋渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司)；WD-12氮吹儀(杭州奧盛儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑

楊芽黃素對照品(批號wkq18042810，純度99.99%)和內(nèi)標物質(zhì)珊瑚菜內(nèi)酯(批號wkq17101106，純度99.83%)均購自四川省維克奇生物科技有限公司(成都，中國)。色譜純甲醇和乙腈(美國Tedia)、色譜純甲酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司。

1.3 實驗動物

15只健康雄性Wistar大鼠，體重(200±20) g，濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，使用許可證號:SCXK(魯)2019 0003。常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，1周后給藥，試驗前禁食12 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 儲備液配制

平行精密稱取2份5.00 mg楊芽黃素對照品，經(jīng)精密稱定后用色譜甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度均為500 μg/mL楊芽黃素標準曲線儲備液及質(zhì)控儲備液。依次量取適量標準曲線儲備液，用色譜甲醇進行逐級稀釋，得到質(zhì)量濃度為5、10、50、100、250、1 000和2 000 ng/mL標準曲線系列工作溶液。取適量質(zhì)控儲備液用色譜甲醇進行稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為15、150和1 800 ng/mL的質(zhì)控系列工作溶液。實際樣品測定按上述方法稱量及稀釋，進行配制相應(yīng)溶液。

2.2 標準曲線和質(zhì)控樣品配制

精密量取4.5 mL空白大鼠血漿，分別加入0.5 mL標準曲線系列工作溶液，使其血漿中楊芽黃素濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0 、200.0 ng/mL。精密量取4.5 mL空白大鼠血漿，分別加入0.5 mL質(zhì)控系列工作溶液，得到血漿濃度分別為1.5、15.0、180.0 ng/mL的高、中、低濃度質(zhì)控樣品。

2.3 內(nèi)標溶液配制

精密稱取珊瑚菜內(nèi)酯對照品約2.00 mg，經(jīng)精密稱定后用色譜甲醇溶解得到濃度為200 μg/mL內(nèi)標儲備液。取該儲備液適量，用色譜甲醇進行稀釋，得到濃度為20 ng/mL內(nèi)標工作溶液。

以上所有儲備液、標準曲線和質(zhì)控樣品及內(nèi)標溶液均用經(jīng)過校正的量瓶配制，放置于4 ℃冰箱內(nèi)避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 色譜和質(zhì)譜條件

質(zhì)譜條件:采用電噴霧電離源(ESI)，毛細管溫度為300 ℃，離子源噴射電壓為 3.0 kV;正離子方式檢測;選擇性反應(yīng)監(jiān)測(SRM)掃描;氮氣用于鞘氣和輔助氣，流速分別為35 Arb(1 Arb=0.33 L/min)和20 Arb; 駐留時間設(shè)置為200 ms。 LC-MS采用選擇反應(yīng)監(jiān)測模式，用于定量分析的離子對分別為:楊芽黃素m/z268.8→225.9(碰撞能量(CE)為25 eV)和珊瑚菜內(nèi)酯m/z300.9→233.0 (CE為25 eV)。楊芽黃素和珊瑚菜內(nèi)酯產(chǎn)物離子全掃描質(zhì)譜圖見圖1，推測質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖1 二級質(zhì)譜圖Fig.1 MS/MS mass spectra

圖2 楊芽黃素和內(nèi)標物質(zhì)珊瑚菜內(nèi)酯的化學結(jié)構(gòu)及推測質(zhì)譜裂解途徑Fig.2 Chemical structures and proposed fragmentation pathways of tectochrysin and phellopterin

2.5 樣本處理

從-20 ℃冰箱取出血漿樣本，自然解凍，精密吸取50 μL，加入50 μL色譜乙腈(含內(nèi)標珊瑚菜內(nèi)酯20 ng/mL)，渦旋混勻后，加入1.5 mL乙酸乙酯，振蕩5 min，經(jīng)11 000 r/min高速離心10 min后吸上清液至干凈試管中，經(jīng)濃縮儀40 ℃氮氣吹干，再加入200 μL流動相復(fù)溶殘渣后過經(jīng)0. 22 μm濾膜，精密吸取5 μL樣品進行進樣檢測。

2.6 方法學研究

2.6.1 專屬性

取空白血漿50 μL，加入150 μL純乙腈，按2.5項下方法操作，得空白樣品色譜圖(圖3(a))。分別取標準曲線最低定量限(LLOQ)和最高定量限(ULOQ)樣品50 μL，按2.2項下方法操作，得含內(nèi)標的色譜圖(圖3(b)和3(c))。取給藥后0.5 h的血漿樣品50 μL，按2.5項下方法操作，得血漿樣品質(zhì)譜圖(圖3(d))。楊芽黃素和內(nèi)標的保留時間分別為3.1 min和2.7 min，內(nèi)源性物質(zhì)和內(nèi)標均不干擾待測物的精確定量分析。

圖3 典型SRM色譜圖Fig.3 Representative SRM chromatograms

2.6.2 標準曲線和定量下限

按照2.5項下方法制備標準曲線樣品，記錄楊芽黃素和內(nèi)標色譜峰面積，以待測物楊芽黃素和內(nèi)標峰面積比值為縱坐標y，楊芽黃素的血漿濃度為橫坐標x，權(quán)重系數(shù)為1/X2，進行線性回歸。楊芽黃素血藥質(zhì)量濃度為0.5～200.0 ng/mL，標準曲線方程為:y=0.066 85x+0.008 950,r2=0.996 9，線性關(guān)系良好，滿足分析要求，最低定量限為0.5 ng/mL。

2.6.3 精密度與準確度

按2.2項下方法操作分別配制的高、中、低濃度楊芽黃素質(zhì)控樣品(180.0、15.0、1.5 ng/mL)，每個濃度做5個樣本分析。連續(xù)測定3個分析批次，計算該方法的日內(nèi)和日間精密度和準確度，其中精密度用相對標準偏差δRSD進行衡量，準確度用相對誤差(ER)進行評價，結(jié)果見表1。結(jié)果表明楊芽黃素的日內(nèi)、日間精密度和準確度均符合《生物樣品定量分析方法驗證指導(dǎo)原則》[11]。

表1 大鼠血漿中QC 樣品的精密度和準確度(n=5)Table 1 Precision and accuracy of QC samples in evaluating tectochrysin in rat plasma (n=5)

2.6.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取6個不同來源的大鼠空白血漿50 μL，按照2.5項下方法取上層清液，分別加入高、中、低濃度(180.0、15.0、1.5 ng/mL)的楊芽黃素工作液及內(nèi)標混合工作液，進樣2 μL，記錄楊芽黃素及內(nèi)標峰的面積(A)；用水代替大鼠空白血漿，取上層清液，分別加入相當于高、中、低濃度(180.0、15.0、1.5 ng/mL )楊芽黃素工作液及內(nèi)標混合工作液，進樣2 μL，記錄相應(yīng)樣本的楊芽黃素峰及內(nèi)標峰的面積(B)；取低、中、高 3 個濃度質(zhì)控樣品按2.5項下操作，每一濃度進行6樣本分析得峰面積(C)。由A/B×100%分別計算楊芽黃素和內(nèi)標的基質(zhì)效應(yīng)，由(C/A)×100% 分別計算楊芽黃素和內(nèi)標的提取回收率，見表2。結(jié)果顯示基質(zhì)效應(yīng)值均在85%～115%之間，滿足分析要求。

表2 LC-MS/MS 法測定空白血漿中楊芽黃素的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng) (n=6)Table 2 Determination of the recovery rate and ME of tectochrysin in rat plasma using LC-MS/MS (n=6)

2.6.5 穩(wěn)定性考察

按2.2項下方法操作制備成濃度分別為180.0、15.0、1.5 ng/mL高、中、低濃度質(zhì)控穩(wěn)定性考察樣品(n=6)。所有樣品分別經(jīng)室溫放置8 h、-20 ℃長期冷凍30 d后、反復(fù)凍融3次和進樣室放置6 h后楊芽黃素濃度ER值在-13.80%～8.44%(表3)，表明楊芽黃素的大鼠血漿樣品在上述條件下放置后保持穩(wěn)定。

表3 不同條件下大鼠血漿中楊芽黃素的穩(wěn)定性結(jié)果(n=5)Table 3 Results of the stability of tectochrysin in rat plasma under different conditions (n=5) 單位：%

2.7 藥動學應(yīng)用

15只大鼠隨機分為低、中、高3個劑量組(每組5只大鼠)。所有動物禁食但可自由飲水，按照5、10、20 mg/kg給藥劑量分別灌胃給予楊芽黃素混懸液(稱取藥粉適量，加入0.5%CMC-Na溶解，分別配制成0.5、1.0、2.0 mg/mL楊芽黃素混懸液; 給藥體積10 mL/kg)，于給藥后5 min、 10 min、 20 min、 30 min和1、 2、 4、 6、 8、 12、 24 h眼眶靜脈叢采血約250 μL，置肝素鈉抗凝管中，經(jīng)4 000 r/min離心后制備血漿，置于-20 ℃中冰箱儲存，待測。將血漿樣品按照2.5項下方法處理后，再按照2.4項下色譜和質(zhì)譜條件進樣測定，記錄峰面積，繪制藥時曲線，其平均血漿濃度-時間分布如圖4所示。應(yīng)用DAS 2.1軟件，按統(tǒng)計矩原理，計算藥動學參數(shù)，給藥后的主要藥代動力學參數(shù)見表4。結(jié)果表明大鼠灌胃給藥后，楊芽黃素的吸收速度較快，達到峰值濃度的時間Tmax數(shù)值為0.30～0.37 h,最大血藥濃度值Cmax為25.4～74.5 ng/mL，而藥時曲線下面積AUC0～t值從42.6～187.1(ng/mL·h)，在給藥劑量范圍(5～20 mg/kg)，楊芽黃素的藥代動力學行為表現(xiàn)為線性藥代動力學性質(zhì)。平均消除半衰期t1/2為2.4～3.4 h，表明灌胃給藥后楊芽黃素在大鼠體內(nèi)消除速率適中，與描述楊芽黃素在大鼠體內(nèi)藥代動力學特征的先前文獻相比[10]，在本研究中獲得的楊芽黃素的藥代動力學參數(shù)普遍相似。

圖4 大鼠灌胃給藥楊芽黃素后的藥時曲線 (n=5)Fig.4 Concentration versus time curve of tectochrysin in rats after oral administration (n=5)

表4 大鼠灌胃給藥楊芽黃素后的體內(nèi)藥動學參數(shù)Table 4 Pharmacokinetic parameters of tectochrysin n=5)

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜及質(zhì)譜條件優(yōu)化

LC-MS/MS技術(shù)具備快速的方法開發(fā)和高通量分析，被公認為是提高通量、靈敏度以及具有更好色譜峰分辨率的一種檢測方法[12]。為了獲得最佳MS優(yōu)化參數(shù)，電噴霧離子化、毛細管溫度(280～350 ℃)、離子源噴射電壓(3 000～3 500 V) 和碰撞能量 (0～45 eV)，通過配制標準溶液進行研究。正離子模式檢測的電噴霧離子化顯示有更高靈敏度，并且在離子源噴射電壓為3.0 kV和碰撞能量為25 eV情況下楊芽黃素產(chǎn)生m/z225.9主要碎片離子。因此，選擇m/z268.8→225.9用于SRM模式中的LC-MS/MS進一步檢測。分析物楊芽黃素的質(zhì)譜離子化效率受流動相組成的影響。0.1%甲酸水溶液增加了楊芽黃素檢測靈敏度，乙腈作為有機相在等度洗脫下，獲得了滿意的色譜圖?？瞻籽獫{和加入分析物的血漿典型SRM色譜圖如圖3所示。結(jié)果表明，在楊芽黃素和內(nèi)標的保留時間內(nèi)未檢測到干擾峰。

3.2 樣品制備優(yōu)化

采用蛋白沉淀法和液-液萃取法對生物樣品進行預(yù)處理，結(jié)果表明蛋白沉淀法回收率低，且受生物樣品的干擾，不適合提取楊芽黃素和內(nèi)標物質(zhì)。液-液萃取的樣品純度較高，色譜峰或干擾峰中雜質(zhì)較少?；陔s質(zhì)峰數(shù)少、背景噪聲低、蒸發(fā)快的特點，作者考察了乙醚、乙酸乙酯和二氯甲烷等幾種提取溶劑，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯作為提取劑待測物峰型良好，且提取回收率高于其他溶劑。因此，生物樣品的制備最終選擇了乙酸乙酯作為提取溶劑的液-液萃取法。

3.3 方法學和藥動學方面

楊芽黃素結(jié)構(gòu)上屬于黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、抗心腦血管疾病等作用[3-6]。本文提供了一種測定大鼠血漿中楊芽黃素濃度的方法。以珊瑚菜內(nèi)酯作為內(nèi)標，其質(zhì)譜響應(yīng)模式一致和色譜保留行為接近。采用液-液萃取法預(yù)處理血漿樣本后，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)檢測，內(nèi)標法計算得到大鼠血漿中楊芽黃素濃度。建立的方法具有選擇性和靈敏度高，線性范圍寬，樣品制備簡便等特點，可用于臨床前藥代動力學研究中楊芽黃素在大鼠血漿中濃度的測定。大鼠經(jīng)灌胃給藥后，楊芽黃素在大鼠體內(nèi)吸收較快。